Stretching brevi sequenze di DNA con pinzette costante forza assiale ottici

Summary

Illustriamo l'uso di una forza costante pinzette ottiche assiali per esplorare le proprietà meccaniche delle molecole di DNA brevi. Con stiramento DNA assialmente, riduciamo al minimo gli ostacoli sterici e manufatti derivanti convenzionale manipolazione laterale, che ci permette di studiare molecole di DNA più corto ~ 100 nm.

Abstract

Singola molecola tecniche di allungamento del DNA di lunghezze di profilo meno di un kilobasi sono irto di difficoltà sperimentali. Tuttavia, molti interessanti eventi biologici come legame istoni e proteine ​​mediata da loop di DNA ^1,2, si verificano su questa scala di lunghezza. In anni recenti, le proprietà meccaniche del DNA hanno dimostrato di giocare un ruolo significativo nel fondamentali processi cellulari come il confezionamento di DNA in nucleosomi compatti e fibre cromatina ^3,4. Chiaramente, è quindi importante capire le proprietà meccaniche dei brevi tratti di DNA. In questo lavoro forniamo una guida pratica di una tecnica singola molecola tweezing ottica che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento meccanico del DNA con lunghezza di contorno più corti a poche centinaia di paia di basi.

L'ostacolo principale che si estende in brevi segmenti di DNA è che convenzionali pinzette ottiche sono generalmente progettati per applicare la forza in un direction laterale alla fase ^5,6, (vedi fig. 1). In questa geometria, l'angolo tra il tallone ed il coprioggetto, a cui il DNA è legato, diventa molto ripida per DNA lunghezza submicron. La posizione assiale deve ora essere rappresentato, che può essere una sfida, e, in quanto l'estensione trascina microsfera più vicino al vetrino, effetti sterici sono migliorate. Inoltre, a causa della asimmetria delle microsfere, prolungamenti laterali genererà diversi livelli di coppia dovuta alla rotazione della microsfera all'interno della trappola ottica poiché la direzione dei cambiamenti forza di reazione durante l'estensione.

Metodi alternativi per il DNA submicron estende correre contro i propri ostacoli unici. Per esempio, una trappola doppio raggio ottico è limitata allo stiramento DNA di circa una lunghezza d'onda, in cui gli effetti di interferenza di punti tra le due trappole e dalla dispersione della luce tra le microsfere iniziano a rappresentare un problema significativo. Sostituzione di una delle trappolecon una micropipetta molto probabilmente soffre di problemi analoghi. Sebbene si possa utilizzare direttamente il potenziale assiale per allungare il DNA, un regime di retroazione attiva sarebbe necessaria per applicare una forza costante e la larghezza di banda di questo è piuttosto limitata, soprattutto a basse forze.

Abbiamo aggirare questi problemi di fondo direttamente tirando il DNA dal vetrino utilizzando una forza assiale costante pinzette ottiche ^7,8. Ciò è ottenuto intrappolando il tallone in una regione lineare del potenziale ottico, in cui la forza ottica è costante la forza che può essere regolato regolando la potenza del laser. Intrappolando all'interno della regione lineare serve anche come un tutto ottico forza-clamp sul DNA che si estende per circa 350 nm in direzione assiale. Abbiamo contemporaneamente compensare la deriva termica e meccanica finemente regolando la posizione della fase in modo che una microsfera riferimento attaccata al vetrino rimane nella stessa posizione e fuoco, unllowing per un periodo di osservazione praticamente illimitata.

Protocol

1. Pinzette di installazione

1. Il fascio di un laser 1064 nm è divisa in due fasci polarizzati ortogonalmente. Uno è usato per manipolare la biomolecola mentre l'altro viene usato per scopi di taratura (vedi fig. 2).
2. L'intensità del fascio di manipolazione è controllato da un acustoottico deflettore (AOD), mentre la posizione e la messa a fuoco di ogni fascio viene controllata indipendentemente da specchi di orientamento del fascio e telescopi ottici, rispettivamente.
3. Le travi vengono poi ricombinati con un altro divisore di fascio polarizzante e condizionato ulteriormente una serie finale di ottiche telescopiche per riempire troppo leggermente l'apertura posteriore dell'obiettivo microscopio. Aletta 50% per il fascio di taratura porta ad una trappola stretta ottico, mentre un fattore leggermente minore per il fascio manipolazione, circa il 20%, dà un focus meno profondo che si traduce in una regione più grande praticità lo potenziale lineare. Le travi sono ben focalizzato da un obj 60x/1.4 microscopio Planapo immersione in oliocace sulla cella campione.
4. Questa configurazione pinzette è combinato con un microscopio casa costruita brightfield che fornisce l'illuminazione di una lampada alogena focalizzata sulla camera campione da un condensatore. L'immagine brightfield è separata dalla luce laser da uno specchio dicroico e poi ripreso da due telecamere CCD. Si agisce CCD come i mezzi primari di acquisizione dati e software è attivato per ottenere frequenze di campionamento precisi, mentre l'altra CCD viene usato per una microsfera singola immagine di riferimento la cui posizione bloccata serve come retroazione sistema di controllo per compensare la deriva nel microscopio.
5. Il campione viene grossolanamente posizionato rispetto all'obiettivo da uno stadio XY, e possono quindi essere posizionati con precisione da una montatura tridimensionale piezo-stadio.
6. La luce laser diffusa in avanti e trasmessa viene raccolta dal condensatore chiaro e focalizzato su un fotorivelatore. Il segnale risultante viene filtrata attraverso un filtro anti-aliasing a 100 kHz, amplificata ecquired a 200 kHz con una scheda DAQ.

2. Calibrazione dimensione apparente del tallone alla posizione assiale

1. Caricare una camera del campione ⁹ con una soluzione di disperdere 800 nm microsfere di polistirene diametro diluito in tampone fosfato salino. Lasciare riposare per 10-15 minuti e poi leggermente a filo con il tampone per rimuovere l'eccesso microsfere.
2. Individuare una microsfera casualmente attaccato al coprioggetti e regolare l'altezza della camera del campione fino a quando la microsfera è circa 1 micron sotto il fuoco per generare una immagine sfocata.
3. Per misurare la dimensione apparente dell'immagine, prima trovare il centro della microsfera utilizzando il modello geometrico corrispondente funzione in LabView.
4. Successivamente, generare un profilo radiale dell'intensità della microsfera facendo la media di 360 ° intorno al centro di ciascuna sezione trasversale. Il profilo radiale, che corrisponde ad un anello bianco in ciascuna delle immagini chiaro, può essere dotato di una funzione quadratica di trovareun picco di luminosità. La distanza tra il picco e il centro può essere usato come misura della dimensione apparente del tallone.
5. Utilizzando il piezostage calibrato, aumentare gradualmente la posizione assiale della microsfera e acquisire un'immagine in ciascuna posizione assiale con la camera CCD.
6. Ripetere l'analisi dell'immagine per ogni immagine successiva correlare la dimensione apparente della microsfera con la sua posizione assiale (vedi fig. 3). La risoluzione assiale ottenuta con metodo è circa 1,4 nm ^7.

3. Mappatura del potenziale ottico del fascio Manipolazione

1. Iniziare collinearly allineando il fascio manipolazione e il fascio di taratura. Il fascio di calibrazione dovrebbe essere di circa 50 mW in corrispondenza dell'apertura posteriore dell'obiettivo mentre il fascio manipolazione dovrebbe essere molto più debole, diciamo 10 mW.
2. Con il fascio manipolazione spento, confinare una microsfera libero all'interno della trappola molto più rigido del fascio di taratura.
3. Ora, accendere la manilazione del fascio. Poiché il fascio manipolazione è molto più debole del fascio di taratura, la posizione assiale della microsfera sarà leggermente perturbata. Conseguente cambiamento di posizione assiale può essere misurata dalle immagini defocused campo chiaro come già descritto.
4. Spegnere il fascio con la manipolazione e microsfere ancora intrappolato nel fascio di taratura, spostare il centro assiale del fascio di taratura regolando la lente telescopica. Accendere la luce manipolazione, misurare lo spostamento successivo della microsfera e ripetere.
5. L'AX spostamenti può essere rilevata in posizione assiale del fuoco del fascio di taratura. La posizione assiale corrispondente alla cilindrata massima della microsfera determina il centro della regione lineare della trappola ottica (vedi fig. 4).
6. Il passo finale per ottenere la forza ottica del fascio manipolazione in funzione della posizione assiale richiede una misurazione accurata della rigidità deltaratura del fascio. Per ottenere questo, spostare la microsfera, intrappolati dal fascio di taratura, a circa un micrometro sopra la superficie regolando la lente telescopica mentre il fascio di manipolazione è spento.
7. Registrare il movimento termico assiale della microsfera misurando l'intensità della luce trasmessa con un fotorivelatore.
8. L'autocorrelazione del segnale può essere montato su una singola funzione di decadimento esponenziale per dare la costante di tempo delle fluttuazioni,. Τ _z
9. Il coefficiente di attrito idrodinamico ζ, della microsfera può essere corretta per la vicinanza microsfere ad una superficie di ^5,10. La rigidità della trappola di calibrazione è dato poi da κ _z = ζ / τ _z (vedi Materiali complementari A e B).
10. Conoscendo la rigidità della trappola di calibrazione consente di convertire gli spostamenti assiali misurate in precedenza in vigore ƒ _z = κ _z Integrazione AX di this produce una curva di mappatura spaziale del potenziale assiale ottico del fascio manipolazione (vedi fig. 4).

4. Stretching un campione di DNA

1. Montare la camera ⁹ contenenti molecole di DNA superficie frenati (<1 kbp) e, osservando l'immagine chiaro, posizionare il fuoco del fascio manipolazione leggermente sopra la stirata microsfere regolando il telescopio. Quindi regolare la posizione della fase finché una delle microsfere è intrappolato.
2. Approssimativamente posizionare il microsfere al centro del piano XY della trappola ottica. Generare una serie di onde quadre in LabView e inviarli al AOD girare ripetutamente il raggio laser e spegnimento. Controllare attentamente l'intensità del laser e la durata dello stato acceso per evitare riscaldamento della camera campione. In genere, utilizzare circa 2 mW di laser di potenza (misurata l 'apertura posteriore dell'obiettivo) e inviare impulsi di 200 ms (on) e 500 ms (spento). L'ampiezza del quadrato wave inviato al AOD dovrebbe essere di circa 0,5 V.
3. Guarda il microsfere come la trappola viene ripetutamente acceso e spento e annotare se il laser non provoca alcuna direzione preferenziale al moto della microsfere di. Mentre iterativamente la posizione microsfere sia nella direzione X e Y, controllando la piezostage, il movimento casuale della microsfera dovrebbe diventare isotropo nel piano XY, sebbene notevolmente limitato quando il laser è acceso.
4. Quindi, allineare il tallone nella direzione Z. Nuovo impulso il raggio laser e spegnimento mentre, questa volta, misurare simultaneamente lo spostamento assiale microsfere in tempo reale. Centro di fase all'interno della regione lineare, che è il punto in cui lo spostamento Z è maggiore.
5. Dopo un attento allineamento nella direzione Z, è imperativo controllare che la trappola è ancora centrato nel piano XY. Se l'allineamento XY è cambiato, sia l'allineamento XY e Z deve essere ripetuta finché la microsfera sia centrata lungo i treassi.
6. Per l'allungamento del DNA, l'intensità del laser rampa inviando un segnale di tensione al AOD, da 0 V a 0,5 V a passi di 0,025 V. In ogni passo, registrare 400 fotogrammi a 100 fps medi e loro di ottenere lo spostamento assiale.
7. Le curve forza di estensione possono essere tracciati e in forma a un modello modificato WLC ¹¹ (vedi Materiali complementari B).

5. Rappresentante dei risultati:

Presentiamo curve forza di estensione per due sequenze di DNA: un 1298 bp e 247 bp di sequenza, quest'ultimo essendo più breve sequenza siamo stati in grado di allungare riproducibile. Per brevi tratti di DNA, convenzionale Worm-Like a catena (WLC) modello non spiega completamente il rapporto forza di estensione perché a queste scale di lunghezza si deve tenere conto per finita dimensioni effetti e l'estensione forza uguale a zero derivanti dai vincoli al contorno. Le misure di forza di estensione, quindi, devono essere in forma con un modello modificato WLC che ha un efficave lunghezza di persistenza e di una forza di estensione pari a zero come parametri di fit, descritti ulteriormente nei materiali supplementari. Per lunghezze contorno grandi dsDNA, la lunghezza effettiva persistenza è semplicemente la lunghezza di persistenza nominale (~ 50 nm) e la forza di estensione zero può essere trascurato. Tuttavia, poiché la lunghezza del profilo si accorcia la lunghezza di persistenza reale diminuisce ben inferiore a 50 nm e il DNA, anche in forza zero, mostra una significativa estensione.

I dati e le crisi corrispondenti curve di estensione delle forze sono mostrati in figura. 5 per le due sequenze. Dal WLC modificato adatta, abbiamo determinato le lunghezze di persistenza efficaci da 35 nm per il 1298 bp del DNA e 25 nm per 247 bp. A scopo illustrativo, stiamo presentando singole misure delle curve di estensione la forza per ogni sequenza. In pratica, si potrebbe ripetere le misure più volte e ottenere i risultati medi insieme con gli errori standard. Si deve anche notare that previo ogni curva è fondamentale garantire che la microsfera rimane intrappolato e posizionati correttamente all'interno della regione lineare, altrimenti la microsfera deve essere riallineata come precedentemente descritto nel protocollo.

Figura 1 Principio della assiali pinzette ottiche. (Sinistra) convenzionale trappola ottica pinzette presso il fuoco. Il tallone viene poi spostato lateralmente alla coprioggetto per esercitare tensione. (Destro) In assiali pinzette ottiche, una microsfera viene intrappolato dal fuoco, nella regione lineare del potenziale ottico. In questa configurazione, il polimero viene tenuto sotto tensione costante per un intervallo di estensioni. Inoltre, aumentando l'intensità del laser sposta il microsfere nella direzione assiale.

Figura 2 Schema delAssiali pinzette ottiche luce laser (1064nm Nd: YVO _4). È divisa in due fasci passando attraverso un divisore di fascio polarizzante (PBS). Il fascio manipolazione, passa attraverso un deflettore acusto-ottico (AOD) e il fascio di taratura può essere regolata in modo indipendente utilizzando lenti telescopiche. I due fasci vengono poi ricombinati utilizzando un altro PBS e focalizzato sul campione da un obiettivo elevata NA. Contemporaneamente, brightfield illuminazione utilizzato per tenere traccia della microsfera, passa attraverso il campione, è infrarossi (IR) viene poi filtrato e ripreso da due telecamere CCD, uno dei quali prende misurazioni mentre gli altri atti come parte di un sistema di controllo in retroazione.

Figura 3 Calibrazione posizione assiale. Per calibrare la posizione assiale, abbiamo acquisire immagini sfocate di un tallone attaccato alla coprioggetto camera a diverse posizioni assiali di fase. La dimensione del microsmosfera è data dalla distanza tra il centro e la posizione del picco di intensità luminosa per l'anello formato attorno all'immagine della microsfera. L'inserto presenta la distribuzione radiale dell'intensità che dà la dimensione del tallone.

Figura 4 principio dietro Mappatura del potenziale ottico. Per mappare la forza ottica del fascio manipolazione, lo spostamento assiale che induce in una microsfera intrappolati all'interno di un fascio di taratura molto più forte è misurata. Il centro della regione lineare dove questo spostamento è massimo si trova. La Forza ottica curva della posizione assiale può essere integrato per trovare il potenziale ottico.

Figura 5 Curva forza di estensione. Dato viene mostrato per una casuale 1.298 bp e 247 bp (nel riquadro) Segment di dsDNA allungato da assiali pinzette ottiche. I punti di dati erano idonei al WLC modificato modello di Eq. 3 (linee continue) e prodotto persistenza lunghezze effettive di 34 nm e 25 nm per la rispettivamente 1298bp e ​​247bp.

Discussion

Pinzette ottiche convenzionali invocare o retroazione analogica o controllato dal computer per applicare una forza costante su un oggetto rifrangenti. Questi sistemi di feedback attivi hanno difficoltà a svolgere in condizioni in cui sbalzi l'estensione del campione si verificano, per esempio, dal legame di una proteina di DNA o il passo rapido di un motore molecolare lungo un filamento. Vari metodi passivi per applicare forze costanti sono recentemente sviluppate. Un tale metodo, utilizzato per risolvere l'intensificazione della RNA polimerasi a risoluzione paio di basi, coinvolto lavorando all'interno della regione lineare del potenziale ottica di un laser gaussiano trave ^12. Abbiamo adattato questo metodo per la manipolazione di biomolecole brevi creando una forza costante pinzette ottiche assiali.

Assiali pinzette ottiche possono essere utilizzati per studiare brevi tratti di DNA che sono inaccessibili a manipolazioni da convenzionali metodi ottici. Essi sono stati utilizzati per study l'elasticità di molecole di DNA brevi piccolo come poche centinaia di coppie di base ⁸ e per sondare gli effetti della tensione elastica su proteina-DNA mediata loop ^13,14. Su scale di lunghezza breve, sequenza dipendente effetti derivanti da variazioni nel legame idrogeno ed energie impilamento, possono fortemente contribuire alle proprietà elastiche del DNA. Assiali pinzette ottiche sono uno strumento ideale per scoprire questi effetti dipendenti dalla sequenza elasticità del DNA ^15. Inoltre, assiali pinzette ottiche sarà uno strumento sensibile per studiare l'avvolgimento del DNA intorno agli istoni individuali e per sondare l'attività di qualsiasi motore in rapida trasformazione molecolare, e si sarebbe rivelato una tecnica nuova e valida nella singola molecola toolbox.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.