Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip

Summary

Wir zeigen eine einfache Methode für die Platzierung Zellen an gewünschten Stellen auf einem Substrat. Diese Methode Mustern Zellen, indem ein Silikon-Chip mit Vertiefungen, die mit Zellen auf dem Substrat gefüllt. Diese Methode bietet eine neue Art und Weise zu modulieren diffusionsfähig und juxtacrine Signalisierung zwischen den Zellen.

Abstract

Zell-Zell-Interaktionen, bestehend aus diffusible Signal-und Zell-Zell-Kontakt (juxtacrine Signalisierung) werden in zahlreichen biologischen Prozessen wie Tumorwachstum, Stammzell-Differenzierung und Stammzell-Selbsterneuerung wichtig. Eine Reihe von Methoden gibt es derzeit zu modulieren Zellsignalisierung in vitro. Ein Verfahren zur Modulation der Gesamtbetrag der diffusible Signalisierung ist für die Zelle Aussaatdichte während der Kultur variieren. Durch die zufällige Natur Zellaussaat, führt dies zu erheblichen Abweichungen der tatsächlichen Zell-Zell-Abstand und Höhe der Zell-Zell-Kontakt, und können nicht vorschreiben, das lokale Umfeld. Ein Ansatz zur Modulation Zellsignalisierung ist es, molekulare Inhibitoren oder genetische Ansätze nutzen, um knock down spezifische Signalproteine, aber diese beiden Methoden sind am besten zu manipulieren kleine Anzahl von Molekülen geeignet. Hier zeigen wir einen neuen Ansatz zur Modulation von Zell-Zell-Signalisierung, dass die lokale Umgebung aus einem Cluster von Zellen, indem sie eine unterschiedliche Anzahl von Zellen an gewünschten Stellen auf einem Substrat moduliert. Diese Methode stellt eine ergänzende Möglichkeit, die lokalen diffusionsfähig und juxtacrine Signalisierung zwischen Zellen steuern. Unsere Methode nutzt die Bio Flip Chip (BFC), einem mikrostrukturierten Silikon-Chip mit Hunderten zu Tausenden von Vertiefungen, die jeweils so bemessen, dass entweder eine einzelne Zelle oder eine kleine Anzahl von Zellen zu halten. Wir laden den Chip mit Zellen einfach durch Pipettieren sie auf die Anordnung von Brunnen und waschen unbelasteten Zellen aus dem Array. Der Chip wird dann umgedreht auf ein Substrat, wobei die Zellen aus Fall der Brunnen und auf das Substrat, Erhaltung ihrer Strukturierung. Nachdem die Zellen angeschlossen haben, kann der Chip entfernt (oder links) zu unterstützen. Dieser Ansatz zur Zelle Musterung ist einzigartig, da es: 1) ändert nichts an der Chemie des Substrats, so dass Zellen sich zu vermehren und zu migrieren, 2) ermöglicht Musterung auf ein beliebiges Substrat, einschließlich Gewebe-Kultur Polystyrol, Glas, Matrigel und sogar Feeder Zellschichten, und 3) ist verträglich mit traditionellen Mikrokontaktdrucken, so dass die Schaffung von extrazellulären Matrix Inseln mit Zellen innerhalb dieser Inseln platziert. In diesem Video zeigen wir die Strukturierung von embryonalen Stammzellen der Maus auf Gewebekultur-Polystyrol mit dem BFC.

Protocol

Einen BFC

BFCS werden durch Formen Polydimethylsiloxan (PDMS) über einen 4 "Si-Wafer Meister gemacht.

Einen Master-Wafer

1. Starten Sie durch Dehydratisierung der Si-Wafer für 30 min bei 130 ° C.
2. Legen Sie die Wafer auf einem Spin-Coater, pour SU8-2050 (Microchem) auf den Wafer, Rampe von 300 rpm / s 3000-4000 Umdrehungen pro Minute und Spin für 30 s auf Funktion Höhen von 40-30 mm Ausbeute.
3. Nach dem Spinnen, statt der Wafer auf einem 65 ° C Kochplatte, sofort Rampe bis die Temperatur auf 95 ° C für 5-6 min, und dann die Rampe es auf 65 ° C.
4. Expose die Wafer mit einer UV-Dosis von 200 mJ / cm ² auf einen Kontakt Aligner mit einer Dunkelfeld-Maske.
5. Legen Sie die Scheiben auf einem 65 ° C Kochplatte, sofort Rampe bis die Temperatur auf 95 ° C für 4-5 min, und dann die Rampe es auf 65 ° C.
6. Entwickeln Sie die Wafer in PM-Acetat und Isopropanol.
7. Silanisieren die Wafer für 30 min mit Hexamethyldisiloxan (Shin-Etsu MicroSi), oder (Tridecafluor-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan (t2492-KG, UCT Spezialitäten, Bristol, PA), um PDMS verhindern Einhaltung der Si-Wafer Meister.

Molding-Chips

1. Mix PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) in einem Verhältnis von 10:1, gießen Sie sie über die Master-Si-Wafer (~ 15 g pro Wafer), und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.
2. Peel die gehärtete PDMS aus dem Si-Wafer und schneiden Sie jeden Chip mit einer Rasierklinge.
3. Bond jedem Chip eine 1x1 cm geschnitten Objektträger für einfache Handhabung.

Vorbereiten des BFC für den Einsatz

1. Weichen Sie die BFC über Nacht in PBS, um die Absorption von Medien in die PDMS verhindern während des Experiments.
2. Trocknen Sie die Chips mit einem Kimwipe (Kimtech Science).
3. Gib einen Tropfen von 7,5% Rinderserumalbumin (BSA) (~ 200 ml) auf der strukturierten Oberfläche des BFC, und dann kratzen sie mit einer Pipettenspitze auf die BSA zerstreuen und entfernen Sie alle Blasen aus dem Brunnen.
4. Verlassen Sie die BSA auf der BFC Oberfläche für mindestens 0,5 Stunden. Im Idealfall bewegen die BSA alle 15 min zu verhindern Verkrustung.
5. Zur Montage der BFC in einem 35x10 mm TCPS Schüssel (Falcon, 35 bis 3001), schneiden Sie die Felgen mit einem TCPS Gericht auf halbem Weg nach unten, so dass die ¾ "Binder Clips (Office Depot) wird über die Schale Felge passen auf den Chip Klemme und Schüssel zusammen.
6. Schneiden Sie ein spacer Dichtung (mit 20'20 mm Außenkante, 15'15 mm Innenkante und 250-500 mm Dicke Frame-förmig) aus einem PDMS Blatt (Silikon Specialty Products) oder jede andere Silikon, und es auf den Teller mit einer Pinzette.

Patterning Zellen mit einer BFC

1. Sterilisieren der Schale, Dichtung, BSA-beschichteten Chip und 2-Binder Clips unter UV-Licht für 1 Minute.
2. Saugen Sie die BSA und spülen Sie die BFC zweimal mit 200 ml PBS.
3. Add Gelatine, um den Schnitt TCPS Gericht, wenn für Ihr Handy-line erforderlich. Ansonsten benetzen TCPS Oberfläche mit einigen Medien, bevor es auf den Chip (siehe unten). Dies verhindert Blasenbildung in der Kammer.
4. Nach Absaugen der PBS, Pipette 200 ml Zell-Lösung (~ 1 × 10 ⁶ Zellen / ml) auf die BFC Oberfläche. Lassen Sie die Zellen für 5-10 min zu regeln.
5. Neigen Sie den BFC in eine Ecke zu einem ~ 15 °-Winkel und langsam Pipette die Zell-Lösung mit einem 200 mL Pipette. Legen Sie dann die BFC flach und mit 100 ml PBS oder leere Medien das Gegenteil BFC Ecke. Spülen Sie den BFC auf diese Weise eine zusätzliche 2-4 mal, wie nötig, um alle Zellen von der inter-und Regionen deutlich.
6. Je 200 ml Medium auf der Chipoberfläche. Saugen Sie Gelatine / Medien aus dem TCPS. Dann kehren die vorbefeuchtet Schüssel und langsam schieben Sie den BFC nach oben in die Schüssel.
7. Tragen Sie einen Binder Clip jeweils zu beiden Seiten der Kammer, um es zu versiegeln. Entfernen Sie den Metallstäben aus dem Bindemittel Clips, so dass Gericht bleibt Ebene als umgedreht.
8. Schließlich schnell flip das Setup über gleichzeitiger Vermeidung unnötiger Bewegung, und legen Sie sie in den Brutkasten.

Discussion

Obwohl das Protokoll und Video hier gezeigt beschreiben mit dem BFC ¹ bis Muster embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs), kann BFCS verwendet, um Muster praktisch jeder Zelltyp von Interesse sein. Die einzige Veränderung braucht man, um möglicherweise ist es, die Größe der Kavitäten zu ändern. In unserer Erfahrung, die BFC, um Muster einzelner Zellen eines anderen Zelltyp, ein Mikrotiterplatten Durchmesser und Höhe gleich 10 Mikrometer größer als die ungebundenen Zelldurchmesser verwenden am besten funktioniert.

BFCS können auch Muster Zellen auf anderen Substraten, einschließlich anderer Zellen, ohne wesentliche Änderungen in dem verwendeten Protokoll. Strukturierung auf eine bestehende Zellschicht ist ein Vorteil der BFC-Ansatz im Vergleich zu herkömmlichen Zellen Strukturierung Ansätze, da bestimmte celltypes, einschließlich mESCs und menschlichen ES-Zellen, zu unterstützen oder Feeder-Zellen ihre richtige Phänotyp in Kultur zu halten benötigt.

Eine Anwendung des BFC, die wir verfolgen ist, die BFC nutzen, um zu untersuchen Signalisierung zwischen embryonalen Stammzellen der Maus. Durch Aussaat einzelner Zellen in eckigen Gitter mit unterschiedlichen Rasterabständen, modulieren wir die Rate, mit der Signalmoleküle durch Zellen ausgetauscht werden. Durch die größeren Vertiefungen (mit einem Durchmesser von 40 Mikron), können wir sammeln auch eine größere Anzahl (~ 2-10)-Zellen an einem bestimmten Ort, lokal verändern Zelldichte. Darüber hinaus können wir eine Reihe von kleinen Brunnen in der Nähe von jedem anderen Ort, was zu einem Substrat Muster, bei dem lokale Zelldichte ist hoch durch die Zellen nicht in Kontakt sind. Auf diese Weise können wir unabhängig modulieren diffusionsfähig und juxtacrine Signalisierung zwischen den Zellen. Nachdem Zellen in einem Raster macht es auch viel einfacher, Zellen über mehrere Tage zu verfolgen. Wir glauben, dass die Leichtigkeit der Zelle Musterung mit dem BFC werden andere Forscher, um es in ihre Studien benutzen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin