Stretching korte sequenties van DNA met Constant Force Axiale optisch pincet

Summary

Wordt het gebruik van een constante kracht axiaal optische pincetten om de mechanische eigenschappen van korte DNA moleculen te verkennen. Door stretching DNA axiaal, minimaliseren we sterische hindernissen en artefacten die in conventionele laterale manipulatie, waardoor we DNA-moleculen te bestuderen zo kort ~ 100 nm.

Abstract

Single-molecule technieken voor stretching DNA van contour lengte minder dan een kilobase zijn beladen met experimentele moeilijkheden. Veel interessante biologische gebeurtenissen zoals histon binding en eiwit gemedieerde DNA looping van ^1,2, later op deze lengteschaal. In de afgelopen jaren zijn de mechanische eigenschappen van DNA aangetoond een belangrijke rol te spelen in fundamentele cellulaire processen zoals de verpakking van DNA in nucleosomen en compact chromatinevezels ^3,4. Duidelijk is dan belangrijk om de mechanische eigenschappen van korte stukjes DNA. In dit artikel geven we een praktische gids voor een single-molecule optische pincet techniek die we hebben ontwikkeld om het mechanisch gedrag van DNA met contour lengtes zo kort als een paar honderd baseparen te bestuderen.

De belangrijkste hindernis in rekken korte segmenten van DNA is dat de conventionele optische pincetten zijn over het algemeen ontworpen om kracht uit te oefenen in een direction lateraal van het podium ^5,6, (zie Fig. 1). In deze geometrie de hoek tussen de hiel en het dekglaasje, waaraan het DNA wordt vastgemaakt, wordt erg hoog voor submicron lengte DNA. De axiale positie moet nu rekening worden gehouden, dat kan een uitdaging zijn, en aangezien de uitbreiding sleept de microsfeer dichter bij de dekglaasje, sterische effecten worden versterkt. Bovendien als gevolg van de asymmetrie van de microsferen zal zijdelingse verlengingen genereren verschillende niveaus koppel door rotatie van de microsfeer in de optische val aangezien de richting van de reactiekracht veranderingen tijdens de extensie.

Alternatieve methoden voor het strekken submicron DNA oplopen tegen hun eigen unieke hindernissen. Zo is een dual-beam optische val beperkt tot rekken DNA van ongeveer een golflengte, waarna interferentie tussen de twee trappen en van lichtverstrooiing tussen de microsferen beginnen een groot probleem vormen. Vervangen van een trapsmet een micropipet hoogstwaarschijnlijk lijden soortgelijke uitdagingen. Men zou rechtstreeks het axiale potentieel om de DNA rekken, een actieve feedback regeling nodig zijn om een ​​constante kracht en de bandbreedte hiervan zeer beperkt, met name bij lage uitgeoefend.

We omzeilen deze fundamentele problemen door direct te trekken van het DNA uit de buurt van het dekglaasje met behulp van een constante kracht axiale optisch pincet ^7,8. Dit wordt bereikt door het vangen van de kraal in een lineair gebied van de optische mogelijkheden, waarbij de optische kracht constante waarvan de sterkte kan worden geregeld door het laservermogen. Vangen binnen het lineaire gebied vormt ook alle optische kracht-klem op de DNA dat zich bijna 350 nm in axiale richting. We gelijktijdig compenseren voor thermische en mechanische drift van fijn instellen van de positie van het werkgebied zodat een verwijzing microsfeer vast aan het dekglaasje blijft op dezelfde positie en focus, eenllowing voor een vrijwel onbeperkte observatieperiode.

Protocol

1. Pincet Setup

1. De bundel van een 1064 nm laser wordt gesplitst in twee orthogonaal gepolariseerde bundels. Een wordt gebruikt om het biomolecuul manipuleren terwijl de andere wordt gebruikt voor kalibratie doeleinden (zie Fig. 2).
2. De intensiteit van de bundel manipulatie wordt gecontroleerd door een acousto-optische deflector (AOD), terwijl de positie en de focus van elke bundel wordt onafhankelijk geregeld door bundelsturing spiegels en optische telescopen, respectievelijk.
3. De balken worden dan opnieuw gecombineerd met een andere polariserende bundelsplitser en verder geconditioneerd door een definitieve reeks telescopische optiek om iets te vol de achterkant opening van de microscoop doelstelling. Een 50% overmaat voor kalibratie bundel tot een strakke optische val, terwijl een iets kleinere factor voor het manipuleren bundel ongeveer 20%, geeft een focus die ondieper vertaalt in een groter werkbare gebied van de lineaire potentieel. De balken zijn strak gericht door een PlanApo 60x/1.4 olie-immersie microscoop objectief op het monster cel.
4. Deze pincet opstelling wordt gecombineerd met een huis gebouwd helderveld microscoop die verlichting biedt van een halogeen lamp gericht op de monsterkamer door een condensor. De helder veldbeeld is gescheiden van het laserlicht door een dichroïsche spiegel en afgebeeld op twee CCD-camera. Een CCD fungeert als primair middel van het verwerven van gegevens en software geactiveerd nauwkeurige bemonsteringsfrequenties geven, terwijl de andere CCD wordt gebruikt om een ​​afbeelding vast referentie microsfeer waarvan de plaats dient als feedback-systeem te compenseren voor drift in de microscoop.
5. Het monster wordt grof gepositioneerd ten opzichte van het doel door een kruistafel, en kan dan nauwkeurig worden gepositioneerd door een ingesloten driedimensionale piezo-stage.
6. De forward-verspreide en verzonden laserlicht wordt verzameld door de helderveld condensor en gericht op een fotodetector. Het resulterende signaal wordt gefilterd door een anti-aliasing filter bij 100 kHz, versterkt encquired bij 200 kHz met een DAQ kaart.

2. Kalibreren schijnbare grootte van de hiel tot axiale positie

1. Plaats een monsterkamer ⁹ met een disperse oplossing van 800 nm diameter polystyreen microsferen verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing. Laat zitten voor 10-15 minuten en dan zachtjes spoelen met buffer om overtollige microsferen te verwijderen.
2. Zoek een microsfeer willekeurig vast aan de dekglaasje en de hoogte van de monsterkamer tot de microsfeer is ongeveer 1 micrometer onder de focus naar een onscherpe afbeelding te genereren.
3. Om de schijnbare grootte van de afbeelding te meten, eerst vinden het centrum van de microsfeer met behulp van de geometrische patroon dat overeenkomt met de functie in LabView.
4. Vervolgens genereert een radiale intensiteitsprofiel van de microsfeer door het gemiddelde 360 ​​° rond het midden van iedere doorsnede. Het radiale profiel, dat overeenkomt met een witte ring in elk van de helderveld beelden kunnen worden voorzien van een kwadratische functie te vindeneen helderheid piek. De afstand tussen deze piek en het centrum kan worden gebruikt als een maat voor de schijnbare grootte van de kraal.
5. Met de gekalibreerde piezostage, geleidelijk de axiale positie van de microsfeer en het verwerven van een beeld bij elke axiale positie van de CCD camera.
6. Herhaal de beeldanalyse voor elk volgend beeld aan de schijnbare grootte van de microsfeer correleren met zijn axiale locatie (zie Fig. 3). De axiale resolutie verkregen volgens methode is ongeveer 1,4 nm ^7.

3. Kaart brengen van de optische potentieel van de Manipulatie Beam

1. Begin met het collinearly het uitlijnen van de manipulatie balk en de kalibratie balk. De kalibratie bundel moet ongeveer 50 mW zich aan de achterzijde apertuur van het objectief terwijl het manipuleren bundel moet veel zwakker bijvoorbeeld 10 mW.
2. Met de manipulatie balk uitgeschakeld, beperken een gratis microsfeer binnen de veel stijver val van de kalibratie balk.
3. Zet nu de manipulation balk. Aangezien de manipulatie bundel is veel zwakker dan de kalibratie bundel zal de axiale positie van de microsfeer iets verstoord. De resulterende verandering in axiale positie kan worden gemeten uit de onscherpe beelden helderveld zoals reeds beschreven.
4. Schakel de manipulatie bundel en de microsfeer nog opgesloten in de kalibratie balk, de axiale focus van de lichtbundel naar kalibratie door aanpassing van de telescopische lens. Zet de manipulatie balk meet de daaropvolgende verplaatsing van de microsfeer en herhaal.
5. De verplaatsingen AX kan worden uitgezet tegen de axiale positie van de focus van de bundel kalibratie. De axiale positie die overeenkomt met de grootste verplaatsing van de microsfeer bepaalt het midden van het lineaire gebied van de optische trap (zie Fig. 4).
6. De laatste stap in het verkrijgen van de optische werking van de manipulatie bundel als functie van de axiale positie vereist een zorgvuldige meting van de stijfheid van dekalibratie balk. Om dit te verkrijgen bewegen de microsfeer, gevangen door de kalibratie straal rond een micrometer boven het oppervlak door aanpassing van de telescopische lens terwijl de manipulatie bundel wordt uitgeschakeld.
7. Noteer de thermische axiale beweging van de microsfeer door het meten van de sterkte van het doorgelaten licht met een fotodetector.
8. De autocorrelatie van het signaal kan worden gemonteerd op een enkele exponentiële vervalfunctie de tijdconstante van de schommelingen geven. Τ _z
9. De hydrodynamische wrijvingscoëfficiënt ζ, van de microsfeer kan worden gecorrigeerd voor de microsferen nabijheid van een oppervlak ^5,10. De stijfheid van de kalibratie trap wordt dan gegeven door κ _z = ζ / _z τ (zie aanvullende materialen A en B).
10. Het kennen van de stijfheid van de kalibratie trap kan men de eerder gemeten axiale verplaatsingen te zetten in een kracht ƒ _z = _z κ AX Integratie van this curve geeft een ruimtelijke afbeelding van de axiale optische vermogen van de manipulatie balk (zie Fig. 4).

4. Stretching een DNA-monster

1. Monteer de kamer ⁹ met oppervlakte-gebonden DNA-moleculen (<1 kbp) en, met inachtneming van de helderveld beeld, de focus van de manipulatie balk plaatsen iets boven de niet-uitgerekte microsferen door het aanpassen van de telescoop. Stel vervolgens de positie van het podium totdat een van de microbolletjes is opgesloten.
2. Ongeveer positioneren de microsfeer in het midden van het XY-vlak van de optische val. Genereer een reeks vierkante golven in LabView en stuur ze naar de AOD om herhaaldelijk Richt de laserstraal aan en uit. Zorgvuldig de intensiteit van de laser en de duur van de aan-stand de verwarming van de monsterkamer te voorkomen. Typisch gebruik ongeveer 2 mW laservermogen (gemeten aan de achterkant apertuur van het objectief) en stuurt impulsen van 200 ms (on) en 500 ms (uit). De amplitude van het vierkant wave naar de AOD moet ongeveer 0,5 V.
3. Bekijk de microsfeer als de val wordt herhaaldelijk in-en uitgeschakeld en noteer wanneer de laser veroorzaakt een preferentiële richting om de beweging van de microsfeer's. Terwijl iteratief aanpassen van de microsfeer positie in zowel de X en Y richting, beheersing van de piezostage moet de willekeurige beweging van de microsfeer isotrope worden in het XY-vlak, maar merkbaar beperkt als de laser is.
4. Lijn vervolgens de parel in de Z-richting. Opnieuw pulseren de laserstraal aan en uit, terwijl deze tijd gelijktijdig de microsferen axiale verplaatsing in real time. Center het podium in het lineaire gebied, dat is het punt waar de Z verplaatsing grootst.
5. Na een zorgvuldige uitlijning in de Z-richting, is het noodzakelijk te controleren of de trap nog gericht is in het XY-vlak. Als de XY uitlijning veranderd moeten zowel de XY en Z uitlijning herhaald totdat de microsfeer gecentreerd is in alle drieassen.
6. Voor spanning van DNA, oprit de laser intensiteit door een signaal om de AOD van 0 V tot 0,5 V in stappen van 0,025 V. In elke stap plaat 400 frames op 100 fps en gemiddelde zij de axiale verplaatsing te verkrijgen.
7. De kracht extensie curves kan nu worden uitgezet en geschikt om een aangepaste WLC model ¹¹ (zie aanvullende materialen B).

5. Representatieve resultaten:

We stellen kracht verlenging curven voor twee DNA-sequenties: een 1298 bp en een 247 bp sequentie, de laatste de kortste sequentie hebben we op reproduceerbare rekken. Voor korte stukjes DNA, de conventionele worm-achtige Chain (WLC) model niet volledig te verklaren de kracht extensie relatie omdat op deze lengteschalen moet men goed voor eindige-size effecten en nul kracht uitbreiding als gevolg van randvoorwaarden. De kracht extensie metingen derhalve geschikt te zijn van een gemodificeerde WLC model dat een doeltref heeftve persistentielengte en een nul kracht extensie als fit parameters, verder beschreven in de aanvullende materialen. Voor grote contour lengte van dsDNA, de effectieve persistentielengte is gewoon de nominale persistentielengte (~ 50 nm) en de nul kracht uitbreiding kan worden verwaarloosd. Aangezien de contour lengte korter de effectieve persistentielengte daalt minder dan 50 nm en DNA, zelfs onder nul kracht, vertoont een aanzienlijke uitbreiding.

De gegevens en de overeenkomstige passingen van de kracht verlenging curven worden getoond in Fig. 5 voor de twee sequenties. Van de gemodificeerde WLC past, hebben we bepaald de effectieve persistentie lengten 35 nm voor de 1298 bp DNA en 25 nm voor 247 bp DNA. Ter illustratie presenteren we enkele maatregelen van de kracht extensie curves voor elke sequentie. In de praktijk zou men Herhaal de metingen meerdere keren verkrijgen gemiddelde resultaten en de standaardfouten. Het moet ook worden opgemerkt that na elke kromme is het noodzakelijk dat de microsfeer blijft opgesloten en goed in het lineaire gebied, anders de microsfeer moet worden aangepast zoals eerder beschreven in het protocol.

Figuur 1 Principe van Axial optisch pincet. (Links) Conventionele optische pincetten val in de buurt van de focus. De kraal wordt vervolgens zijdelings verplaatst naar het dekglaasje om de spanning uit te oefenen. (Rechts) in axiale optische pincet wordt een microsfeer gevangen afstand van de focus, in het lineaire gebied van de optische potentieel. In deze configuratie wordt het polymeer gehouden onder constante spanning voor een aantal uitbreidingen. Bovendien de laser intensiteit beweegt de microsfeer in de axiale richting.

Figuur 2 Schematische weergave vanAxiale optische pincetten laserlicht (1064 nm Nd: Yvo _4). Wordt gesplitst in twee bundels door passage door een polariserende bundelsplitser (PBS). De manipulatie bundel passeert een acousto-optische deflector (AOD) en de kalibratie bundel kan onafhankelijk worden ingesteld met telescopische lenzen. De twee stralen worden vervolgens opnieuw gecombineerd met een andere PBS en gericht op het monster door een hoge NA doel. Tegelijkertijd helderveld verlichting gebruikt om de microsfeer te volgen, door het monster, is infrarood (IR) gefiltreerd en wordt vervolgens afgebeeld door twee CCD-camera, waarvan metingen neemt terwijl de andere als onderdeel van een feedback controlesysteem.

Figuur 3 axiale positie kalibratie. Om de axiale gekalibreerde positie, verkrijgen we defocused beelden van een kraal vast aan de kamer dekglaasje op verschillende axiale posities van het podium. De grootte van de microsfeer wordt door de afstand tussen het midden en de positie van piekintensiteit over de heldere ring gevormd rond het beeld van de microsfeer. De inzet toont het radiale intensiteitsverdeling die de lasril geeft.

Figuur 4 Principe Achter in kaart brengen van de optische Potentiële. Om in kaart te de optische kracht van de manipulatie balk, wordt de axiale verplaatsing dat het induceert op een microsfeer gevangen in een veel sterkere kalibratie straal gemeten. Het centrum van de lineaire regio waar deze verschuiving is een maximum bevindt. De optische Force vs axiale positie curve kan worden geïntegreerd om de optische mogelijkheden te vinden.

Figuur 5 Force Uitbreiding Curve. De gegevens worden weergegeven voor een willekeurige 1298 bp en 247 bp (inzet) segmentatiet van dsDNA uitgerekt door axiale optisch pincet. De datapunten geschikt waren om de gewijzigde WLC model van Eq. 3 (getrokken lijnen) en een effectieve persistentie lengte van 34 nm en 25 nm leverde de 1298bp en 247bp respectievelijk.

Discussion

Conventionele optische pincetten vertrouwen op analoge of computergestuurde feedback om een ​​constante kracht op refractiele object. Deze actieve feedback systemen moeilijk voeren onder omstandigheden waarbij plotselinge veranderingen in de verlenging van het monster optreden, bijvoorbeeld van de binding van een eiwit aan DNA of de snelle intensivering van een moleculaire motor langs een filament. Diverse passieve methoden voor de toepassing van constante krachten zijn recentelijk ontwikkeld. Een methode gebruikt om de intensivering van RNA polymerase aan basenparen resolutie oplossen die werken in het lineaire gebied van de optische vermogen van een Gaussische laserbundel ^12. We hebben deze methode aangepast voor het manipuleren van korte biomoleculen door een constante kracht axiaal optisch pincet.

Axiale optische pincetten kan worden gebruikt om korte stukjes DNA die niet toegankelijk zijn voor manipulatie door conventionele optische methoden te bestuderen. Zij zijn gebruikt om stUdy de elasticiteit van korte DNA moleculen zo klein als een paar honderd basenparen ⁸ en de gevolgen van elastische spanning op eiwit gemedieerde DNA probe lijnen ^13,14. Op korte lengteschalen sequentieafhankelijk effecten van variaties in waterstofbinding en stapelen energie kan sterk bijdragen tot de elastische eigenschappen van DNA. Axiale optische pincetten zijn een ideaal hulpmiddel voor het blootleggen van deze sequentie-afhankelijke effecten op DNA elasticiteit ^15. Bovendien zal axiale optisch pincet een gevoelige tool voor het bestuderen van de verpakking van DNA rond individuele histonen en voor het sonderen van de activiteit van elke snel verwerking moleculaire motor, en zou blijken te zijn een waardevolle nieuwe techniek in de single-molecule toolbox zijn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.