Summary
이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.
Abstract
이 프로토콜은 셀 기반 시스템 및 억제 / 자극 활동 화합물의 가능한 영향의 분자 보호자의 효소 활동을 측정하는 방법을 설명합니다. 분자 보호자는 1 접는 단백질의 조절에 관여 단백질이며 열충격 2, 영양 기아와 화학 물질 / 독극물 3 노출과 같은 스트레스를 모욕시 세포 생존을 증진에 중요한 역할을했습니다. 이러한 이유로 보호자는 종양이 개발, 암 세포 4 chemioresistance뿐만 아니라 neurodegeneration 5와 같은 행사에 참여하기 위해 볼 수 있습니다. 이러한 효소의 활동을 억제하거나 자극하는 작은 분자 수있는 디자인 따라서 암 치료 7 neurodegenerative 장애 9 가장 공부 전략 중 하나입니다. 여기에서 설명한 분석은 특정 분자 보호자의 refolding 활동을 측정하고 광고의 효과를 연구하기위한 가능성을 제공합니다그 활동 ounds. 이 방법에서는 조사 분자 보호자의 유전자는 반딧불 루시페라제 유전자에 대한 발현 벡터 인코딩과 함께 transfected이다. 그것은 이미 denaturated 반딧불 루시페라제이 분자 보호자 10,11으로 refolded 수 있습니다 설명했습니다. transfection 제어를 정규화로 renilla 루시페라제 유전자에 대한 벡터 인코딩 transfected이다. 이 프로토콜에 설명된 모든 transfections는 HEK - 293 세포에서 X - treme 진 11 (Roche는)로 수행됩니다. 첫 번째 단계에서 단백질 합성은 cycloheximide와 세포를 치료에 의해 저해됩니다. 이후 전개 단백질은 30 분 동안 45 ° C에서 열 충격에 의해 유발됩니다. 37 복구시 ° C는 단백질이 다시 접혀들의 적극적인 형태로와 반딧불의 루시페라제의 활동이 읽기 - 아웃로 사용됩니다 더욱 빛이 생산되고, 더 많은 단백질이 원래의 형태를 다시 놓이게됩니다. 비 열 충격 전지 참조 (refolded 100 %로 설정됩니다루시페라제).
Protocol
1. 세포를 심는
- 시작하기 전에, 37에서 물을 욕조에있는 문화 매체, PBS 1X와 트립신을 따뜻하게 ˚ C
- 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 매체를 기음.
- 부드럽게 그들을 씻어 세포에 PBS 1X의 5 ML을 적용합니다.
- PBS 1X를 기음과 트립신은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0,025퍼센트를 포함하는 1 ML을 적용합니다.
- 부드럽게 트립신의 균등을 접시를 회전.
- 37 인큐베이터에있는 세포를 장소 ˚ C 50-10분에 대한 (세포 종류에 따라). 시간 체크인 시간부터 세포 판을 흔들어으로 분리하는 경우.
- 매체의 10-20 ML에있는 세포를 Resuspend하고 50 ML 팔콘 튜브에서 그들을 수집합니다.
- 베크 만 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 세포의 숫자는 약 60~70%의 합류를 위해 충분해야합니다.
- 플레이트 세포를 및 6~8시간위한 씨앗에게 있습니다.
2. 트랜스fection
- 이전 transfection하기 ˚ C. 37 물이 욕조에서 혈청 무료 매체의 나누어지는을 따뜻하게
- 상온에 X - treme 진 9 가져와.
- 이 eppendorf 튜브에서 혈청 무료 매체 (1 관 = 1 transfection) Pipet.
- Pipet 끝 5 분 동안 eppendorf과 부화의 플라스틱 벽에 닿으면하지 않는 혈청 무료 매체를 지불 관심의 X - treme 진 9. 그동안 두 DNA 믹스를 준비 : 한 튜브에 다른 튜브 renilla, 반딧불과 분자 보호자에 renilla, 반딧불 그리고 빈 벡터 제어에 대한 plasmids 함께 섞는다.
- 혈청 무료 매체에게 + X - treme 진 9, 20 분 상온에서 와동과 부화를 포함하는 각 eppendorf로 DNA 믹스를 추가합니다.
- 37 24 시간 동안 각 판과 부화에 각각의 혼합 dropwise 추가 ° C와 5퍼센트 CO 2
3. 분할 세포에게
- 24시간 transfection, tryps 후1.4에서 설명한대로 세포 inize - 1.6과 6에서 잘 플레이트 60~70%의 최종 confluency로 희석.
- 이외 충격 제어 한 접시를 준비하고 분석해야 복구 시간 포인트만큼 접시대로 그림 보여주었다. 2.
4. 열 충격
- 열 충격에 대한 사전 따뜻한 혈청 37 물 목욕으로 매체를 포함 ˚ C.
- 20 MM 20 μg / ML 및 맙스의 최종 농도 혈청이 포함된 매체 cycloheximide에 diluting하여 준비 '열 충격 버퍼.
- 이제 인큐베이터에서 접시를 꺼내와 매체를 기음.
- '열 충격 버퍼'의 각 잘 한 ML에 추가, 37 30 분 품어 ˚ C와 CO 2의 5 % (또한이 치료의 참조 플레이트 포함). 이것은 드 노보 단백질 합성 중단됩니다.
- 물 목욕에있는 동안 스위치와 t를 설정45 emperature ˚ C.
- 부화 후, 이전에 스트 라이프의 컷 Parafilm와 접시의 뚜껑을 밀봉. 참조 플레이트 (refolfed 반딧불의 100 %)은 보육에 남아있다.
- ˚ C 30 분 45 접시를 품어.
- 물 목욕에서 접시를 제거 parafilm을 제거하고 복구를 허용하도록 인큐베이터에 다시 번호판을 넣어.
- 각 시점의 수확 세포에서 4에서 1 분간 2000Xg에서 ˚ C를 centrifuging하여 PBS 1X에서 그들을 씻어
5. 세포 용해와 루시페라제 분석
- 효율적인 세포 용해 들면, 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결 스냅.
- 유리관을 두 번 증류수로 1:5 희석 수동 용해 완충액 200 μl를 추가합니다.
- 96 잘 접시에있는 세포 lysate 30 μl를 추가합니다. 각 예제는 세중의에 pipetted 있습니다.
- 오직 '비 충격'참조 샘플이 사용됩니다이 단계는 동일 transfection 효율을 확인하는 데 사용됩니다 이후 renilla 루시페라제 활동을 참조하십시오.
- 분석을위한 솔루션을 준비합니다. Gly - Gly 버퍼에 0.2 mm의 최종 농도를 희석 luciferin luciferin 솔루션하십시오. 반응 버퍼에 대한 Gly - Gly 버퍼 1mM DTT 최종 농도와 ATP를 희석. coelenterazine 반응 버퍼, coelenterazine 버퍼에서 0.2 μm의의 최종 농도를 희석 coelenterazine. luciferin 솔루션과 coelenterazine 반응 버퍼 빛을 보호 유지.
- 이제 luminometer에서 96 - 웰 플레이트를 배치하고 프로그램 'Wallac 1420 워크 스테이션'을 시작합니다.
- coelenterazine 솔루션을 포함하고있는 팔콘 튜브에 Pump1을 소개합니다. 더 빛이 튜브와 접촉하지 수 있도록 뚜껑을 닫습니다.
- 옵션 '디스펜서 관리'메뉴에서 선택하고 Pump1을 체크.
- 옵션 '채우기'를 선택하십시오.
- 플레이트 레이아웃 옵션을 선택 편집하려면 메뉴에서 '프로토콜과 결과를 탐험해보세요. 그것의 프로토콜과 더블 클릭을 선택합니다. 이제 우물을 읽을 수 선택합니다.
- 'Wallac 관리자'로 가서 '시작'을 클릭하십시오. renilla 루시페라제과 기판 coelenterazine 사이의 반응은 482 nm의 피크 파장의 빛을 방출과 함께.
- 읽고 나면, '디스펜서 유지 보수'에 가서 튜브로 모두 잔류 솔루션을 공개하는 '비우기'를 Pump1를 선택합니다.
- 지금 물을 포함하는 팔콘 튜브에 튜브를 이동하고 '플러쉬'를 체크.
- 세정 단계 후, '비우기'를 선택하여 튜브를 비웁니다.
- 반응 버퍼 팔콘 튜브에 Pump1 및 luciferin 팔콘 튜브 Pump2에서 하나의 튜브를 놓습니다.
- 플레이트 레이아웃을 변경합니다.
- '디에서 Pump1 및 Pump2에 대해'채우기 '를 선택하십시오스펜서 관리 '메뉴.
- 프로토콜을 선택하고 읽기를 시작합니다. 반딧불의 루시페라제과 기판 luciferin 사이의 반응은 560 nm의 피크 파장의 빛을 방출과 함께.
- 독서의 끝에 Pump1 및 Pump2에 대한 빈 플러쉬 비어 절차를 반복합니다.
- 결과는 'Wallac 1,420 탐색기'에서 지금 사용할 수 있습니다.
- 각 실험 분석 번호로 연결되어 있습니다, 시작 날짜와 종료 사용자 이름입니다.
- 결과는 이제 엑셀 파일로 내보낼 수 있습니다.
- 1 : 계산 들면, 세포는 세 그룹으로 나뉘어져 있습니다. 비 충격을 기준 시료 (100 %가 반딧불 루시페라제을 refolded로 설정) 2. 충격 분자 보호자와 열없이 세포 3. 분자 보호자와 더위와 함께 세포는 충격.
6. 대표 결과
시스템이 프로를 작동하면 단백질 refolding 직접 테스트하는 것이 회복의 시간과 관련이 perly, 분석은 다른 시간 지점에서 세포를 수집 수행되어야한다. 직접 상관 시간 / refolding의 비율이 실험이 제대로 수행하고 따라서 제한 요소를 나타냅니다되었음을 나타냅니다. 그러나 그것은 항상 열 충격 후 refolding 것은 포화 이벤트이며, 따라서 적절한 시간 코스 분석이 어떤 실험을 시작하기 전에 수행되어야한다는 것을 고려하여야한다.
그림 1. 실험의 개요. 생체내의 refolding 분석에 완료해야 3-4일이 필요합니다. 일 1 세포는 씨앗과 transfected 있습니다. 그 다음날 세포가 작은 형식으로 splitted하고 3 일, 그들이 열 충격입니다. 이 시점에서 바로 세포를 수확 후 루시페라제 분석을 수행하거나 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장하고 다른 순간에 분석을 수행할 수 있습니다
그림 2. 셀 분할. 일 2 세포는 6 자 판으로 분할됩니다. 각 transfection은 같은 접시에 모든 transfection을 위해 잘으로 희석한다. 각 플레이트는 특정 복구 시간 플러스 아닌 충격 참조 플레이트에 해당됩니다.
그림 3. 대표 좋은 결과. refolding의 A. 비율 직접 반딧불 루시페라제 활동에 의해 측정. 각 막대 차트는 다른 복구 시간 지점에서 분자 보호자의 (적색 바) 부재 (검은 막대)와 존재의 refolding의 비율을 나타냅니다. 부재 (검은 선)과 보호자의 존재 (빨간색 선)에 시간과 refolding 사이 B. 간 상관 관계. R 제곱 값은 좋은 상관 관계를 나타냅니다.
Fi 인터넷에g.3A는 세포가 15, 30, 45, 60 120분 부재의 열 충격 (검은 막대) 후 분자 보호자의 존재 (빨간색 막대)에 수집된 담당자 결과를 볼 수 있습니다. 비율은 장기 복구 시간과 분자 보호자의 transfection과 루시페라제 증가 refolded. refolding와 시간 제어 (그림 3B, 블랙 라인)과 분자 보호자 - transfected 세포 (그림 3B, 레드 라인) 사이의 상관 관계가 표시됩니다.
그림 4. 대표 나쁜 결과. refolding의 A. 비율 직접 루시페라제 활동에 의해 측정. 각 막대 차트는 다른 복구 시간 지점에서 분자 보호자의 (적색 바) 부재 (검은 막대)와 존재의 refolding의 비율을 나타냅니다. 부재와 존재의 시간과 refolding 사이 B. 간 상관 관계 (빨간색 리터보호자의 오프라인). R 제곱 값은 나쁜 상관 관계를 나타냅니다.
그림 4A가. 제대로 수행되지 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다. 제어 (검은 막대)와 분자 보호자 - transfected 세포 (적색 바) 모두 시간과 refolding 단백질의 증가를 표시하지 않았다. 또한, 분자 보호자의 transfection은 refolding의 증가의 결과 않았어요. 이 불쌍한 상관 관계는 그림에 확인됩니다. 컨트롤 (블랙 라인)과 분자 보호자 - transfected 세포 (빨간색 선)에 대한 각각 0.6619과 0.1882의 R 제곱 값을 보여주는 4B.
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Discussion
이 작품에서는 분자 보호자의 세포내 refolding 활동을 측정하는 프로토콜이 제공됩니다. 그림의 개요에 의해 그림과 같이 전체 분석은 3-4일에서 수행할 수 있습니다. 1.
반딧불과 renilla 루시페라제에 의해 만들어진 빛의 신호의 견고하고 선형이 프로토콜의 재현성위한 견고한 기반을 나타냅니다.
분석의 중요한 단계는 분자 보호자와 반딧불의 루시페라제의 overexpression을 보장하기 위해 효율적인 transfection 시약의 선택입니다. 리포터 유전자는 adenoviral 감염 12 electroporation과 같은 다른 방법 또한 제공 수 있습니다. 반딧불의 루시페라제의 유전자가 안정 transfected있는 동안 또 다른 가능성은, 보호자의 표현 (테트라 사이클린 - 응답 발기인 예를 들어) 13 화학적 inducible있는 유전자 변형 세포 라인의 사용이다. opti의 광범위한기능은 기본 세포를 포함한 여러 세포 라인에 분석의 응용 프로그램을 따라서 할 수 있습니다.
셀 라인 cycloheximide 치료에 특히 민감한 경우 또한, 반딧불 루시페라제 단백질 번역은 사용 repressible / inducible 시스템에 의해 체포 수 있습니다.
refolding 활동은 분자 보호자 사이에 달라질 수 있으므로, transfected 수 보호자의 금액의 적정 항상 수행되어야합니다. 일단 특정 세포 라인에 설립, 기술은 작은 분자 및 / 또는 gentic 노는 보호자 활동에 영향을 미칠 수있는 방법을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 심지어 12 잘 플레이트 - 검정은 6 같은 작은 형식도 수행할 수 있습니다.
가장 매력적인 애플 리케이션 중 하나는 보호자 활동에 영향을 미칠 수있는 화합물의 전체 라이브러리를 테스트하는 가능성이다. 이 특정한 경우에는 셀 라인은 안정 리포터 유전자뿐만 아니라 채널로 transfectedaperone은 우선적으로 transfection 효율에 의한 변형을 최소화하기 위해 사용됩니다.
이 분석은 또한 공동 activators이나 단백질 refolding 또는 어떻게 다른 스트레스 자극 (열, 산화 스트레스는 단백질 반응을 펼쳐)시 refolding에 영향을 분자 보호자의 공동 억제의 역할을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
세포 기반 실험에서 화합물 및 / 또는 특정 보호자의 활동에 단백질의 효과보다 생리 판독을 가능하더라도, 여기 제시된 분석과 보호자 활동을 계량하는 것은 불가능합니다. 이 경우에는 반딧불 루시페라제 또는 β - 갈락토의 체외 refolding 분석 에서처럼 셀 - 무료 분석 더 적합한 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
다닐 Maddalo 기술의 카를 스루에 연구소에서 젊은 탐정 그룹 (YIG)와 같은 연구 활동의받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
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