Summary
우리는 짧은 DNA 분자의 기계적 성질을 탐험 할 수있는 일정한 힘을 축 광 핀셋의 사용을 보여줍니다. 축 방향으로 DNA를 스트레칭함으로써, 우리는 우리 ~ 100 nm의 짧은으로 DNA 분자를 연구 할 수 있습니다 steric hindrances 및 종래의 측면 조작하여 발생하는 유물을 최소화합니다.
Abstract
이하 kilobase보다 윤곽 길이의 DNA에 이르는위한 단일 분자 기술은 실험 어려움이 따른다 있습니다. 그러나, 이러한 히스톤 구속력과 DNA 1,2의 단백질로 인한 루핑 등 여러 흥미로운 생물학적 이벤트가,이 길이 규모 발생합니다. 최근에는 DNA의 기계적 성질은 소형 nucleosomes와 염색질 섬유 3,4로 DNA의 패키징과 같은 기본적인 세포 과정에 중요한 역할을하는 표시되었습니다. 분명 DNA의 짧은 뻗어의 기계적 성질을 이해 한 후 중요합니다. 이 논문에서, 우리는 몇 백 basepairs 짧은 등의 윤곽 길이와 DNA의 기계적 동작을 연구 개발 한 단일 분자 광 tweezing 기술에 실질적인 가이드를 제공합니다.
DNA의 짧은 세그먼트를 스트레칭의 주요 장애물은 기존의 광 핀셋은 일반적으로 directio에 힘을 적용하도록 설계되어 있습니다N 무대 5,6에 측면 (그림을 참조하십시오. 1). 이 구조에서, 구슬과 coverslip 사이의 각도는, 그 DNA가 묶여있다하기 위해, submicron의 길이 DNA 매우 가파른됩니다. 축 위치는 현재 확장 가까이 coverslip에 microsphere를 끌 때문에, steric 효과가 향상되고 도전이 될 수있는 차지, 그리고해야합니다. 또한, 마이크로의 비대칭의 결과로, 측면 확장 생성합니다 확장 중에 반응성 힘 변화의 방향부터 광학 트랩 내에 인해 microsphere의 회전에 토크의 수준을 변화.
스트레칭 submicron의 DNA에 대한 대체 방법은 자신의 고유 한 장애물에 반대하는 실행합니다. 예를 들어, 듀얼 빔 광학 트랩이되는 두 트랩 사이 마이크로 사이의 빛의 분산에서 포인트 간섭 효과 큰 문제를 일으킬하기 시작, 파장 주위의 DNA에 이르는으로 제한됩니다. 트랩 중 하나를 교체micropipette으로 가능성이 가장 높은 유사한 문제로 고통 것입니다. 사람이 직접 DNA을 향상시킬 수있는 축 잠재력을 사용할 수 있지만, 적극적인 피드백 체계는 일정한 힘이의 대역폭은 특히 낮은 힘에서 매우 제한됩니다를 적용 할 필요됩니다.
우리는 직접 일정한 힘을 축 광학 핀셋 7,8를 사용하여 coverslip에서 떨어져 DNA를 당겨 이러한 근본적인 문제를 회피. 이 문제는 광학 힘이 일정한 힘있는이 레이저 파워를 조정하여 조정 될 수 있습니다 광학 가능성 선형 지역의 구슬을 수집에 의해 달성된다. 선형 영역 내에 트래핑은 또한 축 방향으로 약 350 나노 미터에 대한 확장 DNA에 모든 광학 힘 - 클램프 역할을합니다. coverslip에 붙어 참조 microsphere가 동일한 위치와 초점에 남아 있도록 동시에 정교하게 무대의 위치를 조정하여 열 및 기계적 드리프트 보상거의 무한 관찰 기간 동안 llowing.
Protocol
1. 핀셋 설정
- 1064 nm의 레이저에서 빔은 두 개의 직교 편광 빔으로 분할되어 있습니다. 하나는 다른이 (그림을 참조하십시오. 2) 보정 목적으로 사용되는 동안 생체 분자를 조작하는 데 사용됩니다.
- 각 빔의 위치 및 포커스가 독립적으로 각각 빔 조향 거울과 광학 망원경에 의해 제어되는 동안 조작 빔의 강도는 음향 광학 향기 (AOD)에 의해 제어됩니다.
- 빔 그런 다음 다른 편광 빔 스플리터와 재결합하고 약간 현미경 대물의 뒷면 조리개를 너무 많이 넣다하기 위해 텔레 스코핑 광학의 마지막 세트에서 추가로 에어컨이 있습니다. 조작 빔에 대한 약간 작은 요소, 약 20 %가 선형 잠재력 큰 실행 가능한 영역으로 변환하는 얕은 초점을 제공하면서 보정 빔을위한 50 % 너무 많이 넣다가 꼭 광학 트랩에 연결됩니다. 빔은 단단하게 PlanApo 60x/1.4 오일 집중 현미경 OBJ에 중점을두고 있습니다샘플 셀에 ective.
- 이 핀셋 설정은 콘덴서에 의해 샘플 챔버에 초점을 맞춘 할로겐 램프의 조명을 제공하는 홈 구축 brightfield 현미경과 결합되어 있습니다. brightfield 이미지는 이색 성 거울로 레이저 빛으로부터 분리 후 두 CCD 카메라에 이미징된다. 다른 CCD는 이미지를 가진 위치 현미경에서 드리프트를 보상하도록 피드백 제어 시스템 역할을하는 단일 붙어 참조 microsphere에 사용되는 동안 하나의 CCD 데이터를 취득 우리의 주요 수단으로 역할을하고, 정확한 샘플링 속도를 얻을 수 있도록 실행 소프트웨어입니다.
- 샘플 coarsely XY 스테이지의 목적과 관련하여 위치하고 정확하게 포함 된 입체 압전 단계에 위치 할 수 있습니다.
- 앞으로 분산 및 전송 레이저 광은 brightfield 응축기이 수집하여 광 검출기에 초점을 맞추고 있습니다. 그 결과 신호는 100 kHz에서에서 안티 앨리어싱 필터를 통해 필터링 증폭되고DAQ 카드를 사용하여 200 kHz에서에서 cquired.
2. 축 방향 위치에 비드의 확실한 크기를 보정
- 이 인산염에 희석 800 nm의 직경 폴리스티렌 마이크로의 솔루션을 분산과 샘플 챔버 (9)를로드하는 것은 염분 버퍼. 10-15분에 앉아 후 가볍게 초과 마이크로을 제거하는 버퍼를 플러시 보자.
- 무작위로 coverglass에 붙어 microsphere를 찾아서 microsphere가 defocused 이미지를 생성 할 수있는 초점을 아래에 약 1 μm까지의 샘플 챔버의 높이를 조정합니다.
- 이미지의 명백한 크기를 측정하려면 먼저 LabView에서 기능을 일치 기하학적 패턴을 사용하여 microsphere의 중심을 찾으십시오.
- 다음으로, 각 단면의 중심에 대해 360 °를 평균하여 microsphere의 방사상 강도 프로필을 생성합니다. brightfield 이미지의 각에 흰색 링에 해당하는 방사형 프로필, 찾을 이차 함수 장착 할 수 있습니다밝기 피크. 이 정상과 중심 사이의 거리가 구슬의 명백한 크기의 척도로 사용할 수 있습니다.
- 보정 piezostage를 사용하여 서서히 microsphere의 축 위치를 증가시키고 CCD 카메라 각 축 위치에 이미지를 획득.
- (그림을 참조하십시오. 3)의 축 위치를 microsphere의 명백한 크기를 상관 관계 각 연속 이미지의 이미지 분석을 반복합니다. 방법에 의해 얻은 축 해상도는 1.4 nm의 약 7입니다.
3. 조작 빔의 광학 가능성을 매핑
- collinearly 조작 빔 및 보정 빔을 정렬하여 시작합니다. 조작 빔이 훨씬 약한있을 동안 보정 빔이 목표의 뒤쪽 구멍 50 주변 MW해야 10 MW이라고합니다.
- 조작 빔이 스위치 오프로 교정 빔의 많은 엄격한 트랩 내에서 무료 microsphere를 한정.
- 이제 마니 켜pulation 빔. 조작 빔이 보정 빔보다 훨씬 약한이기 때문에, microsphere의 축 위치는 약간 어리둥절합니다. 축 위치에 결과 변경으로 이미 설명 defocused brightfield 이미지에서 측정 할 수 있습니다.
- 조작 빔을 해제하고 여전히 보정 빔에 갇힌 microsphere와 함께 망원경 렌즈를 조정하여 보정 빔의 축 포커스를 이동. , 조작 빔을 켜 microsphere와 반복의 후속 변위를 측정합니다.
- 변위의 ΔX는 보정 빔의 초점의 축 위치에 역모를 꾸몄다 할 수 있습니다. microsphere의 가장 큰 변위에 해당하는 축 위치는 광학 트랩의 선형 지역 (그림을 참조하십시오. 4)의 중심을 결정합니다.
- 축 위치의 함수로 조작 빔의 광학 힘을 얻기의 마지막 단계의 강성을주의 깊게 측정이 필요보정 빔. 이를 구하려면 조작 빔이 스위치 오프 상태에서 망원 렌즈를 조정하여 표면 위의 마이크로 미터 주위에 보정 빔에 갇혀 microsphere를, 이동합니다.
- 광 검출기로 전송 빛의 강도를 측정하여 microsphere의 열 축 움직임을 기록합니다.
- 신호의 자기 상관가 변동의 일정한 시간을 부여 하나의 지수 감쇠 함수에 장착 할 수 있습니다. τ Z
- 유체 마찰 계수 ζ, microsphere의 대부분은 표면 5,10에 마이크로 근접을 위해 수정 될 수 있습니다. 보정 트랩의 강성 그 다음 κ Z = ζ / τ Z (참조 보충 자료 A와 B)에 의해 주어진다.
- 교정 트랩의 강성을 아는 것은 한 힘 ƒ으로 생의 Z = κ Z ΔX 통합 이전에 측정 축 변위를 변환 할 수 있습니다S 커브가 조작 빔의 축 광학 가능성 (그림을 참조하십시오. 4)의 공간 매핑을 산출.
4. DNA 샘플 스트레칭
- 챔버 (9)가 포함 된 표면이 닿는 DNA 분자를 (<1 kbp) 마운트하고, brightfield 이미지를 관찰하면서 망원경을 조정하여 약간 unstretched 마이크로 위의 조작 빔의 초점을 배치합니다. 그런 다음 마이크로 중 하나가 갇혀 될 때까지 무대의 위치를 조정합니다.
- 대략 광학 트랩의 XY 평면의 중심에있는 microsphere의 위치. LabView의 광장 파도의 일련을 생성하고 반복적으로 레이저 빔을 켜거나 끌 AOD로 보낼 수 있습니다. 조심스럽게 레이저 및 샘플 챔버의 가열을 방지하기에 국가의 기간의 강도를 제어합니다. 일반적으로, 레이저 전력 (목적의 뒤쪽 구멍에서 측정) 2 MW 주위에 사용하고 200 밀리 초 (에서), 500 MS (해제)의 펄스를 보낼 수 있습니다. 광장 w의 진폭번가는 AOD로 전송하면 0.5 주변해야 V.
- 함정이 반복적으로 해제 켜져되어로 microsphere를 감상하고 레이저 microsphere의 움직임에 어떤 특혜 방향을 유도하는 경우 확인합니다. 반복적으로 X와 Y 방향 모두에서 microsphere 위치를 조정하는 동안 piezostage을 제어하여 microsphere의 임의의 움직임은 레이저가 켜져있을 때하지만 현저하게 제한 XY 평면에서 등방성 수있게됩니다.
- 다음, Z 방향으로 구슬을 맞 춥니 다. 이 시간, 동시에 실시간으로 마이크로 축 변위를 측정하면서 다시 레이저 빔을 맥박과 해제. 선형 지역 내 센터 무대되는데,이 Z 변위가 가장 높은 지점입니다.
- Z 방향으로 신중 정렬 후 트랩 여전히 XY 평면에 중심 있는지 확인하기 위해 필수적입니다. XY 정렬이 변경 한 경우 microsphere가 세 따라 적절히 중심으로 될 때까지, XY와 Z 정렬 모두 반복해야합니다축.
- DNA에 이르는를 들어, 그들을 축 변위를 얻기 위해 기록, 0.025의 단계 V. 각 단계에서 0 V에서 0.5 V까지 AOD 400 100 프레임의 프레임과 평균 전압 신호를 전송하여 레이저 강도를 두는.
- 힘 확장 곡선은 이제 (B 보충 자료 참조) 해본 및 수정 WLC 모델 11에 맞게 할 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
1298 BP와 247 BP 순서, 우리는 reproducibly 신축 할 수 있었던 가장 짧은 시퀀스되는 후자 : 우리는 두 개의 DNA 시퀀스에 힘 확장 곡선을 제시한다. 이 길이 저울에 하나는 유한 크기의 효과와 경계 제약에서 발생하는 제로 힘 연장을 설명해야하기 때문에 DNA의 짧은 뻗어 들어, 기존의 웜 형태의 체인 (WLC)이 모델은 완전히 힘 확장 관계를 설명하지 않습니다. 힘 확장 측정 그러므로 effecti이 수정 WLC 모델을 사용하여에 맞게해야지속성 길이와 보충 자료에 자세한 설명 적합한 매개 변수로 제로 힘을 확장하고있어. dsDNA 큰 윤곽 길이를 들어, 효과적인 지속성 길이는 단순히 명목상의 지속성 길이 (~ 50 nm 정도)과 제로 힘을 확장 무시 될 수 있습니다. 그러나 윤곽 길이가 짧아 해짐에 따라, 효과적인 지속성 길이는,은 50 나노 미터 및 DNA 아래 감소도 영 힘에 따라, 상당한 확장을 보여줍니다.
힘 확장 곡선의 데이터와 해당 맞게이 그림에 표시됩니다. 두 시퀀스에 대해 5. 수정 WLC 맞는부터, 우리는 효과적인 지속성 길이는 1,298 BP DNA와 247 BP의 DNA 25 나노 35 나노 미터로 결정했습니다. 설명의 목적을 위해, 우리는 각 순서의 힘 확장 곡선의 한 대책을 제시하고 있습니다. 실제로, 하나는 측정을 여러 번 반복하여 표준 오류와 함께 평균 결과를 얻을 것입니다. 그것은 THA도 주목해야합니다t 각 곡선을 취득 후에는 microsphere 이전에 프로토콜에 설명 된대로 달리 microsphere가 realigned해야합니다 선형 영역 내에 갇혀 올바른 위치에 유지되도록 필수적입니다.
축 방향 광학 족집게의 그림 1 원칙. (왼쪽) 초점 근처 종래의 광학 핀셋 트랩. 구슬 그런 다음 장력을 발휘하는 coverslip으로 측면 이동합니다. (오른쪽) 축 광 핀셋에서 microsphere는 광학 가능성의 선형 영역에서, 초점에서 떨어져 갇혀있다. 이 구성에서는 폴리머는 확장 범위에 대한 지속적인 긴장에서 개최됩니다. 또한, 레이저 강도를 증가하면 축 방향으로 microsphere를 이동합니다.
의 그림 2 도식 표현축 방향 광학 족집게 레이저 광 (1064nm ND : YvO 4). 편광 빔 스플리터 (PBS)를 통과하여 두 기둥으로 분할되어 있습니다. 조작 빔, 음향 광학 편 향기 (AOD)를 통해 전달하고 보정 빔은 망원경 렌즈를 사용하여 독립적으로 조정할 수 있습니다. 두 빔 그런 다음 높은 NA의 목적으로 다른 PBS를 사용하여 재결합 및 샘플에 중점을두고 있습니다. 동시에, brightfield 조명이 microsphere를 추적하는 데 사용, 샘플을 통과 필터링 (IR) 적외선이며, 다음 피드백 제어 시스템의 일부로서 다른 행위 동안 측정을 소요 하나는 두 개의 CCD 카메라에 의해 이미징 있습니다.
3 축 방향 위치 보정을 그림. 축 위치를 보정하기 위해, 우리는 무대의 축 위치를 변화의 챔버 coverslip에 붙어있는 구슬의 defocused 이미지를 획득. 마이크로의 크기phere은 그 중심과 microsphere의 이미지 주위에 형성된 밝은 링에 대한 최고 강도의 위치 사이의 거리에 의해 주어진다. 삽입은 구슬의 크기를 제공하는 레이디 얼 강도 분포를 제공합니다.
광학 가능성을 매핑 뒤에는 네 원리를 그림. 조작 빔의 광학 힘을 매핑하려면이 훨씬 더 강력한 보정 빔 안에 갇힌 microsphere에 유도하는 축 변위가 측정됩니다. 이 변위는 최대 인 선형 지역의 센터에 자리 잡고 있습니다. 축 방향 위치 곡선 대 광학 힘이 광학 가능성을 찾기 위해 통합 할 수 있습니다.
그림 5 강제 확장 곡선. 데이터는 임의의 1298 BP와 247 BP (삽입) segmen에 표시됩니다dsDNA의 t는 축 광학 핀셋으로되었다. 데이터 포인트는 EQ의 수정 WLC 모델에 맞게되었습니다. 3 (고체 라인)과는 1298bp와 247bp 각각에 대해 34 나노 미터 및 25 나노 미터의 효과적인 지속성 길이를 나왔고.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
종래의 광 핀셋은 refractile 개체에 일정한 힘을 적용하는 중 아날로그 또는 컴퓨터 제어의 의견에 의존하고 있습니다. 이러한 적극적인 피드백 시스템은 단백질의 바인딩에서 DNA 또는 필라멘트를 따라 분자 모터의 급속한 스테핑으로, 예를 들어, 어려움 표본의 확장의 급격한 변화가 발생할 조건 하에서 수행되어 있습니다. 일정한 힘을 적용하기위한 다양한 수동 방법이 최근 개발되었습니다. basepair 해상도의 RNA 중합 효소의의 스테핑를 해결하는 데 사용되는 하나의 방법은, 가우스 레이저 빔 (12)의 광학 가능성의 선형 영역 내에서 작업 참여. 우리는 일정한 힘을 축 광 핀셋을 생성하여 짧은 분자의 조작을 위해이 방법을 적응하고 있습니다.
축 광 핀셋은 기존의 광학 방법으로 조작에 액세스 할 수 없습니다 DNA의 짧은 뻗어 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 그들은 성으로 사용 된udy 몇 백 기본 쌍 8과 같은 소형와 단백질로 인한의 DNA에 탄성 장력의 효과를 내기 위해 짧은 DNA 분자의 탄성은 13,14를 루프. 짧은 길이의 비늘에서 수소 결합 및 스태킹 에너지의 변화로 인해 발생하는 순서에 의존 효과는 강력 DNA의 탄성 특성에 참여할 수 있습니다. 축 광 핀셋은 DNA의 탄성 15 일이 순서에 의존 효과를 잠복을위한 이상적인 도구입니다. 또한, 축 광 핀셋은 개인 histones 주변 DNA의 포장을 공부하고 신속하게 처리 분자 모터의 활동을 프로빙에 민감한 도구가 될 것이며, 단일 분자 도구 상자에서 가치있는 새로운 기술로 증명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 축 광학 핀셋과 관련하여 도움이이 원고에게 스트레칭 데이터의 일부를 기여를위한 Dr Yih-팬 첸 감사드립니다. 이 작품은 NSF 부여 PHY-0957293 및 FOCUS 부여 PHY-0114336 후원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| Nd:YVO4 laser | Spectra Physics | T40-Z-106C | |
| Acousto-optic deflector | IntraAction | DTD-274HA6 | |
| Microscope Objective | Olympus | PlanApo | 60X, NA 1.4 |
| Piezo stage | Mad City Labs | Nano-LP100 | XYZ stage |
| CCD camera | PixeLink | PL-A741 | |
| Photodetector | Electro-Optics Tech | ET-3020 | |
| Polystyrene Beads | Spherotech | SVP-08-10 | 800nm, streptavidin coated |
| Anti-digoxigenin | Roche | 11333089001 | From sheep |
| Primers | MWG operon | Custom oligos | One primer: biotin Other : digoxigenin |
| PCR reagents | New England Biolabs | TAQ polymerase, dNTPs | |
| Coverglass | Fisher Scientific | ||
| Other chemicals for buffer | Fisher Scientific | ||
Supplementary Materials |
|||
A. Hydrodynamic Friction C–fficient |
|||
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10: |
|||
where the following shorthand has been introduced: |
|||
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms. |
|||
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration |
|||
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition. |
|||
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model |
|||
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows: |
|||
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 |
|||
where ε is the relative DNA extension.References
- Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D.
- Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches. Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).
- Kaplan, N. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Garcia, H. G. Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2006).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C.
- Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers. Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).
- Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules. Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).
- Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol. Meiners Lab. , University of Michigan. (2011).
- Brenner, H. The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface. Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).
- Marko, J. F., Siggia, E. D.
- Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase. Science. 313, 801-801 (2006).
- Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment. Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).
- Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops. Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).
- Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules. , Forthcoming (2011).
