מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

Summary

אנו מדגימים את השימוש בפינצטה אופטית צירית קבועה כוח כדי לחקור את התכונות המכאניות של מולקולות דנ"א קצרות. על ידי מתיחת DNA axially, אנחנו למזער מכשולים וממצאים שמקורם במניפולצית רוחב קונבנציונלית סטריים, ומאפשרים לנו לחקור מולקולות דנ"א קצרה כמו ~ 100 ננומטר.

Abstract

טכניקות מולקולה בודדה למתיחת DNA של אורכי גובה פחות מkilobase הן כרוכות בקשיים ניסיוניים. עם זאת, מספר רבים של אירועים ביולוגיים מעניינים כגון מחייב היסטון וחלבון בתיווך לולאות של DNA ^1,2, מתרחשים בקנה מידת אורך זו. בשנים האחרונות, את התכונות המכאניות של ה-DNA הוכחו לשחק תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים בסיסיים כמו האריזה של ה-DNA לתוך nucleosomes הקומפקטי וסיבי הכרומטין ^3,4. ברור, אז זה חשוב להבין את התכונות המכאניות של מותחים קצרה של ה-DNA. במאמר זה, אנו מספקים מדריך מעשי לטכניקת מריטות חוזרת ונשנית מולקולה בודדה אופטית שפתחנו כדי ללמוד את ההתנהגות המכאנית של ה-DNA באורכי גובה זמן הקצר של כמה מאה basepairs.

המשוכה העיקרית במתיחת קטעים קצרים של DNA היא שפינצטה אופטית קונבנציונלית נועדה בדרך כלל להפעלת כוח בdirection לרוחב לשלב ^5,6, (ראה איור. 1). בגיאומטריה זה, הזווית בין החרוז וcoverslip, כדי שהדנ"א הוא קשור, הופכת תלולה מאוד לדנ"א אורך submicron. העמדה הצירית עכשיו יש בחשבון, שיכול להיות אתגר, ומאז ההארכה גוררת microsphere קרוב יותר לcoverslip, אפקטים סטריים משופרים. יתר על כן, כתוצאה מהסימטריה של microspheres, רחבות לרוחב תפקנה רמות שונות של מומנט עקב סיבוב של microsphere בתוך המלכודת האופטית מאז הכיוון של שינויי הכח תגובתי במהלך ההארכה.

שיטות חלופיות לדנ"א submicron מתיחה נתקלות מכשולים הייחודיים משלהם. לדוגמה, מלכודת קורה כפול אופטית מוגבלת למתיחות סביב ה-DNA של גל, שבו השפעות התערבות נקודות בין שתי מלכודות ומפיזור האור בין microspheres מתחילות להוות בעיה משמעותית. החלפה אחת מהמלכודותעם micropipette היית כנראה סובל מאתגרים דומים. בעוד אחד יכול להשתמש ישירות את הפוטנציאל הצירי למתוח את ה-DNA, סכימת משוב פעילה, תהיה צורך להפעיל כוח קבוע ורוחב הפס של זה יהיה מוגבל למדי, במיוחד בכוחות נמוכים.

אנו לעקוף בעיות יסוד אלה על ידי משייכת ישירות את ה-DNA מcoverslip באמצעות כוח קבוע הצירית האופטית פינצטה ^7,8. זו מושגת על ידי לכידת החרוז באזור ינארית של הפוטנציאל האופטי, שבו הכח האופטי הוא הכח קבוע, אשר יכול להיות מכוון על ידי התאמת כוח הליזר. השמנה באזור יניארי משמשת גם ככוח-מהדק כל אופטי בדנ"א המשתרע על כמעט 350 ננומטר בכיוון הצירי. אנחנו במקביל לפצות על סחיפה תרמית ומכאנית על ידי התאמת העמדה של השלב דק, כך שההתייחסות microsphere הדבוק לcoverslip נשאר באותה העמדה ומיקוד,llowing לתקופת תצפית בלתי מוגבלת כמעט.

Protocol

1. פינצטה התקנה

1. אלומת ליזר מננומטר 1064 מחולקת לשתי אלומות orthogonally מקוטבות. אחד משמש כדי לתפעל את biomolecule ואילו השני משמש למטרות כיול (ראה איור. 2).
2. עוצמת קרן המניפולציה נשלטת על ידי הטיה acousto אופטית (AOD), ואילו מעמדו וההתמקדות של כל קרן נשלט באופן עצמאי על ידי ההיגוי מראה קורה וטלסקופים אופטיים, בהתאמה.
3. הקורות מכן recombined עם מפצל עוד קרן קיטוב והתנו נוספים על ידי קבוצה סופית של אופטיקה המתקפלת מעט ימלא יותר מדי את הצמצם האחורי של מטרת מיקרוסקופ. תמלא יותר מדי 50% לקרן הכיול מוביל למלכודת אופטית הדוקה, בעוד גורם מעט קטן לקורת המניפולציה, כ 20%, נותן דגש רדוד שמיתרגם אזור עביד גדול יותר של הפוטנציאל לינארי. הקורות מתמקדות בחוזקה על ידי obj PlanApo 60x/1.4 שמן טבילת מיקרוסקופective אל תא המדגם.
4. התקנת פינצטה זה בשילוב עם מיקרוסקופ הבית נבנה brightfield המספק תאורה ממנורת הלוגן הממוקד על תא המדגם על ידי קבל. תמונת brightfield מופרדת מאור הליזר על ידי מראה Dichroic ולאחר מכן צלמה בשתי מצלמות רגילות. אחד מעשי CCD כאמצעי העיקרי שלנו לרכישת נתונים ותוכנה מופעלת שיביא לשיעורי דגימה מדויקים, ואילו שני CCD משמש לתמונה אחת microsphere תקוע התייחסות תפקידו משמש כמערכת משוב בקרה כדי לפצות על היסחפות במיקרוסקופ.
5. המדגם ממוקם גס ביחס למטרה על ידי במת XY, ואז יכול להיות ממוקם בדיוק על ידי 3 פייזו שלב ממדי מוטבע.
6. אור הליזר קדימה המפוזר ומועבר נאסף על ידי קבל brightfield וממוקד על photodetector. האות המתקבלת היא מסוננת דרך מסנן אנטי-aliasing ב 100 קילוהרץ, מוגבר וcquired ב 200 קילוהרץ באמצעות כרטיס DAQ.

2. כיול גודל גלוי של החרוז למיקום צירי

1. טען קאמרי מדגם ⁹ עם פיזור הפתרון של 800 ננומטר קוטר הקלקר microspheres דילול בפוספט נאגר מלוח. תן לו לשבת במשך 10-15 דקות ולאחר מכן לשטוף עם חיץ קל להסיר microspheres העודף.
2. אתר microsphere התקוע באקראי לcoverglass ולהתאים את הגובה של חדר הדגימה עד microsphere הוא כ 1 מיקרומטר מתחת למוקד כדי ליצור תמונה מטושטשת.
3. כדי למדוד את גודלו הנראה של התמונה, ראשון למצוא מרכז microsphere באמצעות הדגם הגיאומטרי התאמת פונקציה בLABVIEW.
4. בשלב בא, ליצור פרופיל עוצמת הרדיאלי של microsphere על ידי ממוצעים של ° 360 על מרכזו של כל חתך. פרופיל רדיאלי, אשר תואם את הטבעת לבנה בכל אחת מתמונות brightfield, יכול להיות מצויד עם פונקציה ריבועית למצואשיא בהירות. מרחק בין השיא הזה והמרכז יכול לשמש כמדד לגודלו הנראה של החרוז.
5. שימוש piezostage המכויל, להגדיל בהדרגה את העמדה הצירית של microsphere ולרכוש תמונה בכל עמדה צירית עם מצלמת CCD.
6. חזור על הניתוח של כל תמונה ברציפות כדי לתאם את גודלו הנראה של microsphere עם המיקום הצירי שלה (ראה איור. 3). הרזולוציה הצירית מתקבלת על ידי שיטה היא כ -1.4 ננומטר ^7.

3. מיפוי הפוטנציאל האופטי של קרן המניפולציה

1. בגין על ידי יישור קורה המניפולציה וקרן כיול collinearly. קרן הכיול צריכה להיות סביב 50 mW בפתח האחורי של המטרה ואילו קרן המניפולציה צריכה להיות הרבה יותר חלשה, יניח 10 mW.
2. עם קרן המניפולציה כבויה, להגביל microsphere חינם בתוך המלכודת הרבה יותר הנוקשה של קורה הכיול.
3. עכשיו, הפעל את מאניקרן pulation. מאז קרן המניפולציה היא חלשה בהרבה מקורה הכיול, העמדה הצירית של microsphere תהיה מעט מוטרדת. כתוצאה מכך לשנות את העמדה צירית ניתן למדידה מתמונות brightfield defocused כפי שכבר תארו.
4. כבה את קורה מניפולציה ועם microsphere עדיין לכוד בקרן הכיול, להעביר את המיקוד הצירי של קרן הכיול על ידי התאמת העדשה טלסקופית. הפעל את קרן המניפולציה, למדוד את העקירה הבאה של microsphere וחזור.
5. ΔX ההתקות ניתן להתוות נגד העמדה הצירית של המיקוד של קרן הכיול. התפקיד המקביל לתזוזה הגדולה ביותר של microsphere הצירי קובע מרכז אזור יניארית של המלכודת האופטית (ראה איור. 4).
6. השלב האחרון בקבלת הכח האופטי של קרן המניפולציה כפונקציה של מיקום צירי דורש מדידה קפדנית של הנוקשות שלקרן כיול. כדי להשיג את זה, להעביר את microsphere, נלכד על ידי קרן הכיול, לכ מיקרומטר מעל פני השטח על ידי התאמת העדשה טלסקופית תוך קורה המניפולציה כבוי.
7. להקליט את התנועה הצירית התרמית של microsphere על ידי מדידת עוצמת האור מועבר עם photodetector.
8. Autocorrelation של האות ניתן להתאים לפונקצית דעיכה מעריכית יחידה לתת את הזמן המתמיד של התנודות,. Τ _z
9. מקדם החיכוך הידרודינמית ζ, של microsphere ניתן לתקן לקרבת microspheres ^ל5,10 שטח. הנוקשות של מלכודת כיול אז ניתן על ידי κ (ראו חומרים משלימים ו-B) _z = ζ / τ _z.
10. ידיעת הנוקשות של מלכודת הכיול מאפשרת לאדם להמיר את ההתקות הציריות נמדדו בעבר בכוח ƒ _z = κ _z אינטגרצית ΔX של thiשל עקום תשואות מיפוי מרחבים של הפוטנציאל האופטי הצירי של קרן המניפולציה (ראה איור. 4).

4. מתיחת דגימת DNA

1. הר קאמרי ⁹ מולקולות המכילות משטח כבולים DNA (<1 KBP) ובעודו צופה בתמונת brightfield, למקם את המיקוד של אלומת המניפולציה מעט מעל microspheres unstretched ידי התאמת טלסקופ. ואז להתאים את המיקום של הבמה עד שאחד מmicrospheres לכודים.
2. בערך למקם microsphere במרכז מטוס XY של המלכודת האופטית. לייצר סדרה של גלים מרובעים בLabVIEW ולשלוח אותם לAOD שוב ושוב להפוך את קרן הליזר וכיבוי. זהירות לשלוט על עוצמת הליזר ואת משך הזמן של המדינה על מנת למנוע חימום של חדר המדגם. בדרך כלל, להשתמש סביב 2 mW של ליזר כוח (נמדד בפתח האחורי של אובייקטיבי) ולשלוח פולסים של 200 מילישניות (ב) ו500 מילים (כבוי). המשרעת של הכיכר wשד 'נשלח לAOD צריך להיות סביב 0.5 V.
3. צפה microsphere כמלכודת פנתה שוב ושוב לסירוגין ולשים לב אם הליזר גורם לכל כיוון מועדף לתנועה של microsphere. בעוד ערוך את התאמת עמדת microsphere בשניהם X ו Y הכיוון, על ידי שליטה על piezostage, התנועה האקראית של microsphere צריכה להיות איזוטרופי במישור XY, אם כי מוגבלת במידה ניכרת כאשר הליזר מופעל.
4. בשלב בא, ליישר את החרוז בכיוון Z. שוב דופק את קרן הליזר וכיבוי בזמן, הפעם, במקביל למדידת תזוזת microspheres הצירי בזמן אמת. מרכז הבמה באזור ליניארי, המהווה את הנקודה שבה עקירת Z היא גדולה ביותר.
5. לאחר יישור זהיר בכיוון Z, זה הכרחי כדי לבדוק שהמלכודת עדיין מרוכזת במישור XY. אם יישור XY השתנה, יש לחזור על שניהם XY ויישור Z עד microsphere מרוכז כראוי לאורך כל שלושצירים.
6. למתיחת ה-DNA, להגביר את עוצמת הליזר על ידי שליחת אות מתח לAOD, בין 0 ל 0.5 V V בצעדים של 0.025 V. בכל שלב, שיא 400 מסגרות ב100 FPS והממוצעים להשיג עקירה הצירית.
7. העקומות המאריכות הכח עכשיו ניתן להתוות ותתאמנה למודל modified WLC ¹¹ (ראה חומרים משלימים B).

5. נציג תוצאות:

אנו מציגים עקומות הארכת תוקף למשך רצפי DNA: 1298 BP ורצף 247 נ"ב, האחרון להיות רצף הקצר ביותר שהצלחנו למתוח reproducibly. לפרקים קצרים של דנ"א, השרשרת הקונבנציונלית דמוית תולעת (WLC) מודל אינו מסבירה באופן מלא את יחסי הארכת התוקף כי בסולמות אורך אלה יש להסביר תופעות סופית בגודל ובהארכת תוקף אפס נובעת מאילוצי גבול. המדידות המאריכות הכח, ולכן, צריכות להיות בכושר תוך שימוש במודל שונה WLC שיש effective אורך התמדה וסיומת כוח אפס כפרמטרים לנכון, שתוארו בהרחבה בחומרים המשלימים. עבור אורכי גובה גדולים של dsDNA, אורך ההתמדה היעיל הוא פשוט האורך הנומינלי ההתמדה (~ 50 ננומטר) וסיומת הכח אפס יכול להיות מוזנחת. עם זאת, כאורך קווי המתאר מתקצר אורך ההתמדה האפקטיבית פוחת הרבה מתחת 50 ננומטר ו-DNA, גם בכוח אפס, מראה הרחבה משמעותית.

את הנתונים ואת ההתקפים המקבילים של עקומי המאריכים הכח מוצגים באיור. 5 עבור שני הרצפים. מעדכון WLC המתאים, קבע את אורכי ההתמדה היעילים להיות 35 ננומטר ל1298 BP-DNA ו25 ננומטר לדנ"א 247 נ"ב. לשם המחשה, אנו מציגים אמצעים יחידים של העקומות המאריכות הכח לכל רצף. בפועל, אפשר הייתה לחזור על המדידות מספר פעמים ולקבל את התוצאות הממוצעות יחד עם סטיות ההתקן. זה חייב גם לציין thaלא לאחר הקבלה כל עקומה זה הכרחי כדי להבטיח שנשאר לכודי microsphere וממוקם כראוי בתוך אזור יניארית, אחרת microsphere יש realigned כפי שתואר לעיל בפרוטוקול.

עיקרון איור 1 מתוך פינצטה אופטית צירית. (שמאל) מלכודת פינצטה אופטית קונבנציונלית קרובה למוקד. החרוז ולאחר מכן עבר לרוחב לcoverslip להפעיל מתח. (מימין) בפינצטה אופטית צירית, microsphere לכוד הרחק מהפוקוס, באזור ליניארית של הפוטנציאל האופטי. בתצורה זו, הפולימר מתקיים במתח מתמיד למגוון סיומות. יתר על כן, להגדיל את עוצמת הליזר נע microsphere בכיוון הצירי.

ייצוג סכמטי של איור 2מלקט צירי אופטי ליזר אור (1064nm Nd: YvO _4). מחולק לשתי אלומות על ידי עובר דרך מקטב האלומה ספליטר (PBS). קרן המניפולציה, עוברת דרך הטיה acousto אופטית (AOD) וקרן הכיול יכולה להיות מותאמת באופן עצמאי באמצעות עדשות טלסקופיות. שתי הקורות מכן recombined שימוש אחר PBS וממוקד על ידי המדגם אובייקטיבי NA גבוה. במקביל, brightfield תאורה משמשת למעקב microsphere, עובר דרך הדגימה, הוא אינפרא אדום (IR) המסונן ולאחר מכן הוא צלם בשתי מצלמות, אחת מהן לוקחת מדידות ואילו מעשים האחרים, כחלק ממערכת בקרת משוב.

איור כיול מיקום 3 צירי. כדי לכייל את העמדה הצירית, אנו לרכוש תמונות מטושטשות של חרוז הדבוק לcoverslip הקאמרי בשינוי עמדות ציריות של הבמה. הגודל של מייקרוphere ניתן על ידי את המרחק בין המרכז שלה ועמדתה של עוצמת שיא על הטבעת הבהירה נוצרה סביב דמותו של microsphere. ההבלעה מציגה את התפלגות העוצמת הרדיאלי אשר נותנת את הגודל של החרוז.

איור 4 עיקרון מאחורי מיפוי הפוטנציאל האופטי. כדי למפות את הכח האופטי של קרן המניפולציה, העקירה הצירית שהוא גורם בmicrosphere לכוד בתוך אלומת כיול הרבה יותר חזקה נמדדת. מרכז אזור יניארי שבו ההעברה הזאת מקסימום הוא ממוקם. החיל האופטי לעומת עקומת עמדה צירית יכול להיות משולב כדי למצוא את הפוטנציאל האופטי.

Curve האיור 5 חיל הארכה. נתונים יוצג למשך 1298 נ"ב אקראי ו247 BP (הבלעה) segmenלא של dsDNA נמתח על ידי פינצטה אופטית צירית. נקודתי הנתונים שתתאמנה לעדכון WLC המודל של משוואה. 3 (קווים מלאים) והניבו אורכי התמדה אפקטיביות של 34 ננומטר ו 25 ננומטר לבהתאמה 1298bp ו247bp.

Discussion

פינצטה אופטית קונבנציונלית להסתמך על משוב או אנלוגי או מבוקר מחשב להפעיל כוח קבוע על אובייקט refractile. מערכות משוב פעילים אלו יש קושי בביצוע בתנאים שבו שינויים פתאומיים בהארכה את הדגימה מתרחשים, למשל, מההתקשרות של חלבון ל-DNA או הקפיצה המהירה של מנוע מולקולרי לאורך חוט. שיטות פסיביות שונות להחלת כוחות קבועים שלאחרונה פותחו. שיטה אחת כזו, המשמשת כדי לפתור את הקפיצה של RNA פולימראז ברזולוצית basepair, מעורבת עובדת בתוך האזור ליניארית של הפוטנציאל האופטי של גאוס ליזר ¹² קורה. יש לנו שיטה זו התאימה למניפולציה של ביומולקולות הקצרה על ידי יצירת פינצטה אופטית צירית מתמיד בכוח.

פינצטה אופטית צירית יכולה לשמש כדי לחקור מותחים קצרה של דנ"א שאינם נגישים למניפולציה על ידי שיטות אופטיות קונבנציונליות. הם כבר השתמשו לרחג'ודי האלסטיות של מולקולות דנ"א קצרות קטן כמו כמה מאה זוגות בסיסים ⁸ וכדי לחקור את ההשפעות של מתח אלסטי בדנ"א חלבון בתיווך לולאות ^13,14. על סולמות אורך קצרים, השפעות תלויות רצף הנובעים משינויים בקשרי מימן ואנרגיות לערום, יכולות מאוד לתרום את תכונות האלסטיות של ה-DNA. פינצטה אופטית צירית היא כלי אידיאלי לגילוי התופעות תלויות רצף הדנ"א האלה על גמישות ^15. יתר על כן, פינצטה אופטית צירית תהיה כלי רגיש ללימוד הגלישה של ה-DNA סביב ההיסטונים בודדים ועבור לחקור את פעילותו של כל מנוע מולקולרי במהירות עיבוד, והוכיחה את עוצמה כטכניקה חדשה בעל ערך בארגז כלי המולקולה בודדה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.