Summary
В этом протоколе метод измерения внутриклеточного белка рефолдинг после теплового шока описан. Этот метод может быть использован для изучения foldases как молекулярных шаперонов и их ко-факторы или соединений, способных влиять на их деятельность. Firefly активности люциферазы используется в качестве репортера для измерения активности шаперона рефолдинг.
Abstract
Этот протокол описывает метод для измерения ферментативной активности молекулярных шаперонов в клеточной системе и возможные последствия соединений с тормозным / стимулирующей деятельности. Молекулярная шаперонов являются белки, участвующие в регуляции сворачивания белка 1 и играют решающую роль в обеспечении выживаемости клеток на стресс оскорбления, как тепловой шок 2, питательных голода и воздействия химических веществ / яды 3. По этой причине шаперонов оказываются вовлечены в события, как развитие опухоли, chemioresistance раковых клеток 4, а также нейродегенеративные 5. Дизайн малых молекул способен подавлять или стимулировать активность этих ферментов является одной из наиболее изученных стратегий для лечения рака 7 и нейродегенеративные расстройства 9. Анализ описанных здесь предлагает возможность измерения рефолдинг деятельности частности молекулярный шаперон и изучение влияния компounds о своей деятельности. В этом методе ген молекулярных шаперонов исследуемый трансфицированных вместе с кодировкой вектор экспрессии для генов люциферазы светлячка. Это уже описано, что денатурированный люциферазы светлячка можно сложил на молекулярных шаперонов 10,11. Как нормализации трансфекции контроля, вектор кодировки для renilla люциферазы гена трансфекции. Все трансфекции, описанные в этом протоколе выполнены с X-Treme Ген 11 (Roche) в НЕК-293 клеток. На первом этапе, синтез белка подавляется обработки клеток циклогексимид. После разворачивания белка индуцирована теплового шока при 45 ° С в течение 30 минут. После восстановления при 37 ° C, белки заново сложить в их активную конформацию и активность люциферазы светлячка используется в качестве считывания: больше света будет произведено, тем больше белка будет повторно приобрел оригинальную конформацию. Номера для тепла шокированы клетки устанавливаются в качестве справочных (100% сложиллюциферазы).
Protocol
1. Посев клетки
- Перед началом разминки культуральной среде, PBS 1X и трипсина в водяной бане при температуре 37 ˚ C
- Возьмите клеток из инкубатора и аспирата среды.
- Осторожно применять 5 мл ФСБ 1X на клетки, чтобы вымыть их.
- Аспирируйте PBS 1X и закапывать по 1 мл трипсина содержащие 0,025% ЭДТА.
- Плавно поворачивайте пластины имеют равномерное распределение трипсина.
- Место клеток в инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение 5-10 минут (в зависимости от типа клеток). Время от времени проверять, если клетки отделяются путем встряхивания пластины.
- Ресуспендируют клеток в 10-20 мл среды и собрать их в трубки 50 мл сокола.
- Граф клетки с помощью счетчика Beckman. Число клеток должно быть достаточно для обеспечения слияния около 60-70%.
- Пластина клеток и позволяют им семян в течение 6-8 часов.
2. Трансинфекцией
- До трансфекции, разогреть аликвоту бессывороточной среде в водяной бане при температуре 37 ˚ C.
- Принесите X-Treme Ген 9 до комнатной температуры.
- Внесите бессывороточной среде в 2 пробирки Эппендорф (1 труба = 1 трансфекции).
- Внесите X-Treme Ген 9 в бессывороточной среде обращают внимание, что чаевые не касается пластиковой стеной Эппендорф и инкубировать в течение 5 минут. В то же время подготовить два смесей ДНК: в одной из труб смешиваются плазмид для renilla, светлячков и пустой борьбе с переносчиками, в другой трубке renilla, светлячков и молекулярной провожатым.
- Добавить ДНК смеси для каждого Эппендорф содержащей сыворотки среде без + X-Treme Ген 9, вихревые и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут.
- Добавить по каплям каждой смеси на каждую пластину и инкубировать в течение 24 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2
3. Разделение клетки
- 24 часов после трансфекции, trypsinize клетки, как описано в 1,4 - 1,6 и разбавить их окончательного слияния в пределах 60-70% в 6-луночный планшет.
- Подготовка одной пластины для не шокировало контроль и столько же пластинок время восстановления точек, которые должны быть проанализированы, как показана на рис. 2.
4. Тепловой удар
- Для теплового шока, предварительно теплой сыворотки, содержащей среды в водяной бане при температуре 37 ˚ C.
- Подготовка «теплового шока буфера" путем разбавления в сыворотку, содержащую циклогексимид средней конечной концентрации 20 мкг / мл и MOPS до 20 мм.
- Теперь достаньте пластины из инкубатора и аспирата среды.
- Добавить в каждую лунку по 1 мл 'Heat буфера шок », и инкубировать 30 минут при температуре 37 ˚ С и 5% СО 2 (включает также ссылки пластины в этом лечении). Это остановит заново синтеза белка.
- В то же время переключаться на водяной бане и установить тemperature при 45 ˚ C.
- После инкубации, печать крышка плиты с парафильмом ранее сокращение полос. Ссылка пластины (100% refolfed светлячка) остается в инкубаторе.
- Инкубируйте пластин при 45 ˚ С в течение 30 минут.
- Удалить плит из водяной бане, снимите парафильмом и поставить пластины обратно в инкубатор, чтобы восстановление.
- В каждый момент времени урожай клеток и мыть их в ФБС 1X центрифугированием при 2000Xg течение 1 минуты при 4 ˚ C.
5. Лизису клеток и люциферазы анализа
- Для эффективной лизис клетки, оснастки заморозить осадок клеток в жидком азоте.
- Добавить 200 мкл буфера для лизиса пассивной разбавленный 1:5 в бидистиллированной воды в стеклянной трубке.
- Добавить 30 мкл Клеточный лизат в 96 ячейках. Каждый образец имеет пипеткой в трех экземплярах.
- Только "не шокировало" эталонных образцов будет использоваться длячитать renilla активность люциферазы, так как этот шаг используется для проверки одинаковой эффективностью трансфекции.
- Подготовка решений для анализа. Для решения люциферин разбавленный люциферин до конечной концентрации 0,2 мМ в Gly-Gly буфера. Для реакции буфера разбавления DTT и АТФ в конечной концентрации 1 мМ в Gly-Gly буфера. Для coelenterazine буфера реакции, развести coelenterazine до конечной концентрации 0,2 мкМ в coelenterazine буфера. Хранить раствор люциферин и coelenterazine реакционного буфера защищенном от света.
- Теперь поместите 96-луночного планшета в люминометра и запустите программу "Wallac 1420 Workstation.
- Ввести Pump1 в трубку сокола содержащие coelenterazine решение. Закройте крышку так, без света могут вступать в контакт с трубкой.
- Выберите из меню "Диспенсер обслуживания" и отметьте опцию Pump1.
- Выберите опцию 'Fill'.
- Чтобы изменить расположение пластин выбрать опцию 'Исследуйте протокол и результаты "в меню. Выберите протокол и дважды щелкните по нему. Теперь выберите скважин для чтения.
- Возвращаемся к "Wallac менеджер" и нажмите кнопку "Пуск". Реакция между renilla люциферазы и его субстрата coelenterazine излучает свет с длиной волны пика в 482 нм.
- После чтения, идти на "Диспенсер обслуживания" и выберите "Пустые" и Pump1 освободить всех остаточных решение вернуться к трубе.
- Теперь переместите трубки к трубке сокола, содержащей воду и поставьте галочку "Флеш".
- После промывки шаг, пустые трубки, выбрав "пустой".
- Поместите пробирку с Pump1 в реакционную трубку буфера сокола и один из Pump2 в трубке люциферин сокола.
- Изменение пластины макета.
- Выберите 'Fill' для Pump1 и Pump2 из «ДиСпенсер обслуживания "меню.
- Выберите протокол и начать чтение. Реакция между люциферазы Светлячок и его субстрата люциферин излучает свет с максимальной длиной волны 560 нм.
- В конце чтения повторить процедуру Пустые-Flush пусто при Pump1 и Pump2.
- Результаты теперь доступны в "Wallac 1420 Explorer.
- Каждый эксперимент связан с анализа числа, имя пользователя, начинается и заканчивается день.
- Результаты теперь можно экспортировать в виде файла Excel.
- Для расчетов, клетки делятся на три группы: 1. не-шокированы контрольных образцов (установлен как 100% сложил люциферазы светляков), 2. клетки, не молекулярный шаперон и тепла шокированы, 3. клеток с молекулярным шаперона и тепла в шоке.
6. Представитель Результаты
Белки рефолдинг напрямую связано с временем восстановления Поэтому для проверки, если система работает про perly, анализ должен быть проведен сбор клеток в различные моменты времени. Прямая корреляция времени / процент рефолдинг указывает, что эксперимент был должным образом выполнены и, следовательно, представляет ограничивающим фактором. Однако следует всегда считали, что рефолдинг после теплового шока насыщения событие и, следовательно, надлежащий анализ учебного времени должно быть выполнено перед началом любого эксперимента.
Рисунок 1. Обзор эксперимента. В анализе рефолдинг естественных условиях требуется от 3 до 4 дней будет завершена. На 1-й день клетки высевают и трансфекции. Следующие клетки день разделен на меньшем формате и на 3 день они тепло в шоке. В этот момент можно выполнить люциферазы анализ сразу после уборки клетки или сохранить осадок клеток при -80 ° C и выполнять анализ в другой момент
Рисунок 2. Сотовые расщепления. В день 2 клетки делятся на 6-луночный планшет. Каждый трансфекции будет разбавляться в хорошо для того, чтобы иметь все трансфекции на той же пластинке. Каждая пластина будет соответствовать определенное время восстановления плюс, не шокировало ссылкой пластины.
Рисунок 3. Представителю хороший результат. А. Процент рефолдинг непосредственно измеряется люциферазы светляков деятельности. Каждая гистограмма представляет собой процент рефолдинг в отсутствие (черные полосы) и в присутствии (красные столбики) молекулярного шаперона в различные моменты времени восстановления. Б. Корреляция между временем и рефолдинг в отсутствии (черная линия) и в присутствии (красная линия) провожатым. Г квадрат значения показывают хорошую корреляцию.
В Fig.3A показано репрезентативные результаты, где клетки были собраны 15, 30, 45, 60 и 120 минут после теплового шока в отсутствие (черные полосы) и в присутствии (красные столбики) молекулярных шаперонов. Процент сложил люциферазы увеличивается с длительным временем восстановления и трансфекции молекулярного шаперона. Корреляция между рефолдинг и время для контроля (рис. 3В, черная линия) и молекулярный шаперон-трансфекции клеток (рис. 3В, красная линия) показан.
Рисунок 4. Представителем плохой результат. А. Процент рефолдинг непосредственно измеряется активность люциферазы. Каждая гистограмма представляет собой процент рефолдинг в отсутствие (черные полосы) и в присутствии (красные столбики) молекулярного шаперона в различные моменты времени восстановления. Б. Корреляция между временем и рефолдинг в отсутствие и в присутствии (красная лНИС) из сопровождающих. Г квадрат значения указывают на плохую корреляцию.
На рисунке 4а. Показывает, представитель результат эксперимента не должным образом выполнены. Оба управления (черные полосы) и молекулярный шаперон-трансфекции клеток (красные столбики) не показали увеличение белка рефолдинг со временем. Кроме того, трансфекции молекулярного шаперона не привело к увеличению рефолдинг. Это слабая корреляция подтверждается на рис. 4B показывает т квадрат значения 0,6619 и 0,1882, соответственно, для контроля (черная линия) и молекулярный шаперон-трансфекции клеток (красная линия).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе протокол для измерения активности внутриклеточных рефолдинг молекулярных шаперонов представлена. Весь анализ может быть выполнен в 3-х до 4 дней, как показано на рис обзор. 1.
Надежность и линейность световой сигнал, и светлячка renilla люциферазы представляют собой прочную основу для воспроизводимости протокола.
Важным шагом в анализе является выбор эффективных реагентов трансфекции для обеспечения гиперэкспрессия молекулярного шаперона и люциферазы светлячка. Репортер гены могут поставляться также с другими методами, как аденовирусная инфекция или 12 электропорации. Другой возможностью является использование трансгенной линии клеток, где экспрессия шаперона химически индуцируемой (например, тетрациклин проблематику промоутер) 13, в то время как ген люциферазы светлячка стабильно трансфицированных. Такой широкий спектр оптическихДополнения делает Таким образом, возможно применение анализа до нескольких клеточных линий, включая первичные клетки.
Более того, если клеточная линия особенно чувствительна к циклогексимид лечения, люциферазы светляков перевод белка могут быть арестованы за счет использования репрессируемый / индуцибельной системы.
С рефолдинг активность может меняться в зависимости от молекулярных шаперонов, титрование количество шаперонов быть трансфицированных должно быть всегда. После создания в частности клеточной линии, методика может быть использована для изучения того, как малые молекулы и / или gentic манипуляции могут повлиять шаперона деятельности. Анализ может проводиться также и в меньшем формате, как и 6 - или даже 12-луночного планшета.
Одна из самых привлекательных приложений является возможность протестировать целые библиотеки соединений, которые могут повлиять шаперона деятельности. В данном конкретном случае, клеточные линии, стабильно трансфицированных гена-репортера, а также ч.aperone которые преимущественно используются, чтобы свести к минимуму изменения из-за эффективности трансфекции.
Этот анализ также может быть использован для исследования роли со-активаторов или со-репрессор молекулярных шаперонов белка рефолдинг или как они влияют на рефолдинг на различные стимулы стресса (тепло, окислительный стресс, развернутого белка ответ).
Даже если из клеточной эксперимента можно иметь более физиологических считывание влияния соединений и / или белков на активность шаперона частности, это невозможно количественно шаперона деятельность с анализа здесь представлены. В этом случае было бы более подходящим бесклеточной анализа, как в пробирке рефолдинг количественное определение люциферазы светляков или β-галактозидазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Данило Maddalo является получателем исследования общения как группа молодых следователя (ЖИГ) из Карлсруэ технологический институт.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
