S'étendant de courtes séquences d'ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Summary

Nous illustrons l'utilisation d'une constante de force axiale pinces optiques pour étudier les propriétés mécaniques des molécules d'ADN courts. En étirant l'ADN axialement, nous minimisons empêchements stériques et des artefacts liés à la manipulation latérale conventionnelle, ce qui nous permet d'étudier les molécules d'ADN plus court ~ 100 nm.

Abstract

Une seule molécule d'ADN techniques d'étirement des longueurs de contour moins d'un kilobases sont marquées par des difficultés expérimentales. Cependant, de nombreux événements intéressants biologiques tels que fixation sur les histones et les protéines médiée par boucle d'ADN ^1,2, se produisent sur ​​cette échelle de longueur. Ces dernières années, les propriétés mécaniques de l'ADN ont été montré à jouer un rôle important dans les processus cellulaires fondamentaux comme l'empaquetage de l'ADN dans les nucléosomes compacts et des fibres de chromatine ^3,4. De toute évidence, il est alors important de comprendre les propriétés mécaniques de courts tronçons de l'ADN. Dans cet article, nous proposons un guide pratique pour une technique simple molécule optique tweezing que nous avons développé pour étudier le comportement mécanique de l'ADN avec des longueurs de contour aussi courts que quelques centaines de paires de bases.

Le principal obstacle à étirer courts segments d'ADN, c'est que les pinces optiques classiques sont généralement conçus pour appliquer une force dans une direction latéral à l'étape ^5,6, (voir Fig. 1). Dans cette géométrie, l'angle entre le bourrelet et la lamelle couvre-objet, dans laquelle l'ADN est attaché, est très raide pour l'ADN de longueur inférieure au micron. La position axiale doivent maintenant être pris en compte, ce qui peut être un défi, et, depuis l'extension entraîne la microsphère près de la lamelle, effets stériques sont améliorées. En outre, en raison de l'asymétrie des microsphères, des extensions latérales génère différents niveaux de couple due à la rotation de la microsphère dans le piège optique depuis la direction de la force de réaction pendant les changements de l'extension.

D'autres méthodes de l'ADN submicronique étirement se heurtent à leurs propres obstacles uniques. Par exemple, un piège à double faisceau optique est limitée à l'étirement d'ADN d'environ une longueur d'onde, au cours de laquelle les effets d'interférence de points entre les deux pièges et de diffusion de la lumière entre les microsphères commence à poser un problème important. Remplacer l'un des piègesavec une micropipette serait très probablement souffrir de problèmes similaires. Si l'on peut utiliser directement le potentiel axiale d'étirer l'ADN, un schéma de rétroaction active serait nécessaire pour appliquer une force constante et la bande passante ce sera très limitée, en particulier à de faibles forces.

Nous contourner ces problèmes fondamentaux en tirant directement l'ADN loin de la lamelle à l'aide d'une force axiale constante de pinces optiques ^7,8. Ce résultat est obtenu en piégeant le bourrelet dans une zone linéaire du potentiel optique, lorsque la force est constante optique-dont la force peut être ajustée par réglage de la puissance du laser. Piégeage à l'intérieur de la région linéaire sert aussi de tout optique de force de serrage sur l'ADN qui s'étend depuis près de 350 nm dans la direction axiale. Nous simultanément compenser la dérive thermique et mécanique par le réglage fin de la position de la platine de telle sorte que d'une microsphère de référence collée sur la lamelle couvre-objet reste à la même position et orientation, unellowing pour une période d'observation pratiquement illimitées.

Protocol

1. Pince à épiler Setup

1. Le faisceau d'un laser à 1064 nm est séparé en deux faisceaux polarisés orthogonalement. On est habitué à manipuler la biomolécule tandis que l'autre est utilisée à des fins d'étalonnage (voir Fig. 2).
2. L'intensité du faisceau est commandée par la manipulation d'un déflecteur acousto-optique (OD), tandis que la position et l'orientation de chaque faisceau est commandé indépendamment par des miroirs d'orientation du faisceau et de télescopes optiques, respectivement.
3. Les faisceaux sont ensuite recombinés avec un autre séparateur de faisceau polarisant et en outre conditionnée par un ensemble final de l'optique télescopiques à peu trop remplir l'ouverture arrière de l'objectif de microscope. Un trop-plein 50% pour le faisceau d'étalonnage mène à une trappe étanche optique, tandis qu'un facteur légèrement inférieur à la largeur de manipulation, d'environ 20%, donne une orientation superficielle qui se traduit par une plus grande région réalisable du potentiel linéaire. Les poutres sont étroitement focalisé par une Planapo 60x/1.4 obj microscope à immersion d'huilecace sur la cellule échantillon.
4. Cette configuration pincettes est combiné avec un microscope à champ clair foyer construit qui fournit l'éclairage d'une lampe halogène focalisé sur la chambre de mesure par un condenseur. L'image à fond clair est séparée de la lumière laser par un miroir dichroïque, puis reproduite sur deux caméras CCD. On agit comme nos CCD principal moyen d'acquisition de données et le logiciel est déclenché pour donner des taux d'échantillonnage précis, tandis que l'autre CCD est utilisée pour l'image d'une microsphère de référence unique coincé dont la position sert de système de rétro-contrôle pour compenser la dérive dans le microscope.
5. L'échantillon est grossièrement positionné par rapport à l'objectif d'une table XY, et peut ensuite être positionné avec précision par un noyé trois dimensions piézo-étape.
6. La lumière laser diffusée vers l'avant et transmise est recueillie par le condenseur fond clair et concentré sur un photodétecteur. Le signal résultant est filtré à travers un filtre anti-repliement à 100 kHz, amplifié et uncquired à 200 kHz avec une carte DAQ.

2. Calibrage taille apparente de la perle de la position axiale

1. Chargez une chambre ⁹ échantillon avec une solution en dispersion de 800 nm de diamètre microsphères de polystyrène dilué dans du tampon phosphate salin. Laisser reposer pendant 10-15 minutes, puis rincer légèrement avec un tampon pour enlever l'excédent de microsphères.
2. Localiser une microsphère de manière aléatoire collé à la lamelle et régler la hauteur de la chambre de mesure jusqu'à ce que la microsphère est d'environ 1 um en dessous de la mise au point afin de générer une image défocalisée.
3. Pour mesurer la taille apparente de l'image, tout d'abord trouver le centre de la microsphère en utilisant le modèle géométrique fonction de correspondance dans LabView.
4. Ensuite, générer un profil d'intensité radiale de la microsphère en faisant la moyenne sur 360 ° autour du centre de chaque section transversale. Le profil radial, ce qui correspond à un anneau blanc dans chacune des images en fond clair, peut être équipé d'une fonction quadratique de trouverun pic de luminosité. La distance entre ce sommet et le centre peut être utilisé comme une mesure de la taille apparente du bourrelet.
5. En utilisant la piezostage calibré, augmenter progressivement la position axiale de la microsphère et acquérir une image à chaque position axiale par la caméra CCD.
6. Répéter l'analyse d'image pour chaque image successive de corréler la taille apparente de la microsphère avec son emplacement axial (voir Fig. 3). La résolution axiale obtenue par la méthode est d'environ 1,4 nm ^7.

3. Cartographie du potentiel optique du faisceau de manipulation

1. Commencez par aligner le faisceau colinéaire manipulation et le faisceau d'étalonnage. Le faisceau d'étalonnage devrait être autour de 50 mW à l'ouverture arrière de l'objectif pendant que le faisceau de manipulation devrait être beaucoup plus faible, soit 10 mW.
2. Avec le faisceau de manipulation éteint, confiner une microsphère libre dans le piège beaucoup plus rigide du faisceau d'étalonnage.
3. Maintenant, tournez sur la manifaisceau pulation. Depuis le faisceau de manipulation est beaucoup plus faible que le faisceau d'étalonnage, la position axiale de la microsphère sera légèrement perturbé. Le changement résultant dans une position axiale peut être mesurée à partir des images en fond clair defocused déjà décrites.
4. Désactiver le faisceau de manipulation et de la microsphère encore piégés dans le faisceau d'étalonnage, recentrer le faisceau axial de l'étalonnage en réglant la lentille télescopique. Activer le faisceau de manipulation, la mesure de déplacement ultérieur de la microsphère et la répétition.
5. L'AX déplacements peut être relevée en position axiale de la focalisation du faisceau d'étalonnage. La position axiale correspondant à la plus grande cylindrée de la microsphère détermine le centre de la zone linéaire du piège optique (voir Fig. 4).
6. La dernière étape de l'obtention de la force optique du faisceau de manipulation en fonction de la position axiale nécessite une attention de mesure de la rigidité de l'faisceau d'étalonnage. Pour obtenir cela, déplacer la microsphère, piégés par le faisceau d'étalonnage, à environ un micromètre au-dessus de la surface de réglage de la lentille télescopique tandis que le faisceau de manipulation est mis hors tension.
7. Enregistrer le mouvement thermique axiale de la microsphère en mesurant l'intensité de la lumière transmise à un photodétecteur.
8. L'auto-corrélation du signal peut être équipé d'une fonction de décroissance exponentielle simple de donner la constante de temps des fluctuations,. Τ _z
9. Le coefficient de frottement hydrodynamique ζ, de la microsphère peut être corrigée pour la proximité microsphères à un ^5,10 en surface. La rigidité de la trappe d'étalonnage est alors donnée par κ _z = ζ / _z (τ matériaux supplémentaires voir A et B).
10. Connaissant la raideur de la trappe d'étalonnage permet de convertir les déplacements axiaux précédemment mesurées dans une population ƒ _z = κ _z AX intégration de this courbe donne une cartographie spatiale du potentiel axiale optique du faisceau de manipulation (voir Fig. 4).

4. L'étirement d'un échantillon d'ADN

1. Monter la chambre ⁹ contenant des molécules d'ADN de surface asservies (<1 kpb) et, tout en observant l'image à fond clair, de placer le foyer du faisceau légèrement supérieure à la manipulation non étiré microsphères en ajustant le télescope. Puis ajuster la position de la platine jusqu'à ce que l'un des microsphères est piégé.
2. Positionner grossièrement la microsphère au centre du plan XY du piège optique. Générer une série d'ondes carrées dans LabView et les envoyer à l'AOD de façon répétitive tourner le faisceau laser sur et en dehors. Soigneusement contrôler l'intensité du laser et la durée de l'état d'empêcher le chauffage de la chambre de mesure. En règle générale, l'utilisation d'environ 2 mW de puissance laser (mesurée à l'ouverture arrière de l'objectif) et envoyer des impulsions de 200 ms (marche) et 500 ms (éteinte). L'amplitude de la place wave envoyé à l'AOD devrait être d'environ 0,5 V.
3. Regarder la microsphère que le piège est sans cesse sous tension et hors tension et noter si le laser induit une direction préférentielle au mouvement de la microsphère. Tout en réglant la position de manière itérative à la fois dans la microsphère directions X et Y, en contrôlant le piezostage, le mouvement aléatoire de la microsphère doit devenir isotrope dans le plan XY, mais sensiblement limité lorsque le laser est en marche.
4. Ensuite, aligner le bourrelet dans la direction Z. Nouveau pulser le faisceau laser sur et hors tout, cette fois, à mesurer simultanément le déplacement axial des microsphères en temps réel. Centre de la scène à l'intérieur de la région linéaire, qui est le point où le déplacement Z est le plus grand.
5. Après un alignement soigneux dans la direction Z, il est impératif de vérifier que le piège est toujours centrée dans le plan XY. Si l'alignement XY a changé, à la fois l'alignement XY et Z doit être répété jusqu'à ce que la microsphère est bien centré sur les troisaxes.
6. Pour l'étirage de l'ADN, la rampe de l'intensité du laser par l'envoi d'un signal de tension à l'OD, de 0 V à 0,5 V par pas de 0,025 V. Dans chaque étape, record 400 trames à 100 images par seconde et les moyens pour obtenir le déplacement axial.
7. Les courbes de force d'extension peuvent maintenant être tracée et s'adapter à un modèle modifié de WLC ¹¹ (voir Matériel supplémentaire B).

5. Les résultats représentatifs:

Nous présentons des courbes de vulgarisation de force pour deux séquences d'ADN: un pb 1298 et une séquence de 247 pb, cette dernière étant la plus courte séquence, nous avons été en mesure d'étirer de manière reproductible. Pour de courts tronçons de l'ADN, le classique Worm-Like Chain (WLC) modèle n'explique pas entièrement la relation d'extension vigueur parce que, à ces échelles de longueur, il faut tenir compte des effets de taille finie et de vulgarisation force nulle résultant de contraintes de limitation. Les mesures d'extension de force, doivent donc être ajusté en utilisant un modèle modifié WLC qui a une effive longueur de persistance et d'une extension vigueur zéro comme paramètres d'ajustement, décrits plus loin dans les documents supplémentaires. Pour des longueurs de contour de grandes ADNdb, la longueur de persistance efficace est tout simplement la longueur de persistance nominale (~ 50 nm) et l'extension vigueur zéro peut être négligée. Cependant, comme la longueur du contour devient plus courte est la longueur de persistance effective diminue bien en dessous de 50 nm et l'ADN, même sous la force de zéro, montre une extension significative.

Les données et les ajustements correspondants des courbes d'extension de force sont présentés sur la Fig. 5 pour les deux séquences. De la WLC modification s'inscrit, nous avons déterminé les longueurs de persistance efficaces à 35 nm pour l'ADN 1298 bp et 25 nm à 247 pb d'ADN. À titre d'illustration, nous présentons des mesures individuelles des courbes de force d'extension pour chaque séquence. Dans la pratique, on pourrait répéter les mesures plusieurs fois et d'obtenir les résultats moyens ainsi que les erreurs-types. Il faut aussi noter that après l'obtention de chaque courbe, il est impératif de s'assurer que la microsphère reste piégé et correctement positionné dans la région linéaire, sinon la microsphère doit être réaligné comme décrit précédemment dans le protocole.

Figure 1: Principe de axiales pinces optiques. (Gauche) conventionnel piège pinces optiques au voisinage du foyer. La perle est ensuite déplacé latéralement à la lamelle d'exercer une tension. (À droite) en axiales pinces optiques, une microsphère est piégé loin de la mise au point, dans la région linéaire du potentiel optique. Dans cette configuration, le polymère est maintenu sous tension constante pour une gamme d'extensions. En outre, l'augmentation de l'intensité du laser se déplace la microsphère dans la direction axiale.

Représentation schématique de la figure 2Axiales pinces optiques de lumière laser (1064 nm Nd: YVO _4). Est divisé en deux faisceaux en passant à travers un séparateur de faisceau polarisant (PBS). La manipulation de faisceau, passe à travers un déflecteur acousto-optique (OD) et le faisceau d'étalonnage peut être réglé indépendamment en utilisant des lentilles télescopiques. Les deux faisceaux sont ensuite recombinés en utilisant un autre PBS et focalisé sur l'échantillon par un objectif de haute NA. Simultanément, en fond clair d'éclairage utilisé pour suivre la microsphère, traverse l'échantillon, est infrarouge (IR) et est ensuite filtré imagée par deux caméras CCD, dont l'une prend les mesures tandis que l'autre dans le cadre d'un système de commande à rétroaction.

La figure 3 étalonnage position axiale. Pour étalonner la position axiale, on acquiert des images défocalisées d'un cordon collé à la chambre de lamelle à différentes positions axiales de la scène. La taille de la microsphère est donnée par la distance entre son centre et la position de l'intensité du pic de l'anneau lumineux formé autour de l'image de la microsphère. L'insert présente la répartition d'intensité radiale qui donne la taille de la perle.

La figure 4 principe de cartographie du potentiel optique. Pour tracer la force optique du faisceau de manipulation, le déplacement axial qu'il induit sur ​​une microsphère piégé dans un faisceau d'étalonnage est beaucoup plus forte mesurée. Le centre de la région linéaire, où ce déplacement est maximum est situé. Le Groupe optique vs courbe de position axiale peut être intégrée à trouver le potentiel optique.

Figure 5 Courbe Extension de la Force. Données sont communiquées pour 1298 un hasard pb et 247 pb (en médaillon) Segment d'ADN double brin tendu par axiales pinces optiques. Les points de données ont été ajustées au modèle WLC modification de l'équation. 3 (trait plein) et a donné la persistance des longueurs effectives de 34 nm et 25 nm respectivement pour le 1298bp et 247bp.

Discussion

Pinces optiques classiques invoquer supporte rétroaction analogique ou commandé par ordinateur pour appliquer une force constante sur un objet réfringent. Ces systèmes de rétroaction actifs ont du mal à effectuer dans des conditions où des changements brusques de l'extension de l'échantillon se produire, par exemple, à partir de la liaison d'une protéine à l'ADN ou l'intensification rapide d'un moteur moléculaire le long d'un filament. Diverses méthodes passives d'application de forces constants ont été récemment développées. Une telle méthode, utilisée pour résoudre l'intensification de l'ARN polymérase à une résolution de paires de bases, consistait à travailler dans la région linéaire du potentiel optique d'un faisceau laser gaussien ^12. Nous avons adapté cette méthode pour la manipulation de biomolécules courtes en créant une force axiale constante pinces optiques.

Axial pinces optiques peuvent être utilisés pour étudier courts segments d'ADN qui sont inaccessibles à la manipulation par les méthodes classiques optiques. Ils ont été utilisés pour study l'élasticité de molécules d'ADN courts aussi petite que quelques centaines de paires de bases ⁸ et de sonder les effets de tension élastique sur médiée par une protéine ADN boucles ^13,14. Sur des échelles de longueur courte durée, les effets de séquence à charge découlant des variations de la liaison hydrogène et les énergies d'empilement, peut fortement contribuer aux propriétés élastiques de l'ADN. Axial pinces optiques sont un outil idéal pour la découverte de ces effets dépendent de séquence d'ADN le ¹⁵ élasticité. En outre, axiales pinces optiques sera un outil adapté à l'étude de l'emballage de l'ADN autour des histones individuelles et pour sonder l'activité de n'importe quel moteur de traitement rapide moléculaire, et se révélera être une technique nouvelle et précieuse dans la boîte à outils molécule unique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.