Summary
हम एक निरंतर बल axial ऑप्टिकल चिमटी का उपयोग करने के लिए कम डीएनए अणु के यांत्रिक गुणों का पता लगाने का वर्णन. डीएनए axially खींच, हम steric hindrances और पारंपरिक पार्श्व हेरफेर में उत्पन्न होने वाली कलाकृतियों को कम करने के लिए, हमें ~ 100 एनएम के रूप में कम के रूप में डीएनए अणु का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.
Protocol
1. चिमटी सेटअप
- एक 1064 एनएम लेजर बीम orthogonally दो polarized मुस्कराते हुए में विभाजित है. एक जबकि अन्य अंशांकन प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्र देखें 2.) Biomolecule में हेरफेर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- हेरफेर बीम की तीव्रता एक acousto ऑप्टिक झुकानेवाला (AOD) द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जबकि प्रत्येक बीम की स्थिति को ध्यान बीम स्टीयरिंग दर्पण और ऑप्टिकल दूरबीन द्वारा स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जाता है, क्रमशः.
- मुस्कराते हुए तो एक और ध्रुवीकरण बीम फाड़नेवाला के साथ recombined कर रहे हैं और आगे telescoping प्रकाशिकी के अंतिम सेट करने के लिए थोड़ा खुर्दबीन उद्देश्य के पीछे एपर्चर परिपूर्ण वातानुकूलित. अंशांकन बीम के लिए एक 50% उमड़ाना एक तंग ऑप्टिकल जाल की ओर जाता है, जबकि हेरफेर बीम के लिए एक छोटे से थोड़ा कारक है, लगभग 20%, एक shallower ध्यान देता है कि एक बड़ा रैखिक क्षमता के व्यावहारिक क्षेत्र में तब्दील हो. मुस्कराते हुए कसकर एक PlanApo 60x/1.4 तेल विसर्जन माइक्रोस्कोप obj द्वारा ध्यान केंद्रित कर रहे हैंनमूना सेल पर ective.
- इस चिमटी सेटअप एक घर का निर्माण brightfield माइक्रोस्कोप है कि एक एक संघनित्र द्वारा नमूना कक्ष पर ध्यान केंद्रित हलोजन दीपक से रोशनी प्रदान करता है के साथ संयुक्त है. Dichroic दर्पण द्वारा brightfield छवि लेजर प्रकाश से अलग किया जाता है और फिर दो सीसीडी कैमरों पर imaged. डेटा प्राप्त करने की हमारी प्राथमिक साधन के रूप में सीसीडी कार्य करता है और सटीक नमूना दरों उपज के लिए ट्रिगर सॉफ्टवेयर है, जबकि अन्य सीसीडी छवि एक एकल अटक संदर्भ microsphere स्थिति जिसका एक प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणाली के रूप में कार्य करता है माइक्रोस्कोप में बहाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- नमूना coarsely एक XY मंच द्वारा उद्देश्य सम्मान के साथ तैनात है, और फिर ठीक एक एम्बेडेड तीन आयामी piezo मंच द्वारा तैनात किया जा सकता है.
- आगे बिखरे हुए और संचारित लेज़र प्रकाश brightfield संघनित्र द्वारा एकत्र की है और एक photodetector पर ध्यान केंद्रित किया. परिणामस्वरूप संकेत एक विरोधी aliasing फिल्टर के माध्यम से 100 kHz पर फ़िल्टर किया जाता है, और प्रवर्धित एकएक DAQ कार्ड का उपयोग कर 200 kHz पर cquired.
2. मनका के Axial स्थिति को स्पष्ट आकार औजार
- एक 800 एनएम व्यास polystyrene microspheres के समाधान फॉस्फेट में पतला फैलाने के साथ एक नमूना 9 कक्ष लोड खारा buffered. 10-15 मिनट के लिए बैठते हैं और फिर हल्के अतिरिक्त microspheres हटाने के लिए बफर के साथ फ्लश.
- एक अनियमित coverglass करने के लिए अटक microsphere लगाएँ और नमूना कक्ष की ऊंचाई को समायोजित जब तक microsphere लगभग ध्यान नीचे 1 सुक्ष्ममापी एक defocused छवि उत्पन्न है.
- छवि की स्पष्ट आकार को मापने के लिए, 1 ज्यामितीय LabView में समारोह मिलान पैटर्न का उपयोग कर microsphere के केंद्र लगता है.
- अगला, प्रत्येक पार अनुभाग के केंद्र के बारे में 360 डिग्री के औसत से microsphere की एक रेडियल तीव्रता प्रोफाइल उत्पन्न करते हैं. रेडियल प्रोफाइल, जो brightfield छवियों में से प्रत्येक में एक सफेद अंगूठी से मेल खाती एक द्विघात समारोह के साथ फिट किया जा सकता है लगता हैएक चमक शिखर. इस शिखर और केन्द्र के बीच की दूरी मनका के स्पष्ट आकार के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Calibrated piezostage का प्रयोग, धीरे - धीरे microsphere के axial स्थिति में वृद्धि और सीसीडी कैमरा के साथ प्रत्येक axial स्थिति में एक छवि प्राप्त.
- एक के बाद एक अपने axial स्थान के साथ microsphere की स्पष्ट आकार सहसंबंधी (चित्र देखें 3.) छवि के लिए छवि विश्लेषण दोहराएँ. axial विधि द्वारा प्राप्त संकल्प 1.4 एनएम लगभग 7 है.
3. हेरफेर बीम ऑप्टिकल संभावित मानचित्रण
- Collinearly हेरफेर बीम और अंशांकन बीम aligning द्वारा शुरू करो. अंशांकन बीम लगभग 50 मेगावाट उद्देश्य के पीछे एपर्चर में हो सकता है जबकि हेरफेर बीम बहुत कमजोर होना चाहिए, 10 मेगावाट का कहना है.
- हेरफेर किरण के साथ बंद, बहुत stiffer जाल अंशांकन बीम के भीतर एक मुक्त microsphere सीमित.
- अब, मणि पर बारीpulation बीम. चूंकि हेरफेर बीम बहुत अंशांकन किरण की तुलना में कमजोर है, microsphere के axial स्थिति थोड़ा परेशान हो जाएगा. axial स्थिति में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन defocused brightfield के रूप में पहले से ही वर्णित छवियों से मापा जा सकता है.
- हेरफेर बीम मुड़ें और अभी भी अंशांकन बीम में फंस microsphere के साथ, दूरबीन लेंस का समायोजन करके अंशांकन बीम के axial फोकस शिफ्ट. हेरफेर बीम पर चालू, microsphere और दोहराने के बाद विस्थापन को मापने के.
- displacements ΔX अंशांकन बीम का फोकस के axial स्थिति के खिलाफ साजिश रची जा सकता है. axial microsphere का सबसे बड़ा विस्थापन को इसी स्थिति ऑप्टिकल जाल (चित्र देखें.) 4 के रेखीय क्षेत्र के केंद्र को निर्धारित करता है.
- axial स्थिति के एक समारोह के रूप में हेरफेर बीम के ऑप्टिकल शक्ति प्राप्त करने में अंतिम कदम की कठोरता के एक सावधान माप की आवश्यकताअंशांकन बीम. इसे प्राप्त करने के लिए, सतह के ऊपर चारों ओर एक micrometer दूरबीन लेंस समायोजन जबकि हेरफेर बीम बंद है microsphere, अंशांकन किरण फंस, चाल.
- Microsphere की एक photodetector के साथ प्रेषित प्रकाश की तीव्रता को मापने के द्वारा थर्मल अक्षीय गति रिकार्ड.
- संकेत के autocorrelation एक एकल घातीय क्षय समारोह के लिए लगाया जा सकता है उतार चढ़ाव की लगातार समय दे, τ. z
- hydrodynamic घर्षण microsphere ζ गुणांक, microspheres एक सतह 5,10 निकटता के लिए सही किया जा सकता है. अंशांकन जाल की कठोरता तो κ z = / ζ τ z (देखें पूरक सामग्री ए और बी) के द्वारा दिया जाता है.
- अंशांकन जाल की कठोरता को जानने का एक एक बल ƒ में पहले से मापा axial displacements z = κ z थी ΔX एकता कन्वर्ट करने के लिए अनुमति देता हैवक्र हेरफेर बीम के axial ऑप्टिकल संभावित (चित्र देखें.) 4 के एक स्थानिक मानचित्रण पैदावार.
4. एक डीएनए नमूना टूटती
- माउंट कक्ष 9 युक्त सतह सीमित डीएनए अणु (<1 KBP) और, जबकि brightfield छवि देख, unstretched microspheres ऊपर दूरबीन का समायोजन करके थोड़ा हेरफेर बीम का ध्यान जगह. फिर एक microspheres की फंस गया है जब तक मंच की स्थिति को समायोजित.
- मोटे तौर पर ऑप्टिकल जाल के xy विमान के केंद्र में microsphere स्थिति. LabView में वर्ग लहरों की एक श्रृंखला उत्पन्न करने और उन्हें AOD को भेजने के लिए repetitively लेजर बीम पर और बंद. ध्यान से लेजर और पर राज्य की अवधि के लिए नमूना कक्ष के हीटिंग को रोकने की तीव्रता को नियंत्रित करते हैं. आमतौर पर, लेजर शक्ति (उद्देश्य के वापस एपर्चर में मापा) के 2 मेगावाट के आसपास का उपयोग करने के लिए और 200 (पर) एमएस और 500 एमएस (बंद) के दालों भेजें. वर्ग w के आयामएवेन्यू AOD के लिए भेजा 0.5 के आसपास होना चाहिए वी.
- Microsphere घड़ी के रूप में बार - बार में जाल पर कर दिया जाता है और बंद और ध्यान दें कि यदि लेजर microsphere गति के लिए किसी भी तरजीही दिशा लाती. जबकि iteratively दोनों एक्स और वाई दिशा में microsphere स्थिति का समायोजन, को नियंत्रित द्वारा piezostage, microsphere की अनियमित गति XY विमान में isotropic हो जाते हैं, हालांकि काफ़ी प्रतिबंधित जब लेजर पर है.
- अगले Z दिशा में मनका पंक्ति. फिर लेजर बीम नाड़ी और जबकि इस समय, एक साथ वास्तविक समय में microspheres अक्षीय विस्थापन को मापने. रेखीय क्षेत्र के भीतर चरण केंद्र है, जो बिंदु है जहां Z विस्थापन की सबसे बड़ी है.
- Z दिशा में एक सावधान संरेखण के बाद, यह जाँच करने के लिए जरूरी है कि जाल अभी भी XY विमान में केंद्रित है. यदि XY संरेखण बदल गया है, दोनों XY और जेड संरेखण तक microsphere ठीक से सभी तीन एक साथ केंद्रित है दोहराया जाना चाहिएअक्षों.
- डीएनए खींचने के लिए, AOD एक वोल्टेज संकेत भेजने, 0.025 के चरणों में वी. प्रत्येक चरण में 0 वी से 0.5 वी, रिकॉर्ड 100 fps पर 400 फ्रेम और औसत उन्हें अक्षीय विस्थापन को प्राप्त करने के लिए लेजर तीव्रता रैंप.
- बल विस्तार घटता अब प्लॉट किए जाते हैं और किया जा सकता है एक बार संशोधित WLC 11 मॉडल के लिए फिट करने के लिए (पूरक B सामग्री देखें).
5. प्रतिनिधि परिणाम:
एक 1298 बीपी और एक 247 बीपी अनुक्रम होने के बाद कम से कम अनुक्रम हम reproducibly खिंचाव करने में सक्षम हो गया है: हम दो डीएनए दृश्यों के लिए बल विस्तार घटता उपस्थित थे. डीएनए के छोटे हिस्सों के लिए, पारंपरिक कीड़ा की तरह (WLC) चेन मॉडल पूरी तरह से बल विस्तार के संबंध की व्याख्या नहीं करता, क्योंकि इन तराजू लंबाई में एक परिमित आकार प्रभाव और शून्य बल सीमा की कमी से उत्पन्न होने वाले विस्तार के लिए खाते चाहिए. बल विस्तार माप, इसलिए, एक संशोधित WLC मॉडल है जो एक effecti का उपयोग फिट होहठ लंबाई और फिट पैरामीटर, पूरक सामग्री में आगे वर्णित के रूप में एक शून्य बल विस्तार ve. DsDNA की बड़ी समोच्च लंबाई के लिए, प्रभावी दृढ़ता लंबाई बस नाममात्र दृढ़ता (~ 50 एनएम) लंबाई और शून्य बल विस्तार उपेक्षित किया जा सकता है. हालांकि, समोच्च लंबाई के रूप में कम हो जाता है प्रभावी दृढ़ता लंबाई 50 एनएम और डीएनए के नीचे अच्छी तरह से कम हो जाती है, शून्य बल के तहत भी एक महत्वपूर्ण विस्तार से पता चलता है.
बल विस्तार घटता की और डेटा इसी फिट बैठता छवि में दिखाए जाते हैं. दो दृश्यों के लिए 5. संशोधित फिट बैठता WLC से, हम प्रभावी दृढ़ता लंबाई 1298 बीपी डीएनए और 247 बीपी डीएनए के लिए 25 एनएम के लिए 35 एनएम होने के लिए निर्धारित किया है. निदर्शी प्रयोजनों के लिए, हम प्रत्येक दृश्य के लिए बल विस्तार घटता की एक उपाय पेश कर रहे हैं. अभ्यास में, एक माप कई बार दोहराने और मानक त्रुटियों के साथ साथ औसत परिणाम प्राप्त होगा. यह भी था ध्यान दिया जाना चाहिएप्रत्येक वक्र प्राप्त करने के बाद टी यह जरूरी है करने के लिए सुनिश्चित करें कि microsphere फँस गया और ठीक से तैनात रेखीय क्षेत्र के भीतर, अन्यथा microsphere के रूप में पहले से प्रोटोकॉल में वर्णित realigned किया जाना चाहिए रहता है.
चित्रा 1 Axial ऑप्टिकल चिमटी के सिद्धांत (बाएं). पारंपरिक ध्यान निकट ऑप्टिकल चिमटी जाल. मनका तो coverslip पार्श्व स्थानांतरित करने के लिए तनाव डालती. (सही) axial ऑप्टिकल चिमटी में, एक microsphere दूर ध्यान से फंस गया है, ऑप्टिकल क्षमता के रेखीय क्षेत्र में. इस विन्यास में, बहुलक एक्सटेंशन की एक श्रृंखला के लिए निरंतर तनाव के तहत आयोजित किया जाता है. इसके अलावा, लेजर तीव्रता में वृद्धि अक्षीय दिशा में microsphere चाल.
चित्रा 2 योजनाबद्ध प्रतिनिधित्वAxial ऑप्टिकल चिमटी लेजर प्रकाश (1064nm एन डी: 4 Yvo) दो कड़ियां में एक polarizing बीम फाड़नेवाला (पीबीएस) के माध्यम से गुजर द्वारा विभाजित है. हेरफेर बीम, एक झुकानेवाला acousto ऑप्टिकल (AOD) के माध्यम से गुजरता है और अंशांकन बीम स्वतंत्र रूप से समायोजित किया जा सकता है दूरबीन लेंस का उपयोग. दो मुस्कराते हुए तो एक अन्य पीबीएस का उपयोग recombined कर रहे हैं और एक उच्च NA उद्देश्य से नमूना पर ध्यान केंद्रित है. इसके साथ ही, brightfield रोशनी microsphere ट्रैक किया, नमूना के माध्यम से गुजरता है, (आईआर) अवरक्त फ़िल्टर्ड है और तो दो सीसीडी कैमरों, जबकि अन्य एक प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणाली का हिस्सा के रूप में काम करता है, जिनमें से एक माप लेता द्वारा imaged.
3 Axial स्थिति अंशांकन चित्रा axial स्थिति जांचना, हम एक मंच के axial पदों में अलग कक्ष coverslip अटक मनका के defocused छवियों को प्राप्त. माइक्रो के आकारफेरे इसके केंद्र और उज्ज्वल microsphere की छवि के आसपास का गठन अंगूठी के बारे में पीक तीव्रता की स्थिति के बीच की दूरी के द्वारा दिया जाता है. इनसेट जो मनका के आकार देता रेडियल वितरण तीव्रता प्रस्तुत करता है.
ऑप्टिकल संभावित मानचित्रण पीछे 4 सिद्धांत बाहर निकालने के लिए हेरफेर बीम के ऑप्टिकल शक्ति नक्शा, axial विस्थापन है कि यह एक बहुत मजबूत अंशांकन बीम भीतर फंस microsphere पर लाती मापा जाता है. रेखीय क्षेत्र के केंद्र में स्थित है जहां इस विस्थापन को एक अधिकतम है. Axial स्थिति वक्र बनाम ऑप्टिकल सेना के लिए ऑप्टिकल संभावित मिल एकीकृत किया जा सकता है.
चित्रा 5 सेना एक्सटेंशन वक्र. डेटा एक यादृच्छिक 1298 बीपी और 247 (इनसेट) बीपी segmen के लिए दिखाया गया हैdsDNA टी axial ऑप्टिकल चिमटी से बढ़ाकर. डेटा बिंदुओं Eq के संशोधित WLC मॉडल के लिए फिट थे. 3 (ठोस लाइनों) और 1298bp और 247bp क्रमशः के लिए 34 एनएम और 25 एनएम के प्रभावी दृढ़ता लंबाई झुकेंगे.
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Discussion
पारंपरिक ऑप्टिकल चिमटी एक refractile वस्तु पर एक निरंतर बल लागू करने के लिए या तो अनुरूप या कंप्यूटर नियंत्रित प्रतिक्रिया पर भरोसा करते हैं. इन सक्रिय प्रतिक्रिया प्रणालियों शर्तों जहां नमूना के विस्तार में अचानक परिवर्तन हो तहत प्रदर्शन में कठिनाई होती है, उदाहरण के लिए, एक प्रोटीन के बंधन से डीएनए या रेशा एक साथ एक आणविक मोटर तेजी एक कदम. निरंतर बलों को लागू करने के लिए विभिन्न निष्क्रिय तरीकों को हाल ही में विकसित किया गया है. एक ऐसी विधि है, basepair संकल्प पर आरएनए पोलीमरेज़ के एक कदम को हल करने के लिए प्रयोग किया जाता है, एक गाऊसी लेजर बीम 12 के ऑप्टिकल क्षमता के रेखीय क्षेत्र के भीतर काम शामिल है. हम कम biomolecules के हेरफेर के लिए एक निरंतर बल axial ऑप्टिकल चिमटी बनाने के द्वारा इस विधि के अनुकूल है.
Axial ऑप्टिकल चिमटी डीएनए से कम फैला है कि पारंपरिक तरीकों ऑप्टिकल द्वारा हेरफेर करने के लिए दुर्गम का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे सेंट करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैUdy कुछ सौ आधार 8 जोड़े के रूप में छोटे रूप में करने के लिए और प्रोटीन की मध्यस्थता डीएनए पर लोचदार तनाव के प्रभाव की जांच की लोच कम डीएनए अणु 13,14 loops. कम लम्बाई के पैमाने पर, अनुक्रम निर्भर हाइड्रोजन संबंधों में बदलाव और stacking ऊर्जा से उत्पन्न होने वाले प्रभाव, दृढ़ता से डीएनए के लोचदार संपत्तियों के लिए योगदान कर सकते हैं. Axial ऑप्टिकल चिमटी डीएनए लोच 15 पर इन अनुक्रम निर्भर प्रभाव uncovering के लिए एक आदर्श उपकरण हैं. इसके अलावा, axial ऑप्टिकल चिमटी व्यक्ति histones आसपास डीएनए की रैपिंग के अध्ययन के लिए और किसी भी तेजी से प्रसंस्करण आणविक मोटर की गतिविधि की जांच के लिए एक संवेदनशील उपकरण है, और toolbox एकल अणु में एक मूल्यवान नई तकनीक साबित होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम axial ऑप्टिकल चिमटी के साथ मदद के लिए और अपने खींच डेटा की इस पांडुलिपि के लिए कुछ योगदान देने के लिए डा. Yih फैन चेन धन्यवाद. यह काम NSF बनावट 0957293 अनुदान और ध्यान बनावट-0114336 अनुदान द्वारा प्रायोजित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| Nd:YVO4 laser | Spectra Physics | T40-Z-106C | |
| Acousto-optic deflector | IntraAction | DTD-274HA6 | |
| Microscope Objective | Olympus | PlanApo | 60X, NA 1.4 |
| Piezo stage | Mad City Labs | Nano-LP100 | XYZ stage |
| CCD camera | PixeLink | PL-A741 | |
| Photodetector | Electro-Optics Tech | ET-3020 | |
| Polystyrene Beads | Spherotech | SVP-08-10 | 800nm, streptavidin coated |
| Anti-digoxigenin | Roche | 11333089001 | From sheep |
| Primers | MWG operon | Custom oligos | One primer: biotin Other : digoxigenin |
| PCR reagents | New England Biolabs | TAQ polymerase, dNTPs | |
| Coverglass | Fisher Scientific | ||
| Other chemicals for buffer | Fisher Scientific | ||
Supplementary Materials |
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A. Hydrodynamic Friction C–fficient |
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For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10: |
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where the following shorthand has been introduced: |
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The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms. |
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B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration |
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The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition. |
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C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model |
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The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows: |
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where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 |
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where ε is the relative DNA extension.References
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