Biology

जैव फ्लिप चिप का प्रयोग भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के patterning

Published: October 1, 2007 doi: 10.3791/318

Nikhil Mittal^1,2, Stephanie Flavin², Joel Voldman²

¹Dept of Physics, MIT - Massachusetts Institute of Technology, ²Department of Electrical Engineering and Computer Science, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Summary

हम एक सब्सट्रेट पर वांछित स्थानों पर कोशिकाओं रखने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करता है. यह विधि एक सिलिकॉन सब्सट्रेट कोशिकाओं के साथ भरा microwells युक्त चिप flipping द्वारा कोशिकाओं के पैटर्न. इस पद्धति का एक नया करने के लिए कोशिकाओं के बीच diffusible और juxtacrine संकेतन मिलाना प्रदान करता है.

Abstract

सेल सेल diffusible संकेतन और सेल सेल संपर्क (juxtacrine संकेतन) से मिलकर बातचीत ट्यूमर के विकास, स्टेम सेल भेदभाव, और स्टेम सेल आत्म नवीकरण जैसे कई जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैं. तरीकों का एक नंबर वर्तमान में इन विट्रो में सेल संकेतन मिलाना मौजूद है. Modulating diffusible संकेतन की कुल राशि का एक तरीका संस्कृति के दौरान सेल बोने घनत्व भिन्न है. सेल बोने, वास्तविक रिक्ति सेल सेल और सेल सेल संपर्क की राशि में काफी भिन्नता में इस परिणाम, और स्थानीय पर्यावरण लिख नहीं कर सकते के यादृच्छिक प्रकृति के कारण. Modulating संकेतन सेल के लिए एक अधिक विशिष्ट दृष्टिकोण आणविक inhibitors या आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए नीचे विशिष्ट संकेत प्रोटीन दस्तक है, लेकिन इन दोनों तरीकों में से सबसे अच्छा अणुओं के छोटे संख्या से छेड़छाड़ करने के लिए अनुकूल हैं. यहाँ, हम modulating संकेतन सेल सेल है कि एक सब्सट्रेट पर वांछित स्थानों पर कोशिकाओं के विभिन्न संख्या रखकर कोशिकाओं का एक समूह के स्थानीय पर्यावरण modulates एक नया दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. यह विधि एक पूरक कोशिकाओं के बीच स्थानीय diffusible और juxtacrine संकेतन नियंत्रण प्रदान करता है. हमारे विधि जैव फ्लिप चिप (BFC) का उपयोग, एक microfabricated सिलिकॉन चिप microwells, प्रत्येक आकार के सैकड़ों हजारों युक्त या तो एक एकल कक्ष या कक्षों की छोटी संख्या पकड़ बनाता है. हम बस उन्हें कुओं की सरणी पर pipetting और सरणी बंद उतार कोशिकाओं धोने के द्वारा कोशिकाओं के साथ चिप लोड. चिप तो एक सब्सट्रेट पर रूप से फ़्लिप किया है, जिससे कोशिकाओं कुओं और सब्सट्रेट बाहर गिर, उनके patterning को बनाए रखने. बाद कोशिकाओं संलग्न है, चिप (या पर बाईं) हटाया जा सकता है. सेल patterning के लिए इस दृष्टिकोण में अद्वितीय है कि: 1) सब्सट्रेट के रसायन शास्त्र को बदल नहीं करता है किसी भी सब्सट्रेट पर इस तरह कोशिकाओं को पैदा करना और की ओर पलायन की अनुमति, 2) patterning की अनुमति देता है ऊतक संस्कृति polystyrene, कांच, matrigel सहित, और यहां तक कि सेल परतों फीडर, और 3) पारंपरिक microcontact मुद्रण के साथ संगत है, उन द्वीपों के अंदर रखा कोशिकाओं के साथ बाह्य मैट्रिक्स द्वीपों के सृजन की अनुमति है. इस वीडियो में, हम माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं ऊतक संस्कृति polystyrene पर BFC का उपयोग patterning प्रदर्शित करता है.

Protocol

एक BFC बनाना

BFCs एक 4 "सी मास्टर वफ़र पर ढलाई polydimethylsiloxane (PDMS) द्वारा किए गए हैं.

एक मास्टर वफ़र करना

30 मिनट के लिए 130 सी वेफर्स dehydrating द्वारा प्रारंभ डिग्री सेल्सियस
एक स्पिन coater पर वफ़र प्लेस, वफ़र पर SU8 - +२,०५० (Microchem) डाल, रैंप 300 rpm / एस से rpm 3000-4000, और स्पिन 30 s के लिए 40-30 मिमी की सुविधा ऊंचाइयों उपज, क्रमशः.
कताई के बाद, एक ° hotplate सी 65 पर वफ़र जगह है, तुरंत 95 के लिए तापमान डिग्री सेल्सियस 5-6 मिनट के लिए, और फिर यह 65 डिग्री सेल्सियस तक नीचे रैंप रैंप
संपर्क अंधेरे क्षेत्र एक मुखौटा का उपयोग aligner पर एक MJ 200 / ² सेमी की यूवी खुराक वेफर्स बेनकाब.
एक 65 डिग्री सेल्सियस hotplate पर वेफर्स प्लेस, तुरंत 95 के लिए तापमान रैंप ° सी 4-5 मिनट के लिए, और फिर इसे 65 डिग्री सेल्सियस तक नीचे रैंप
PM एसीटेट और Isopropanol में वेफर्स विकसित.
30 मिनट hexamethyldisiloxane (शिन Etsu MicroSi) का उपयोग कर के लिए वेफर्स Silanize, या (Tridecafluoro-1 ,1,2,2 tetrahydrooctyl) 1 trichlorosilane (t2492-के.जी., UCT विशिष्टताओं, ब्रिस्टल, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) से रोकने के PDMS सी मास्टर वफ़र के लिए पालन.

मोल्डिंग चिप्स

मिक्स PDMS (डॉव Corning, Sylgard 184) के एक 10:1 अनुपात में, यह मास्टर सी वफ़र (~ वफ़र प्रति 15 ग्राम) पर डाल, और इसे कमरे के तापमान पर रातोंरात इलाज है.
पील सी वफ़र बंद PDMS ठीक है और बाहर हर एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर चिप में कटौती.
एक आसान से निपटने के लिए 1x1 सेमी कटौती खुर्दबीन स्लाइड के लिए प्रत्येक चिप बॉण्ड.

उपयोग के लिए BFC तैयारी

पीबीएस में BFC रातोंरात भिगोएँ क्रम में PDMS में प्रयोग के दौरान मीडिया के अवशोषण को रोकने.
एक Kimwipe (Kimtech विज्ञान) के साथ चिप्स सूखी.
7.5% की एक बूंद रखो गोजातीय सीरम albumin (BSA) (~ 200 एमएल) BFC के नमूनों की सतह पर, और फिर यह एक विंदुक टिप BSA फैलाने और कुओं से किसी भी बुलबुले को हटाने के साथ परिमार्जन.
BSA BFC सतह पर कम से कम 0.5 घंटे के लिए छोड़ दें. आदर्श रूप में BSA हर 15 मिनट crusting रोकने के आंदोलन.
एक 35x10 मिमी TCPS पकवान अंदर BFC (फाल्कन, 35-3001) को फिट करने के लिए, एक TCPS डिश आधे रास्ते के rims के नीचे इतनी कटौती है कि ¾ "बांधने की मशीन क्लिप (कार्यालय डिपो) पकवान रिम पर फिट करने के लिए चिप दबाना होगा और साथ पकवान.
एक PDMS चादर से एक स्पेसर गैसकेट (20'20 मिमी बाहरी छोर, 15'15 मिमी भीतरी किनारे, और 250-500 मिमी मोटाई के साथ फ्रेम के आकार का) (सिलिकॉन विशेषता उत्पाद) या किसी अन्य सिलिकॉन कट, और यह डिश के लिए लागू चिमटी का उपयोग कर.

BFC साथ patterning कोशिकाओं

1 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत पकवान, गैस्केट, BSA - लेपित चिप, और 2 बांधने की मशीन क्लिप जीवाणुरहित.
BSA Aspirate और BFC 200 एमएल पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला.
कटौती TCPS पकवान जिलेटिन जोड़ें अगर अपने सेल लाइन के लिए आवश्यक है. अन्यथा, यह चिप (नीचे देखें) को लागू करने से पहले कुछ मीडिया के साथ TCPS सतह गीला. इस कक्ष में बनाने से बुलबुले रोकता है.
पीबीएस aspirating के बाद, विंदुक सेल समाधान के 200 एमएल (1 ~ 10 ^× 6 कोशिकाओं / एमएल) BFC सतह पर . चलो कोशिकाओं 5-10 मिनट के लिए व्यवस्थित.
~ 15 डिग्री कोण पर एक कोने BFC झुकाएँ और धीरे धीरे एक 200 एमएल विंदुक के साथ सेल समाधान बंद विंदुक. फिर, BFC फ्लैट जगह और विपरीत BFC कोने में पीबीएस या रिक्त मीडिया के 100 एमएल जोड़ें. इस तरीके से BFC एक अतिरिक्त 2-4 बार कुल्ला, के रूप में आवश्यक अंतर अच्छी तरह क्षेत्रों से सभी कोशिकाओं स्पष्ट.
पिपेट चिप की सतह पर मीडिया के 200 एमएल. TCPS से जिलेटिन / मीडिया Aspirate. फिर पूर्व - गीला पकवान पलटना और धीरे धीरे डिश में BFC अप, धक्का.
लागू एक बांधने की मशीन क्लिप प्रत्येक कक्ष के दो पक्षों इसे सील करने के लिए. बांधने की मशीन क्लिप से धातु prongs निकालें ताकि पकवान स्तर रहता है जब खत्म रूप से फ़्लिप.
अंत में, जबकि किसी भी अनावश्यक आंदोलन से परहेज पर सेटअप जल्दी फ्लिप, और यह इनक्यूबेटर में जगह.

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Discussion

हालांकि प्रोटोकॉल और वीडियो यहाँ दिखाया पैटर्न माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) BFC ^एक का उपयोग कर का वर्णन करने के लिए, BFCs व्यावहारिक रूप से ब्याज की किसी भी कोशिका प्रकार के पैटर्न के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. केवल परिवर्तन एक को बनाने की आवश्यकता हो सकती है microwells के आकार को बदलने के लिए है. हमारे अनुभव में, किसी अन्य कोशिका प्रकार, एक microwell व्यास और 10 माइक्रोन स्वाधीन सेल व्यास की तुलना में अधिक से अधिक के बराबर ऊंचाई के पैटर्न एकल कक्षों BFC का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा काम करता है.

BFCs पैटर्न कोशिकाओं को भी अन्य कक्षों सहित अन्य substrates, पर कर सकते हैं प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण बदलाव के बिना इस्तेमाल किया जा. एक मौजूदा सेल परत पर patterning के बाद mESCs और मानव ESCs सहित कुछ celltypes, समर्थन या फीडर कोशिकाओं उनकी संस्कृति में उचित phenotype बनाए रखने के लिए आवश्यकता होती है पारंपरिक सेल patterning दृष्टिकोण से अधिक BFC दृष्टिकोण का एक फायदा है.

BFC है कि हम पीछा कर रहे हैं एक आवेदन करने के लिए BFC का उपयोग करने के लिए माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के बीच संकेत जांच है. अलग ग्रिड spacings के साथ वर्ग lattices में एकल कक्षों के बीज बोने की क्रिया करके, हम दर जिस पर संकेतन अणुओं कोशिकाओं द्वारा विमर्श कर रहे हैं मिलाना. बड़ा कुओं (40 microns के एक व्यास के साथ) करके, हम भी किसी स्थान पर बड़ा (~ 2-10) संख्या कोशिकाओं जमा कर सकते हैं हैं, स्थानीय सेल घनत्व फेरबदल. इसके अलावा, हम एक दूसरे के करीब निकटता में छोटे कुओं की एक संख्या जगह है, जहां स्थानीय सेल घनत्व अधिक है द्वारा कोशिकाओं के संपर्क में नहीं हैं एक सब्सट्रेट पैटर्न में परिणाम कर सकते हैं. इस फैशन में, हम स्वतंत्र रूप से कोशिकाओं के बीच diffusible और juxtacrine संकेत न्यूनाधिक कर सकते हैं. एक ग्रिड में कोशिकाओं के बाद भी कई दिनों से अधिक कोशिकाओं को ट्रैक करना आसान बनाता है. हम मानते हैं कि BFC के साथ सेल patterning के आराम के अन्य शोधकर्ताओं ने अपने अध्ययन में उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करेंगे.

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Acknowledgments

इस काम NIH अनुदान EB007278 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin