Summary
我们说明了使用一个恒定的力的轴向光镊探索短的DNA分子的力学性能。轴向拉伸DNA，我们尽量减少在传统的横向操作所产生的立体障碍和文物，使我们能够研究DNA分子的短〜100 nm之间。
Abstract
拉伸DNA的轮廓长度小于一个碱基的单分子技术是充满了实验的困难。然而，许多有趣的生物事件，如组蛋白结合的DNA 1,2和蛋白介导的循环，出现该长度的规模。近年来，DNA的机械性能已被证明是在基本的细胞过程中起到显着的作用类似的包装成紧凑的核小体的DNA和染色质的纤维3,4。显然，这是重要，了解短的DNA片段的力学性能。在本文中，我们提供了一个实用指南如何运用眼线改变单分子光学技术，我们已经开发研究的力学行为与轮廓长度短到几百个碱基对的DNA。
伸展短的DNA片段的主要障碍是，传统的光学镊子的设计，一般使用武力中的directioŇ横向的阶段5,6，（参见图1）。在这种几何形状，胎圈和盖玻片之间的角度，其中DNA是拴，变得很陡的亚微米长度的DNA。必须现在可以占的轴向位置，这可以是一个挑战，并且，由于扩展的微球拖动接近盖玻片，空间位阻效应增强。此外，作为微球的不对称的结果，横向扩展，会产生不同水平的转矩由于由于在延长的方向上的反作用力的变化的光陷阱内的微球的旋转。
拉伸亚微米DNA的替代方法，对自己的独特的障碍。比如，双束光阱是有限的拉伸周围的波长，在该DNA的两个陷阱的点之间的干涉效应和从光散射之间的微球体开始构成了显着的问题，。更换一个陷阱用微量最有可能遭受类似的挑战。虽然人们可以直接使用的轴向电位伸展DNA，有源反馈方案将需要施加一个恒定的力的带宽，这将是相当有限的，尤其是在低力量。
我们规避这些基本问题直接拉的DNA，从盖玻片上使用恒定的力的轴向光镊7,8。这是通过捕集的胎圈在光学势的线性区域，其中的光学力是恒定的强度可以通过调整激光功率调谐。俘获的线性区域内还用作所有的光学近350nm的在轴向方向上延伸的DNA上的力夹紧。我们同时补偿通过微调整的位置的阶段，这样的热性能和机械漂移盖玻片粘贴至一个参考微球保持在相同的位置和焦点，一个llowing一个几乎是无限的观察期。
Protocol
1。镊子设置
- 从1064 nm的激光的光束被分成两个正交的偏振光束。一个用来操纵所述生物分子，而另一种是用于校准的目的（参见图2）。
- 操纵光束的强度的控制由一个声光偏转器（AOD），而每束光的位置和焦点被独立地控制由光束转向反射镜和光学望远镜，分别。
- 的光束，然后再结合另一偏振分束器和最后一组的伸缩光学稍微过量填充背面的显微镜物镜的孔径进一步空调。用于校准光束的50％的过满导致紧的光阱，而略小的因素的操纵光束，约20％，给出了一个浅的焦点，转换成一个较大的可行的区域中的线性电位。梁紧紧围绕一个PlanApo 60x/1.4的油浸显微镜obj的ective到样品池。
- 这镊子设置结合构建家庭提供照明的明视野显微镜，从卤素灯聚焦到样品室由冷凝器。明场图像分离从激光光由分色镜和两个CCD相机成像，然后。一个CCD作为我们采集数据的主要手段是软件触发，得到精确的采样率，而其他CCD使用一个单一的卡住的参考微球的位置作为一个反馈控制系统补偿漂移在显微镜图像。
- 将样品粗定位相对于通过XY载物台的目标，然后，可以精确地定位由一个嵌入三维压电阶段。
- 的前向散射和发射的激光是由明场冷凝器收集，并集中到一个光检测器。过滤由此产生的信号通过一个抗混叠滤波器100千赫，扩增和cquired在200 kHz使用DAQ卡。
2。校准视大小的珠轴向位置
- 装入样品室9的直径为800纳米的聚苯乙烯微球的分散溶液稀释于磷酸盐缓冲盐水。让我们坐10至15分钟，然后轻轻地刷新缓冲区以清除多余的球。
- 找到随机粘贴至盖玻片的微球，和调整的样品腔室的高度，直到大约1微米的微球是下方的焦点以产生散焦的图像。
- 要测量的表观大小的图像，先找到中心的微球在LabVIEW中使用几何图案匹配功能。
- 接着，生成的微球的径向强度的档案通过平均每个横截面的中心的约360°。的径向轮廓，这对应于在每个的明视野图像的白色环，可以配备一个二次函数，找到亮度峰值。此峰和中心之间的距离，可以使用作为衡量的视在尺寸的胎圈。
- 使用校准piezostage，逐渐增加的微球的轴向位置，并在每个轴向位置与CCD摄像机获取的图像。
- 重复的图像分析，对于每个连续的图像相关联的微球的表观大小与它的轴向位置（参照图3）。法求得的轴向分辨率为1.4 nm左右，7。
3。映射的操纵光束的光学势
- 首先通过共线对准的操纵光束校准光束。校准光束操纵束在后面光圈的目标是50毫瓦左右，而应该是弱得多，说10毫瓦。
- 操纵光束关闭，限制一个免费的微球内的校准光束更严厉的陷阱。
- 现在，打开歧管pulation束。由于操纵光束是远弱于校准光束的微球的轴向位置会稍有扰动。如已经描述的散焦的明视野图像，由此产生的轴向位置的变化，可以测量。
- 关闭操作束微球仍被困在校准光束，调整的伸缩式镜头转向轴的校准光束的焦点。打开操纵束，测量后的微位移，并重复。
- 的位移ΔX可以绘制对校准光束的焦点的轴向位置。对应的微球的最大位移的轴向位置确定的线性区域的光阱（参照图4）的中心。
- 的最后步骤中获得的光作为轴向位置的函数的操作束力的刚性，需要仔细的测量校准光束。要获得此，周围的千分尺的表面上方移动的微球，被困由校准束，通过调节的伸缩式镜头，而操纵束关闭。
- 通过测量与光检测器的透射光的强度，记录的微球的热的轴向运动。
- 可安装到一个单一的指数衰减函数的信号的自相关性的波动，得到的时间常数，τZ
- 的液力动压摩擦系数ζ的微球可以被校正为微球接近的表面5,10。然后给出κZ =ζ/τZ（见补充材料A和B）的校准器的刚度。
- 知道校准陷阱的刚度，允许一个先前测量的轴向位移转换成力ƒZ =κŽΔX整合氏s曲线操纵束（参照图4）的轴向的光学势产生的空间映射。
4。拉伸的DNA样品
- 安装室9含有表面拴系的DNA分子（<1 kbp的），并同时观察明场图像，操纵光束的焦点放置略高于未拉伸的微球体通过调整望远镜。被捕获到的微球，然后调整位置的阶段。
- 粗略地定位在微球中的XY平面上的光陷阱中心。产生一系列在LabView方波，和将它们发送到的AOD重复地打开和关闭上的激光束。小心地控制激光的强度和持续时间上的状态的样品腔室，以防止加热。通常情况下，使用约2 mW的激光功率（在后面光圈的客观测量），并传送脉冲的200毫秒（on）和500毫秒（关闭）。的振幅的平方瓦特大街发送到AOD约为0.5 V。
- 关注微球的陷阱反复打开和关闭，注意，如果激光诱导任何优惠的微球的运动方向。虽然迭代调节微球体在X和Y方向的位置，通过控制piezostage，的微球的随机运动应该成为各向同性的在XY平面上，虽然明显的限制，当激光上。
- 接着，在Z方向上对齐胎圈。再次脉冲激光束的开和关，而这个时间，同时测量实时的微球的轴向位移。中心的线性区域内的阶段，这是其中Z位移为最大的点。
- 在Z轴方向进行精心调整后，当务之急是要检查的陷阱仍然集中在XY平面上。如果已经改变，XY对准XY和Z对准的微球必须被重复，直到正确的中心沿三个轴。
- 对于拉伸的DNA，坡道的激光强度的AOD发送的电压信号，从0 V至0.5 V，在步骤0.025 V.在每个步骤中的，记录400在100帧的帧和平均他们获得的轴向位移。
- 力拓曲线可以绘制适合改良的WLC模型11（见补充材料B）。
5。代表性的成果：
力拓曲线的两个DNA序列：一个1298 bp和247 bp的序列，后者在最短的时间序列已经能够伸展重复性的。对于短的DNA片段，传统的蠕虫状链（WLC）模型并不能完全解释力拓的关系，因为在这些尺度必须考虑的有限尺寸效应和零力拓所产生的边界约束。力拓测量，因此，必须要适合使用修改后的WLC模型，其中有一个有效的已经持效期长和零力拓拟合参数的补充材料，进一步说明。对于大的轮廓长度的双链DNA，有效的持久性的长度是简单的名义持续长度（约50 nm）和的零力拓可以忽略不计。然而，作为轮廓的长度变短有效的持久性的长度降低远低于50nm，并且该DNA，甚至零力下，示出了显着的延伸。
的数据和相应的配合力拓曲线示于图中。 5为两个序列。从改性WLC适合，我们已经确定了有效的持久性长度为35 nm的1298 bp的DNA为247 bp的DNA和25 nm。为了说明的目的，我们将呈现的每个序列的力扩展曲线的单一的措施。在实践中，人们会重复测量多次，得到的平均结果与标准误差一起。还必须指出的临屋区t后获得每条曲线，它是必须确保的微球保持捕集并正确定位的线性区域内，否则必须重新调整的微球，如先前描述的协议。
图1（左） 的轴向光镊原理传统的光学镊子陷阱附近的重点。珠，然后横向盖玻片移动，施加张力。 （右）在轴向光镊，微球被困住远离焦点，在光学势的线性区域。在此配置中，该聚合物被保持在恒定的张力下的范围内的扩展。此外，增加的激光强度，在轴向方向上移动的微球。
图2示意图轴向光镊激光灯（1064纳米的Nd：YVO 4）被分成两束，通过通过一个偏振分束器（PBS）。的操纵光束，通过一个声光偏转器（AOD），使用伸缩式镜头校准光束都可以独立调节。的两束，然后重新组合使用另一种的PBS，并聚焦在样品由高NA物镜。同时，明视野照明，用于跟踪的微球，通过样品，是红外（IR），过滤，然后由两个CCD相机，其中之一作为一个反馈控制系统的一部分，而其他行为进行测量成像。
图3轴向定位校准要校准的轴向位置，我们获得了离焦图像珠坚持腔室盖玻片，在不同阶段的轴向位置。的大小的微phere其中心和周围形成的微球的图像的亮环的峰强度的位置之间的距离由下式给出。插图呈现的径向光强分布，其中给出的胎圈的大小。
图4映射原理的光学势。要映射出光操纵束力，在微被困在一个更强大的校准光束，它引起的轴向位移测量。的线性区域的中心，其中该位移是一个最大的位置。可以集成的光学势的光学力与轴向定位曲线。
图5力拓曲线。数据显示为一个随机的1298基点和247基点（插图）节段吨双链DNA拉伸轴光学镊子。适合修改后的WLC模型式的数据点。 3（实线），并取得了有效的持久性为34 nm和25 nm的长度分别为1298bp和247bp。
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Discussion
传统的光学镊子依赖于模拟或电脑控制的反馈上的折光性对象施加一个恒定的力。这些有源反馈系统有困难的其中的突然变化在延长的试样发生的条件下进行，例如，从结合的蛋白质的DNA或一个分子马达沿长丝的快速步进。最近已开发用于施加恒定力的各种无源方法。涉及一种这样的方法，用来解决碱基对组成的RNA聚合酶的步进分辨率的光学势高斯激光束12的线性区域内工作。我们已经适应了这种方法通过创建一个恒力轴向光镊操纵短的生物分子。
轴向光镊可以用来研究短的DNA片段，而无法进入操作用传统的光学方法。它们被用来为ST乌德短的DNA分子的弹性小的几百碱基对8和探测蛋白介导的DNA上的弹性张力的影响循环13,14。在短尺度上，序列依赖效应所产生的氢键和堆积能量的变化，可以做出重大贡献的弹性性质的DNA。轴向光镊是一个理想的工具，发现这些序列依赖的DNA弹性的影响15。此外，轴向光学镊子将是一个敏感的工具，为研究个人组蛋白的DNA周围的包装和用于探测任何快速处理的分子马达的活动，将被证明是一个有价值的新技术，在单分子工具箱。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢陈懿范医生帮助的轴向光镊和他的拉伸数据，这份手稿的贡献。这项工作是由美国国家科学基金会授予的PHY-0957293，FOCUS授予PHY-0114336主办。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| Nd:YVO4 laser | Spectra Physics | T40-Z-106C | |
| Acousto-optic deflector | IntraAction | DTD-274HA6 | |
| Microscope Objective | Olympus | PlanApo | 60X, NA 1.4 |
| Piezo stage | Mad City Labs | Nano-LP100 | XYZ stage |
| CCD camera | PixeLink | PL-A741 | |
| Photodetector | Electro-Optics Tech | ET-3020 | |
| Polystyrene Beads | Spherotech | SVP-08-10 | 800nm, streptavidin coated |
| Anti-digoxigenin | Roche | 11333089001 | From sheep |
| Primers | MWG operon | Custom oligos | One primer: biotin Other : digoxigenin |
| PCR reagents | New England Biolabs | TAQ polymerase, dNTPs | |
| Coverglass | Fisher Scientific | ||
| Other chemicals for buffer | Fisher Scientific | ||
Supplementary Materials |
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A. Hydrodynamic Friction C–fficient |
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For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10: |
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where the following shorthand has been introduced: |
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The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms. |
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B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration |
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The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition. |
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C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model |
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The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows: |
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where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 |
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where ε is the relative DNA extension.References
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