Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

Summary

Se ilustra el uso de una fuerza constante pinzas ópticas axial para explorar las propiedades mecánicas de las moléculas cortas de ADN. Por el estiramiento del ADN axialmente, podemos minimizar los obstáculos estéricos y artefactos procedentes de la manipulación lateral convencional, lo que nos permite estudiar las moléculas de ADN tan corto como ~ 100 nm.

Abstract

Una sola molécula de técnicas para estirar el ADN de longitudes de curvas de nivel a menos de un kilobase están llenos de dificultades experimentales. Sin embargo, muchos eventos interesantes biológicos tales como la unión de histonas y proteínas mediada por un bucle de ADN ^1,2, se encuentran en esta escala de longitud. En los últimos años, las propiedades mecánicas de ADN han demostrado que desempeñan un papel importante en los procesos celulares básicos como el empaquetamiento del ADN en los nucleosomas compacto y fibras de cromatina ^3,4. Es evidente, entonces es importante entender las propiedades mecánicas de los tramos cortos de ADN. En este artículo, ofrecemos una guía práctica de una técnica de depilación de una sola molécula óptica que hemos desarrollado para estudiar el comportamiento mecánico de ADN con una longitud de contorno tan corto como unos pocos cientos de pares de bases.

El principal obstáculo en el estiramiento segmentos cortos de ADN, es que las pinzas ópticas convencionales generalmente están diseñados para aplicar la fuerza en una dirección lateral a la etapa de ^5,6, (véase la Fig. 1.). En esta geometría, el ángulo entre el talón y el cubreobjetos, a la que el ADN está conectado al ordenador, se hace muy fuerte de ADN de longitud submicron. La posición axial ahora deben tenerse en cuenta, que puede ser un desafío, y, puesto que la extensión se prolonga la microesfera más cerca del cubreobjetos, efectos estéricos se han mejorado. Por otra parte, como resultado de la asimetría de las microesferas, extensiones laterales se generan distintos niveles de torque debido a la rotación de la microesfera dentro de la trampa óptica desde la dirección de la variación de la fuerza reactiva en la extensión.

Métodos alternativos para el estiramiento de ADN submicron ejecutar en contra de sus propias barreras. Por ejemplo, una trampa de doble haz óptico está limitado a un estiramiento del ADN de alrededor de una longitud de onda, en la que los efectos punto de interferencia entre las dos trampas y de dispersión de la luz entre las microesferas empiezan a plantear un problema importante. Sustitución de una de las trampas con una micropipeta más probable es que sufren de problemas similares. Mientras que uno podría utilizar directamente el potencial axial para estirar el ADN, un esquema de retroalimentación activa sería necesario aplicar una fuerza constante y el ancho de banda de esta será muy limitado, especialmente en las fuerzas bajo.

Nos evitar estos problemas fundamentales directamente tirar el ADN fuera del cubreobjetos con una fuerza axial constante pinzas ópticas ^7,8. Esto se logra atrapar la bola en una región lineal de la posibilidad de óptica, donde la fuerza óptica es constante, la fuerza de la que se pueden ajustar mediante el ajuste de la potencia del láser. Atrapando dentro de la región lineal también sirve como una fuerza todas las ópticas-clamp en el ADN que se extiende por cerca de 350 nm en la dirección axial. Simultáneamente, compensar la desviación térmica y mecánica finamente ajustar la posición de la etapa para que una microesfera de referencia pegado a la cubreobjetos se mantiene en la misma posición y el enfoque, lo que permite un período de observación prácticamente ilimitadas.

Protocol

1. Pinzas de configuración

1. El haz de un láser de 1064 nm se divide en dos rayos polarizados ortogonalmente. Uno se utiliza para manipular la biomolécula, mientras que el otro se usa para fines de calibración (ver fig. 2).
2. La intensidad del haz de la manipulación se controla mediante un deflector acústico-óptica (AOD), mientras que la posición y la orientación de cada haz se controla de forma independiente por los espejos de orientación del haz y los telescopios ópticos, respectivamente.
3. Los rayos se recombinan con otro divisor de haz polarizante y más condicionada por un conjunto final de la óptica telescópica se llene demasiado poco de la apertura posterior del objetivo del microscopio. Un sobrellenado del 50% para el haz de calibración conduce a una trampa óptica estrecha, mientras que uno ligeramente más pequeño para el haz de la manipulación, aproximadamente el 20%, da un enfoque más superficial que se traduce en una región más grande viable del potencial lineal. Las vigas están muy enfocados en un objetivo 60x/1.4 PlanApo microscopio de inmersión en aceite en la celda de muestra.
4. Esta configuración pinzas se combina con un microscopio de campo claro casa construida que proporciona la iluminación de una lámpara halógena se centró en la cámara de la muestra por un condensador. La imagen de campo claro está separada de la luz láser por un espejo dicroico y luego imágenes de dos cámaras CCD. Un CCD actúa como nuestro medio principal de adquisición de datos y software provocado para obtener tasas precisas de muestreo, mientras que los otros CCD se utiliza para la imagen de una sola de las microesferas pegado de referencia cuya posición sirve como un sistema de retroalimentación de control para compensar la deriva en el microscopio.
5. La muestra es gruesa posicionada con respecto al objetivo de una etapa de XY, a continuación, pueden posicionar con precisión por un piezo integrado en tres dimensiones del escenario.
6. La luz del láser hacia el dispersada y transmitida es recogida por el condensador de campo claro y centrado en un fotodetector. La señal resultante se filtra a través de un filtro anti-aliasing de 100 kHz, se amplifica y adquirido a 200 kHz con una tarjeta de adquisición de datos.

2. Calibrar el tamaño aparente de la posición axial de bolas de

1. Carga una cámara de muestra ⁹ con una solución de dispersar a 800 nm microesferas de poliestireno de diámetro diluido en tampón fosfato salino. Deje reposar durante 10-15 minutos y luego enjuague con tampón ligeramente para eliminar el exceso de microesferas.
2. Localice una microesfera azar pegado a la cubreobjetos y ajustar la altura de la cámara de la muestra hasta la microesfera es de aproximadamente 1 m por debajo del foco para generar una imagen desenfocada.
3. Para medir el tamaño aparente de la imagen, en primer lugar encontrar el centro de la microesfera con el patrón geométrico correspondiente función en LabVIEW.
4. A continuación, generar un perfil de intensidad radiales de la microesfera por un promedio de 360 ​​° sobre el centro de cada sección transversal. El perfil radial, que se corresponde con un anillo blanco en cada una de las imágenes de campo claro, puede ser equipado con una función cuadrática para encontrar un pico de brillo. La distancia entre el pico y el centro se puede utilizar como una medida del tamaño aparente de la cuenta.
5. Utilizando el piezostage calibrado, aumentar gradualmente la posición axial de la microesfera y adquirir una imagen en cada posición axial con la cámara CCD.
6. Repita el análisis de imagen para cada imagen sucesiva de correlacionar el tamaño aparente de la microesfera con su ubicación axial (ver Fig. 3).. La resolución axial obtenida por el método es de alrededor de 1,4 nm ^7.

3. Cartografía del potencial óptico del haz de manipulación

1. Comience por collinearly alinear el haz de la manipulación y el haz de calibración. El haz de calibración debe estar alrededor de 50 mW en la apertura posterior del objetivo, mientras que el haz de la manipulación debe ser mucho más débil, por ejemplo, 10 mW.
2. Con el haz de la manipulación de apagado, confinar una microesfera libre dentro de la trampa mucho más dura de la viga de calibración.
3. Ahora, a su vez en la viga de la manipulación. Puesto que el haz de la manipulación es mucho más débil que el haz de calibración, la posición axial de la microesfera será un poco perturbado. El cambio resultante en la posición axial se puede medir a partir de las imágenes de campo claro desenfocado como ya se describió.
4. Apague el haz de la manipulación y con la microesfera que siguen atrapados en el haz de calibración, cambiar el enfoque axial del haz de calibración mediante el ajuste de la mira telescópica. A su vez en la viga de la manipulación, medir el desplazamiento posterior de la microesfera y repetir.
5. El Dx desplazamientos se pueden trazar en contra de la posición axial del foco del haz de calibración. La posición axial que corresponde a la mayor cilindrada de la microesfera determina el centro de la región lineal de la trampa óptica (ver fig. 4).
6. El último paso en la obtención de la fuerza óptica de la viga de la manipulación en función de la posición axial requiere una cuidadosa medición de la rigidez de lacalibración del haz. Para lograr esto, mover la microesfera, atrapado por el haz de calibración, a alrededor de un micrómetro encima de la superficie mediante el ajuste de la mira telescópica, mientras que el haz de la manipulación se apaga.
7. Registrar el movimiento térmico axial de la microesfera, midiendo la intensidad de luz transmitida con un fotodetector.
8. La autocorrelación de la señal puede ser equipado con una función exponencial decreciente única para dar a la constante de tiempo de las fluctuaciones,. Τ _z
9. El coeficiente de rozamiento hidrodinámico ζ, de la microesfera puede ser corregida por la proximidad de microesferas a un ^5,10 de la superficie. La rigidez de la trampa de calibración está dada por κ _z = ζ / τ _z (ver materiales complementarios A y B).
10. Conociendo la rigidez de la trampa de calibración permite convertir los desplazamientos medidos previamente axial en una fuerza ƒ _z = _z κ Integración Dx de esta curva de rendimientos de una cartografía espacial del potencial axial óptico del haz de la manipulación (ver fig. 4).

4. Estirar una muestra de ADN

1. Monte la cámara de ^{9 que} contiene moléculas de la superficie atados ADN (<1 kpb) y, mientras observa la imagen de campo claro, el lugar en el centro de la viga de la manipulación ligeramente por encima de la estirada microesferas mediante el ajuste del telescopio. A continuación, ajuste la posición de la etapa hasta que una de las microesferas se encuentra atrapada.
2. Más o menos la posición de la microesfera en el centro del plano XY de la trampa óptica. Generar una serie de ondas cuadradas en LabView y los envían a la AOD a su vez, repetidamente el rayo láser encendido y apagado. Con cuidado, el control de la intensidad del láser y la duración del estado a evitar el calentamiento de la cámara de la muestra. Por lo general, el uso alrededor de 2 MW de potencia del láser (medida a la apertura posterior del objetivo) y enviar pulsos de 200 ms (a) y 500 ms (apagado). La amplitud de la onda cuadrada enviado a la AOD debe ser alrededor de 0,5 V.
3. Mira la microesfera que la trampa se dirigió en repetidas ocasiones dentro y fuera y observe si el láser induce una dirección preferencial de movimiento de la microesfera. Mientras iterativa para ajustar la posición de las microesferas, tanto en la dirección X y Y, por el control de la piezostage, el movimiento aleatorio de la microesfera debe ser isótropa en el plano XY, aunque notablemente más restringido cuando el láser está encendido.
4. Luego, alinee el talón en la dirección Z. Una vez más el pulso del rayo láser y fuera al mismo tiempo, esta vez, al mismo tiempo medir el desplazamiento axial de microesferas en tiempo real. Centro de la escena de la región lineal, que es el punto donde el desplazamiento Z es mayor.
5. Después de una cuidadosa alineación en la dirección Z, es imprescindible comprobar que la trampa está centrado aún en el plano XY. Si la alineación XY ha cambiado, tanto en la X, Y y Z la alineación debe ser repetido hasta que la microesfera se centra correctamente en los tres ejes.
6. Para estirar el ADN, la rampa de la intensidad del láser mediante el envío de una señal de voltaje a la AOD, de 0 V a 0,5 V en incrementos de 0,025 V. En cada paso, grabar 400 imágenes a 100 fps y el promedio de ellos para obtener el desplazamiento axial.
7. Las curvas del recorrido de fuerzas ahora se pueden trazar y el ajuste a un modelo modificado de WLC ¹¹ (ver Materiales de apoyo B).

5. Los resultados representativos:

Se presentan las curvas de fuerza de extensión de dos secuencias de ADN: un pb 1298 y una secuencia de 247 pb, siendo esta última la más corta secuencia que hemos sido capaces de estirar de forma reproducible. Para tramos cortos de ADN, la convencional forma de gusano de la cadena (WLC) modelo no explica la relación del recorrido de fuerzas, porque en estas escalas de longitud uno debe tener en cuenta para efectos de tamaño finito y extensión de la fuerza cero derivadas de las restricciones de frontera. Las medidas de extensión de la fuerza, por lo tanto, tiene que estar en forma con un modelo modificado de WLC, que tiene una longitud de persistencia efectiva y una extensión de fuerza cero como parámetros de ajuste, se describe más adelante en el material complementario. Para longitudes de curvas de nivel grande de ADN de doble cadena, la persistencia de longitud efectiva es simplemente la longitud de la persistencia nominal (~ 50 nm) y la extensión de la fuerza de cero puede ser despreciada. Sin embargo, como la longitud del contorno se acorta la longitud de la persistencia efectiva disminuye por debajo de 50 nm y el ADN, incluso por la fuerza a cero, muestra una importante ampliación.

Los datos y los ajustes correspondientes de las curvas de fuerza de extensión se muestra en la figura. 5 para las dos secuencias. Desde el WLC modificado se ajusta, se ha determinado la duración efectiva de la persistencia de 35 nm para el ADN de 1.298 pb y 25 nm de 247 bp de ADN. Para fines ilustrativos, se plantean medidas individuales de las curvas de fuerza de extensión para cada secuencia. En la práctica, se podría repetir las mediciones varias veces y obtener los resultados medios, junto con los errores estándar. También debe tenerse en cuenta THAt después de la obtención de cada curva es imprescindible para asegurar que la microesfera y queda atrapado en la posición correcta dentro de la región lineal, de lo contrario la microesfera debe ser reajustado según lo descrito anteriormente en el protocolo.

Figura 1 Principio de Axial pinzas ópticas. (Izquierda) trampa de pinzas ópticas convencionales cerca del foco. El talón se mueve entonces por fuera del cubreobjetos para ejercer tensión. (Derecha) En axial pinzas ópticas, una microesfera está atrapado desde el foco, en la región lineal del potencial óptico. En esta configuración, el polímero se lleva a cabo bajo una tensión constante para una amplia gama de extensiones. Por otra parte, el aumento de la intensidad del láser se mueve la microesfera en la dirección axial.

Figura 2 Representación esquemática de Axial Pinzas Ópticas láser de luz (1064 Nd: _YVO4). Se divide en dos haces al pasar por un separador de haz de polarización (PBS). El haz de la manipulación, pasa a través de un deflector acústico-ópticos (AOD) y el haz de calibración se pueden ajustar independientemente el uso de lentes telescópicos. Los dos rayos se recombinan con otro PBS y se centró en la muestra por un objetivo de alto NA. Al mismo tiempo, campo claro iluminación utilizada para realizar un seguimiento de la microesfera, pasa a través de la muestra, es la radiación infrarroja (IR), se filtró y luego fotografiada por las dos cámaras CCD, uno de los cuales toma la presión mientras el otro actúa como parte de un sistema de control de retroalimentación.

Figura 3 calibración de la posición axial. Para calibrar la posición axial, adquirimos imágenes desenfocadas de un cordón pegado a la cámara de cubreobjetos en diferentes posiciones de los ejes de la etapa. El tamaño de las microesferas es dada por la distancia entre el centro y la posición de máxima intensidad sobre el anillo brillante formado alrededor de la imagen de la microesfera. En el recuadro se presenta la distribución de intensidad radial que da el tamaño de la cuenta.

Figura 4 principio detrás de Cartografía del potencial óptico. Para un mapa de la fuerza óptica de la viga de la manipulación, el desplazamiento axial que se produce en una de las microesferas atrapadas dentro de un haz de calibración mucho más fuerte que se mide. El centro de la región lineal en este desplazamiento es de un máximo se encuentra. El grupo de óptica frente a la curva posición axial se pueden integrar para encontrar el potencial óptico.

Figura 5 Curva de Extensión de la Fuerza. Los datos se muestran de forma aleatoria 1.298 pb y 247 pb (recuadro) segmento de ADN de doble cadena se extendía por axial pinzas ópticas. Los puntos de datos se ajuste al modelo modificado WLC de la ecuación. 3 (línea continua) y cedió la longitud efectiva la persistencia de 34 nm y 25 nm, respectivamente, para el 1298bp y 247bp.

Discussion

Pinzas ópticas convencionales se basan en información ya sea analógico o controlados por ordenador para aplicar una fuerza constante en un objeto refractantes. Estos sistemas de captación activa tiene dificultades para realizar en condiciones en que los cambios repentinos en la extensión de la muestra se producen, por ejemplo, de la unión de una proteína en el ADN o la intensificación rápida de un motor molecular a lo largo de un filamento. Varios métodos pasivos para la aplicación de fuerzas constantes se han desarrollado recientemente. Uno de estos métodos, se utiliza para resolver la intensificación de la ARN polimerasa a una resolución de pares de bases, se trabajó en la región lineal del potencial óptico de un haz láser Gaussiano ^12. Hemos adaptado este método para la manipulación de biomoléculas corto mediante la creación de una fuerza axial constante pinzas ópticas.

Axial pinzas ópticas se pueden utilizar para estudiar tramos cortos de ADN que son inaccesibles a la manipulación de los métodos convencionales de óptica. Se han utilizado para estudiar la elasticidad de las moléculas cortas de ADN del tamaño de una base de unos pocos cientos de pares ⁸ y para investigar los efectos de la tensión elástica en el ADN de proteínas mediada por lazos de ^13,14. En las escalas de corta duración, los efectos derivados de la secuencia depende de las variaciones en el enlace de hidrógeno y apilamiento de las energías, fuerte puede contribuir a las propiedades elásticas del ADN. Axial pinzas ópticas son una herramienta ideal para el descubrimiento de estos efectos depende de la elasticidad de la secuencia de ADN ^15. Por otra parte, axial pinzas ópticas será una herramienta sensible para el estudio de la envoltura del ADN alrededor de histonas individuales y para probar la actividad de cualquier motor molecular rápido de procesamiento, y demostraría ser una técnica nueva y valiosa en la caja de herramientas de una sola molécula.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction C–fficient
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 where ε is the relative DNA extension.