Patroonvorming van embryonale stamcellen Met behulp van de Bio Flip Chip

Summary

Demonstreren we een eenvoudige methode voor het plaatsen van cellen op de gewenste locaties op een substraat. Deze methode patronen cellen door het opgooien van een siliconen chip met microwells gevuld met cellen op de ondergrond. Deze methode biedt een nieuwe manier te moduleren diffundeerbare en juxtacrine signalering tussen cellen.

Abstract

Cel-cel interacties, bestaande uit diffundeerbare signalering en cel-cel contact (juxtacrine signalering) zijn van belang in tal van biologische processen, zoals de groei van tumoren, stamcel differentiatie en stamcellen zelfvernieuwing. Een aantal van de methoden die momenteel bestaan ​​om moduleren cell signaling in vitro. Een methode van het moduleren van de totale hoeveelheid diffundeerbare signalering is om de cel te zaaien dichtheid variëren gedurende cultuur. Als gevolg van de willekeurige aard van de cel zaaien, leidt dit tot een aanzienlijke variatie in de feitelijke cel-cel afstand en de hoeveelheid van cel-cel contact, en kan niet voorschrijven de lokale omgeving. Een meer specifieke aanpak voor het moduleren van cell signaling is aan moleculaire remmers of genetische benaderingen te gebruiken om knock down specifieke signaaleiwitten, maar beide methoden zijn het meest geschikt voor het manipuleren van kleine aantallen moleculen. Hier tonen we een nieuwe benadering van het moduleren van cel-cel signalering dat de lokale omgeving van een cluster van cellen door het plaatsen van een verschillend aantal cellen op de gewenste locaties op een substraat moduleert. Deze methode biedt een aanvullende manier om de lokale diffundeerbare en juxtacrine signalering tussen cellen te controleren. Onze methode maakt gebruik van de Bio Flip Chip (CBF), een microfabricated siliconen chip met honderden-to-duizenden microwells, iedere grootte om ofwel een enkele cel of kleine aantallen cellen te houden. We laden de chip met cellen gewoon door pipetteren ze op de array van putten en het wassen gelost cellen uit de array. De chip wordt dan omgedraaid op een substraat, waarbij de cellen vallen uit de putten en op de ondergrond, met behoud van hun patroon. Nadat de cellen hebben aangesloten, kan de chip worden verwijderd (of links op). Deze benadering van cel patronen is uniek in die zin dat: 1) verandert niets aan de chemie van de ondergrond, waardoor cellen te laten groeien en te migreren, 2) maakt het mogelijk patronen op elke ondergrond, inclusief weefselkweek polystyreen, glas, Matrigel, en zelfs feeder cellagen, en 3) is compatibel met de traditionele microcontact drukken, waardoor de creatie van extracellulaire matrix eilanden met cellen geplaatst in deze eilanden. In deze video, tonen we de patronen van muis embryonale stamcellen op tissue-cultuur polystyreen met behulp van de CBF.

Protocol

Het maken van een BFC

BFCs zijn gemaakt door het vormen polydimethylsiloxaan (PDMS) over een 4 "Si meester wafer.

Maken van een master wafer

1. Begin met het drogen van Si wafers gedurende 30 minuten bij 130 ° C.
2. Plaats de wafer op een spin-coater, giet SU8-2050 (Microchem) op de wafer, helling van 300 rpm / s tot +3.000 tot 4000 rpm, en de spin voor de 30 s te voorzien van een hoogte van 40-30 mm opbrengst, respectievelijk.
3. Na het spinnen, de wafer plaats op een 65 ° C kookplaat, onmiddellijk helling omhoog de temperatuur tot 95 ° C voor 5-6 minuten, en dan is ramp tot 65 ° C.
4. Expose de wafers aan een UV-dosis van 200 mJ / cm ² op een contact aligner met behulp van een donker-veld masker.
5. Leg de wafels op een 65 ° C kookplaat, onmiddellijk helling omhoog de temperatuur tot 95 ° C voor 4-5 minuten, en daarna ramp naar beneden tot 65 ° C.
6. De ontwikkeling van de wafers in PM acetaat en isopropanol.
7. Silaniseren de wafers gedurende 30 min met behulp van hexamethyldisiloxaan (Shin-Etsu MicroSi), of (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichloorsilaan (t2492-KG, UCT Specialiteiten, Bristol, PA), om te voorkomen dat PDMS vasthouden aan de meester Si wafer.

Molding chips

1. Mix PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) in een 10:01 verhouding, giet het over de meester Si wafer (~ 15 g per wafer), en laat het een nacht uitharden bij kamertemperatuur.
2. Schil de uitgeharde PDMS uit de Si wafer en snijd elke chip met behulp van een scheermesje.
3. Bond elke chip om een ​​1x1 cm snijden microscoopglaasje voor eenvoudig gebruik.

De voorbereiding van het CBF voor gebruik

1. Geniet van de CBF overnachting in PBS om de absorptie van de media te voorkomen in de PDMS tijdens het experiment.
2. Droog de chips met een Kimwipe (Kimtech Science).
3. Doe een daling van 7,5% Bovine Serum Albumine (BSA) (~ 200 ml) op het patroon oppervlak van de CBF, en dan schraap het met een pipet tip om de BSA verspreiden en verwijder eventuele luchtbellen uit de putten.
4. Laat de BSA op de CBF oppervlak ten minste 0,5 uur. Idealiter Schud de BSA elke 15 minuten om te voorkomen korstvorming.
5. Voor de montage van de CBF in een 35x10 mm TCPS schotel (Falcon, 35 tot 3001), snijd de randen van een schotel TCPS half naar beneden, zodat de ¾ "bindmiddel clips (Office Depot) past over het gerecht rand van de chip klem en schotel samen.
6. Snijd een spacer pakking (frame-vormig met 20'20 mm buitenste rand, 15'15 mm binnenrand, en 250 tot 500 mm dikte) van een PDMS vel (Siliconen Specialty Products) of enig andere silicone, en toepassen op de schotel met een pincet.

Patronen cellen met een BFC

1. Steriliseer de schotel, pakking, BSA-gecoate chip, en twee clips bindmiddel onder UV-licht gedurende 1 minuut.
2. Zuig het BSA en twee keer spoel de CBF met 200 ml PBS.
3. Voeg gelatine om de cut TCPS gerecht indien nodig voor uw mobiele lijn. Anders, nat van de TCPS oppervlak met sommige media voordat het aan de chip (zie hieronder). Dit voorkomt de vorming van luchtbellen in de kamer.
4. Na het opzuigen van de PBS, pipet 200 mL van cel-oplossing (~ 1 × 10 ⁶ cellen / ml) op de CBF oppervlak. Laat de cellen genoegen nemen met 5-10 minuten.
5. Kantel de CBF om een ​​hoek op een ~ 15 ° hoek en langzaam pipet de cel oplossing af met een 200 ml pipet. Plaats vervolgens de CBF vlakke en voeg 100 ml PBS of lege media naar de tegenoverliggende hoek BFC. Spoel de CBF op deze wijze een extra 2-4 keer zo nodig, om alle cellen van de inter-regio's goed duidelijk.
6. Pipetteer 200 ml van media op de chip oppervlak. Aspireren gelatine / media uit de TCPS. Keer dan de pre-bevochtigd schotel en langzaam duw de CBF omhoog, in de schaal.
7. Breng een bindmiddel clip per stuk, aan twee kanten van de kamer om het te verzegelen. Verwijder de metalen contactpunten uit het bindmiddel clips, zodat gerecht blijft niveau wanneer omgedraaid.
8. Tot slot, snel draai de setup op terwijl het vermijden van onnodige beweging, en plaats deze in de incubator.

Discussion

Hoewel het protocol en de video hier weergegeven beschrijven met behulp van de CBF ¹ tot en met patroon muis embryonale stamcellen (mESCs), kan BFCs worden gebruikt om patronen praktisch elk celtype van belang. De enige verandering kan men moet maken is te wijzigen van de grootte van de microwells. In onze ervaring, om de CBF te gebruiken om het patroon enkele cellen van een ander celtype, een microwell diameter en hoogte gelijk is aan 10 micron groter is dan de losse cel diameter het beste werkt.

BFCs kan ook worden gebruikt om patronen cellen op andere ondergronden, zoals andere cellen, zonder significante veranderingen in het protocol. Patronen op een bestaand cellaag is een voordeel van de CBF aanpak ten opzichte van traditionele cel patronen benaderingen aangezien bepaalde celltypes, waaronder mESCs en menselijk sociaal-economische raden, hebben steun nodig of feeder-cellen naar hun juiste fenotype in de cultuur te behouden.

Een toepassing van de CBF die we nastreven is om de CBF te gebruiken om te onderzoeken signalering tussen muis embryonale stamcellen. Door het zaaien enkele cellen in vierkante roosters met verschillende rooster tussenruimtes, we moduleren van de snelheid waarmee signaalmoleculen worden uitgewisseld door cellen. Door het maken van grotere putten (met een diameter van 40 micron), kunnen we verzamelen ook grotere aantallen (~ 2-10) cellen op een bepaalde locatie, lokaal te veranderen celdichtheid. Daarnaast kunnen we een aantal kleine putten in de nabijheid van elkaar, wat resulteert in een substraat patroon waar de lokale celdichtheid is hoog door de cellen niet in contact komen. Op deze manier kunnen we onafhankelijk van elkaar moduleren diffundeerbare en juxtacrine signalering tussen cellen. Met cellen in een raster maakt het ook veel gemakkelijker om cellen te volgen over meerdere dagen. Wij zijn van mening dat het gemak van de cel patronen met de BFC zal aanmoedigen andere onderzoekers om het te gebruiken in hun studie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin