Summary
في هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس البروتين داخل الخلايا refolding بعد الصدمة الحرارية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة foldases مثل المحرمين الجزيئية وتعاونها عوامل أو مركبات قادرة على التأثير على نشاطها. يستخدم يراعة النشاط luciferase كمراسلة لقياس النشاط refolding كوصي.
Abstract
يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس النشاط الإنزيمي للمرافقين الجزيئية في نظام خلية القاعدة والآثار المحتملة للمركبات مع النشاط المثبطة / محفزة. المحرمين الجزيئية هي البروتينات المشاركة في التنظيم من البروتين للطي (1) ويكون لها دور حاسم في تعزيز بقاء الخلية على الشتائم الإجهاد مثل الصدمة الحرارية 2 والتجويع المغذيات والتعرض للمواد الكيميائية / السموم 3. لهذا السبب تم العثور على المحرمين أن تشارك في المناسبات مثل التنمية الورم ، chemioresistance الخلايا السرطانية فضلا عن 4 5 تنكس عصبي. تصميم جزيئات صغيرة قادرة على تثبيط أو تحفز نشاط هذه الانزيمات وبالتالي واحدة من أكثر الاستراتيجيات درس لعلاج السرطان والاضطرابات العصبية 7 9. في مقايسة الموصوفة هنا توفر إمكانية لقياس النشاط refolding من كوصي على وجه الخصوص والجزيئية لدراسة تأثير شركاتounds على نشاطها. في هذا الأسلوب هو transfected الجين من كوصي الجزيئية التحقيق مع تعبير لناقلات ترميز الجين luciferase يراعة. وقد وصفته بالفعل يمكن denaturated يراعة luciferase refolded بواسطة المحرمين الجزيئية 10،11. كما تطبيع السيطرة ترنسفكأيشن ، يتم ترميز transfected ناقلات للجينات في luciferase renilla. يتم تنفيذ كافة transfections الموصوفة في هذا البروتوكول مع الأبله المتطرفة جين 11 (روش) في خلايا - 293 كلوة الجنين البشري. في الخطوة الأولى ، يتم منع تصنيع البروتين عن طريق علاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد. بعد ذلك يتم بفعل بروتين الصدمة الحرارية التي تتكشف في 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد شفائهم عند 37 درجة مئوية ، ويتم إعادة مطوية البروتينات في التشكل بصورة نشطة ، ويستخدم نشاط luciferase يراعة للقراءة المغادرة : سوف تنتج المزيد من الضوء ، سيكون لديك المزيد من البروتين إعادة التشكل اكتسبت الأصلي. يتم تعيين غير حرارة الخلايا صدمت كمرجع (100 ٪ من refoldedluciferase).
Protocol
1. بذر الخلايا
- قبل أن يبدأ الاحماء المتوسطة والثقافة ، وبرنامج تلفزيوني والتربسين 1X في حمام من الماء عند 37 ˚ C
- تأخذ الخلايا من الحاضنة ونضح في المتوسط.
- تطبق بلطف 5 مل من 1X PBS على خلايا لغسلها.
- نضح في برنامج تلفزيوني وتطبيق 1X 1 مل من التربسين التي تحتوي على 0025 ٪ EDTA.
- تدوير لوحة بلطف أن يكون هناك توزيع عادل للالتربسين.
- مكان الخلايا في الحاضنة في 37 ˚ مئوية لمدة 50-10 دقيقة (اعتمادا على نوع من الخلايا). من وقت للتحقق من الوقت إذا فصل الخلايا عن طريق الهز لوحة.
- Resuspend الخلايا في 10-20 مل من المتوسط وجمعها في أنبوب 50 مل الصقر.
- عد الخلايا باستخدام عداد بيكمان. يجب أن يكون عدد الخلايا تكون كافية لضمان التقاء حوالي 60-70 ٪.
- لوحة الخلايا وتسمح لهم البذور لمدة 6-8 ساعات.
2. غير المشبعةfection
- قبل ترنسفكأيشن ، الاحماء an قسامة المصل خالية المتوسطة في حمام الماء عند 37 ˚ C.
- جعل جين الأبله المتطرفة 9 إلى درجة حرارة الغرفة.
- الماصة المتوسط المصل مجانا في أنابيب إيبندورف 2 (1 = 1 ترنسفكأيشن أنبوب).
- الماصة الجينات الأبله المتطرفة 9 في الاهتمام المتوسطة حرة المصل الذي دفع الطرف لا يلمس حائط من البلاستيك إيبندورف واحتضان لمدة 5 دقائق. في غضون ذلك إعداد يمزج الحمض النووي هما : في أنبوب واحد معا مزيج البلازميدات لrenilla ، يراعة ومكافحة ناقلات الفارغة ، في آخر renilla أنبوب ، ويراعة كوصي الجزيئية.
- إضافة مزيج الحمض النووي لكل إيبندورف تحتوي على مصل المتوسطة مجانا + الأبله المتطرفة جين 9 ، واحتضان دوامة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- إضافة قطرة قطرة كل المزيج على كل لوحة واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2
3. انقسام الخلايا
- بعد 24 ساعة tryps ، ترنسفكأيشنinize الخلايا كما هو موضح في 1،4-1،6 وتمييع هذه إلى confluency النهائية 60-70 ٪ في لوحة 6 - جيدا.
- تعد واحدة من أجل لوحة تحكم غير بالصدمة وألواح أكبر عدد ممكن من النقاط الزمنية الانتعاش التي يتعين تحليلها ، وأظهرت كما في الشكل. 2.
4. الصدمة الحرارية
- عن الصدمة الحرارية ، قبل الدافئة التي تحتوي على مصل المتوسطة في حمام الماء عند 37 ˚ C.
- تعد "الصدمة الحرارية العازلة" التي تمييع في المصل سيكلوهيكسيميد المتوسطة التي تحتوي على تركيز لنهائي من 20 ميكروغرام / مل والمماسح إلى 20 ملم.
- تتخذ الآن من أصل لوحات من الحاضنة ونضح في المتوسط.
- إضافة إلى كل 1 مل جيدا "الصدمة الحرارية العازلة ، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ˚ C و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون 2 (تشمل أيضا لوحة الإشارة في هذا العلاج). سوف يتوقف هذا دي نوفو تخليق البروتين.
- في غضون ذلك التبديل في حمام مائي وضبط طنemperature في 45 ˚ C.
- بعد الحضانة ، وختم غطاء لوحات Parafilm مع خفض سابقا في المشارب. تبقى الإشارة لوحة (100 ٪ من يراعة refolfed) في الحاضنة.
- احتضان لوحات في 45 ˚ مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إزالة لوحات من حمام المياه ، وإزالة parafilm ووضع لوحات عودة إلى حاضنة للسماح للانتعاش.
- في كل وقت الحصاد نقطة الخلايا وغسلها في برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي 1X في 2000Xg لمدة 1 دقيقة بمعدل 4 ˚ جيم
5. تحلل الخلية ومقايسة luciferase
- لتحلل الخلايا بكفاءة ، والمفاجئة تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل.
- إضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة السلبي 01:05 المخفف في الماء المقطر مزدوجة في أنبوب زجاجي.
- إضافة 30 ميكرولتر من lysate الخلية في صفيحة 96 أيضا. هو pipetted كل عينة في ثلاث نسخ.
- وسوف تستخدم فقط "غير صدم" لعينات مرجعيةقراءة النشاط renilla luciferase ، حيث يتم استخدام هذه الخطوة للتأكد من كفاءة ترنسفكأيشن متساوية.
- إعداد حلول للمقايسة. من أجل حل luciferin تمييع luciferin إلى تركيز النهائي من 0.2 ملم في الغليسين - الغليسين العازلة. لتخفيف رد فعل العازلة DTT و ATP إلى تركيز 1MM النهائي في الغليسين - الغليسين العازلة. العازلة للتفاعل coelenterazine ، تمييع coelenterazine إلى تركيز النهائي من 0.2 ميكرومتر في coelenterazine العازلة. يبقي الحل luciferin والضوء coelenterazine العازلة رد فعل المحمية.
- مكان الآن لوحة 96 - جيدا في luminometer وبدء برنامج "Wallac 1420 محطة.
- أعرض Pump1 في أنبوب يحتوي على الصقر حل coelenterazine. إغلاق الغطاء لذلك لا يمكن للضوء أن تأتي في اتصال مع أنبوب.
- اختر من القائمة "الصيانة الصيدلي" الخيار والقراد Pump1.
- حدد الخيار "تعبئة".
- لتحرير تخطيط لوحة اختيار الخيار "بروتوكول استكشاف ونتائجها" في القائمة. حدد البروتوكول وانقر مرتين على ذلك. اختر الآن أن تكون قراءة الآبار.
- نعود إلى "مدير Wallac" وانقر على "ابدأ". رد الفعل بين luciferase renilla coelenterazine والركيزة في ضوء تنبعث مع طول موجة الذروة من 482 نانومتر.
- بعد القراءة ، والذهاب على "صيانة مصدر" وحدد "فارغة" والافراج عن جميع Pump1 الحل المتبقية مرة أخرى إلى الأنبوب.
- الآن نقل أنبوب إلى أنبوب الصقر تحتوي على المياه ووضع علامة "تدفق".
- بعد خطوة التنظيف ، تفريغ أنبوب عن طريق تحديد "فارغ".
- وضع أنبوب من Pump1 في أنبوب العازلة الصقر رد الفعل واحد من Pump2 في أنبوب الصقر luciferin.
- تغيير تخطيط لوحة.
- اختر "التعبئة" للPump1 وPump2 من دي 'سبنسر الصيانة "القائمة.
- حدد البروتوكول وبدء القراءة. رد الفعل بين luciferase اليراع وluciferin لها الركيزة تنبعث الضوء مع طول موجة الذروة من 560 نانومتر.
- في نهاية القراءة تكرار الإجراء الخالي - فلوش ، وإفراغ لPump1 Pump2.
- النتائج متوفرة الآن في "مستكشف Wallac 1420.
- ويرتبط كل تجربة لعدد مقايسة ، اسم المستخدم ، تبدأ وتنتهي اليوم.
- ويمكن الآن نتائج يمكن تصديرها كملف اكسل.
- لإجراء العمليات الحسابية ، وتنقسم الخلايا إلى ثلاث مجموعات : 1. عينات مرجعية غير صدم (كما هو 100 ٪ من refolded يراعة luciferase) ، 2. الخلايا دون كوصي الجزيئية والحرارة بالصدمة ؛ 3. الخلايا مع كوصي الجزيئية والحرارة بالصدمة.
6. ممثل النتائج
وهناك علاقة مباشرة refolding البروتين إلى الوقت للانتعاش ولذلك لاختبار إذا كان النظام يعمل الموالية perly ، وهي مقايسة لابد من القيام بجمع الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. ارتباط مباشر الوقت / نسبة refolding يشير إلى أنه قد تم تنفيذ التجربة بشكل صحيح ، ويمثل ذلك عاملا مقيدا. غير أنه ينبغي أن ينظر دائما أن refolding بعد الصدمة الحرارية هو حدث تشبع ، وبالتالي يجب أن يتم تنفيذ دورة تحليل الوقت المناسب قبل البدء في أي تجربة.
الشكل 1 لمحة عامة عن التجربة. في مقايسة refolding فيفو يتطلب 3 إلى 4 أيام ليكتمل. في يوم والمصنفة 1 الخلايا وtransfected. وsplitted الخلايا اليوم التالي في شكل أصغر ويوم 3 هم الحرارة بالصدمة. عند هذه النقطة هو ممكن لتنفيذ مقايسة luciferase اليمين بعد حصاد الخلايا أو لحفظ الخلايا في بيليه -80 درجة مئوية ، وتنفيذ مقايسة في لحظة أخرى
الشكل 2. تقسيم الخلية. في يوم 2 يتم تقسيم الخلايا في لوحة 6 - جيدا. وسوف تضعف كل ترنسفكأيشن في بئر من أجل أن يكون كل ترنسفكأيشن على نفس المائدة. وسوف تقابل كل لوحة إلى وقت معين ، بالإضافة إلى استرداد لوحة مرجع غير بالصدمة.
الشكل 3. نتيجة جيدة الممثل. أ النسبة المئوية للقياس refolding مباشرة النشاط يراعة luciferase. كل مخطط شريط يمثل نسبة refolding في غياب (أشرطة سوداء) وبحضور (الحانات الحمراء) من كوصي الجزيئية في مختلف نقاط وقت الاسترداد. باء الارتباط بين الزمن وrefolding في غياب (الخط الأسود) وجود (خط أحمر) من كوصي. قيم ص التربيعية تبين علاقة جيدة.
في فايويرد على النتائج g.3A ممثل حيث تم جمع الخلايا 15 دقيقة ، 30 ، 45 ، 60 و 120 بعد الصدمة الحرارية في غياب (القضبان السوداء) وحضور (الحانات الحمراء) من كوصي الجزيئية. النسبة المئوية للزيادة refolded luciferase مع مرور الوقت الطويل والانتعاش مع ترنسفكأيشن من كوصي الجزيئية. ويظهر الترابط بين refolding والوقت لمراقبة (الشكل 3B ، خط أسود) والجزيئية كوصي - transfected الخلايا (الشكل 3B ، خط أحمر).
الشكل 4. نتيجة سيئة الممثل. أ النسبة المئوية للقياس refolding مباشرة النشاط luciferase. كل مخطط شريط يمثل نسبة refolding في غياب (أشرطة سوداء) وبحضور (الحانات الحمراء) من كوصي الجزيئية في مختلف نقاط وقت الاسترداد. باء الارتباط بين الزمن وrefolding في غياب وحضور (أحمر لالمعهد الوطني للإحصاء) من كوصي. قيم ص التربيعية تبين علاقة سيئة.
4A الرقم. يظهر نتيجة ممثل تجربة لم تنجز بشكل صحيح. كلا لم تحكم (أشرطة سوداء) والجزيئية كوصي - transfected الخلايا (الحانات الحمراء) لم تظهر زيادة في بروتين refolding مع الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، لم ترنسفكأيشن من كوصي الجزيئية لا يؤدي إلى زيادة refolding. ويؤكد هذه العلاقة السيئة في الشكل. 4B تظهر قيمة ص التربيعية 0.6619 0.1882 على التوالي وللتحكم (الخط الأسود) والجزيئية كوصي - transfected الخلايا (خط أحمر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل هو تقديم بروتوكولا لقياس نشاط الخلايا refolding من المحرمين الجزيئية. ويمكن إجراء فحص كامل في 3 إلى 4 أيام كما هو مبين من خلال نظرة عامة في الشكل. 1.
متانة والخطي من الإشارات الضوئية التي تنتجها يراعة وluciferase renilla تمثل قاعدة صلبة للاستنساخ من البروتوكول.
الخطوة الحاسمة للمقايسة هو الخيار لكاشف ترنسفكأيشن فعالة لضمان overexpression من وكوصي الجزيئية وluciferase يراعة. ويمكن تسليم الجينات المراسل أيضا مع أساليب أخرى مثل 12 أو عدوى الفيروسة الغدانية electroporation. احتمال آخر هو استخدام الخلايا المعدلة وراثيا خط حيث التعبير عن كوصي هو محرض كيميائيا (مثل التتراسيكلين المروج التي تستجيب) 13 ، في حين transfected ستابلي الجين من luciferase يراعة. هذه مجموعة واسعة من OPTIإضافات وبالتالي يجعل من الممكن تطبيق الفحص على خطوط الخلية عدة ، بما في ذلك الخلايا الأولية.
وعلاوة على ذلك ، إذا كان خط خلية حساسة بشكل خاص لعلاج سيكلوهيكسيميد ، يمكن القبض على يراعة ترجمة البروتين luciferase من استخدام repressible / نظام محرض.
منذ refolding النشاط يمكن أن تختلف بين المحرمين الجزيئية ، ينبغي أن تكون معايرة من مبلغ كوصي transfected أن تفعل دائما. متى تم انشاؤه في خط خلية معينة ، ويمكن استخدام هذه التقنية لمعرفة كيف جزيئات صغيرة و / أو تلاعب يمكن أن تؤثر على نشاط gentic كوصي. ويمكن إجراء الفحص أيضا في شكل أصغر ، مثل 6 -- لوحة أو حتى 12 أيضا.
واحد من التطبيقات الأكثر جاذبية هو إمكانية لاختبار مكتبات كاملة من المركبات التي يمكن أن تؤثر على النشاط كوصي. في هذه الحالة بالذات ، وخطوط الخلية transfected ستابلي مع الجين مراسل وكذلك الفصل فيوتستخدم aperone تفضيلي ، من أجل تقليل الاختلافات بسبب كفاءة ترنسفكأيشن.
ويمكن استخدام هذا الاختبار أيضا للتحقيق في تفعيل دور المشارك أو المشاركة في كاظمة من المحرمين الجزيئية في refolding البروتين أو كيفية تأثيرها على محفزات الإجهاد refolding المختلفة (الحرارة ، الاكسدة ، تكشفت استجابة البروتين).
حتى لو كان من تجربة خلية القاعدة من الممكن أن يكون لها قراءات أكثر الفسيولوجية لتأثير المركبات و / أو البروتينات على النشاط كوصي على وجه الخصوص ، فمن غير الممكن لقياس النشاط كوصي مع مقايسة المعروضة هنا. في هذه الحالة سوف يكون أكثر ملاءمة مقايسة خالية من الخلايا في المختبر مثل مقايسة refolding من luciferase يراعة أو β غالاكتوزيداز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
دانيلو Maddalo هو حاصل على زمالة بحثية والفريق محقق يونغ (YIG) من معهد كارلسروه للتكنولوجيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
