Summary
在这个协议的方法来衡量热休克后细胞内蛋白质复性的描述。这种方法可以用来研究如分子伴侣和他们的共同因素或化合物能够影响他们的活动foldases。萤火虫荧光素酶的活动是作为记者来衡量伴侣复性活动。
Abstract
本协议描述了一个方法来衡量，在基于单元的系统和抑制/刺激活性的化合物可能产生的影响酶的活性分子伴侣。分子伴侣是参与调节蛋白质折叠1的蛋白质，有促进细胞存活时强调侮辱，如热休克2，营养饥饿和接触化学品 /毒药3的关键作用。出于这个原因的伴侣被发现在参与活动，如肿瘤的发展，癌细胞4 chemioresistance以及神经退行性疾病5。能够抑制或刺激这些酶的活性小分子的设计，因此，用于癌症治疗和神经退行性疾病的研究最多的战略之一。这里所描述的实验提供的可能性来衡量一个特定的分子伴侣复性的活动，并研究对比赛的影响ounds就其活动。这种方法调查的分子伴侣基因转染的萤火虫荧光素酶基因的表达载体。它已经描述，可以通过10,11分子伴侣复性变性萤火虫荧光素酶。作为转染控制正常化，为海肾荧光素酶基因的载体转染。在本协议中所述的所有转染基因的X极端 11（罗氏）在HEK - 293细胞。在第一步中，蛋白质的合成，抑制细胞治疗与放线菌酮。此后蛋白展开是在45 ° C诱导热休克30分钟。恢复后，在37 ° C，蛋白质重新折叠成其活性构象和萤火虫荧光素酶的活性是用作读出：会产生更多的光，更多的蛋白质将重新获得原来的构象。非热震惊细胞作为参考（100％的复性荧光素酶）。
Protocol
1。播种细胞
- 开始前，热身在37℃水浴中培养液，PBS 1X和胰蛋白酶˚彗星
- 的孵化器中取出细胞，吸中等。
- 轻轻地适用于洗细胞5毫升的PBS 1X。
- 吸出PBS 1X和适用于1毫升胰蛋白酶含0025％EDTA。
- 轻轻旋转板有均匀分布的胰蛋白酶。
- 在孵化器中放置的细胞在37˚C为5-10分钟（取决于细胞类型）。从不定期检查，如果细胞分离摇板。
- 在10-20毫升培养基重悬细胞，并收集他们在50毫升猎鹰管。
- 使用贝克曼计数器计数细胞。细胞的数量应足以确保约60-70％汇合。
- 板细胞，并允许为6-8小时，他们的种子。
2。横贯染
- 转染前，热身无血清培养基分装在37˚C。水浴中
- 带来的X极端基因9至室温。
- 吸取无血清培养在2个Eppendorf管（1管= 1转）。
- 吸管的X极端基因的无血清培养的重视，针尖不触及5分钟Eppendorf公司和孵化的塑料墙。在此期间准备两个DNA混合：一管混合在一起海肾，萤火虫和一个空的矢量控制的质粒，在另一个管海肾，萤火虫和分子伴侣。
- 含无血清培养+ X极端基因9，旋涡和室温孵育20分钟到每个Eppendorf公司的DNA结构。
- 滴加每个组合在37到24小时，每块板和孵化° C和5％的CO 2
3。分裂的细胞
- 24小时后，转染，trypsinize如1.4中所述的细胞 - 1.6和稀释他们的60-70％，在6孔板最终汇合。
- 准备一个盘子非震惊控制，并尽可能多的恢复时间点，要分析板， 显示图 。 2。
4。热休克
- 热休克，预温的含药血清在37℃水浴中语言˚C。
- 准备“热休克缓冲区”，在含血清培养基酮稀释到终浓度为20微克/毫升和拖把至20毫米。
- 现在拿出从孵化器板和吸出培养基。
- 每孔1毫升的“热休克缓冲区，30分钟在37˚C和5％的CO 2（也包括在这种治疗方法的参考板） 。这将停止从头蛋白质的合成。
- 在水浴上同时开关，并设置了T在45˚C。emperature
- 孵育后，密封封口膜板的盖子，以前在条纹削减。该参考板（100％refolfed萤火虫）是留在孵化器。
- 在45˚C下30分钟的孵育板。
- 从水浴中取出的钢板，删除的封口膜，并把板块的孵化器，允许恢复。
- 在每个时间点收获细胞，并在PBS 1X洗4 1分钟˚C。离心在2000Xg
5。细胞裂解和荧光素酶检测
- 对于一个高效的细胞裂解，单元冻结在液氮中的细胞沉淀。
- 加入200μL双蒸水稀释1:5玻璃管被动裂解缓冲。
- 在96孔板中加入30μL细胞裂解液。每个样品一式三份吸管。
- “非震惊”参考样本将被用来读海肾荧光素酶的活动，因为这一步是用来检查相等的转染效率。
- 准备检测的解决方案。有关荧光素的解决方案稀释荧光素的终浓度为0.2毫米，在甘氨酸 - 甘氨酸缓冲。反应缓冲液稀释到1mm甘氨酸 - 甘氨酸缓冲终浓度DTT和ATP。腔肠反应缓冲液，稀释到终浓度为0.2μM腔肠缓冲腔肠。保持荧光素的解决方案和腔肠反应缓冲液避光。
- 现在放置在光度计96孔板和启动程序“Wallac 1420工作站”。
- 引入猎鹰含腔肠的解决方案管Pump1。盖上盖子，所以没有光可以管接触。
- 选择从菜单中选择“饮水机维修”，并勾选Pump1。
- 选择选项“补”。
- 要编辑的板块布局，选择选项“探索协议和成果”菜单上的。选择协议，并双击就可以了。现在选择要读取的井。
- 回到“Wallac经理”，然后单击“开始”。之间的海肾荧光素酶及其底物腔肠的反应发出的峰值波长为482纳米的光。
- 阅读后，“饮水机维修”，选择“空”和Pump1管释放所有剩余的解决方案。
- 现在，移动猎鹰管中水的管，并勾选“刷新”。
- 冲洗步骤后，空管，通过选择“空”。
- 放置在反应缓冲液猎鹰管从Pump1和荧光素猎鹰管Pump2管。
- 更改板块布局。
- 选择“补”Pump1和Pump2从“迪斯宾塞维护“菜单。
- 选择协议，并开始阅读。之间的萤火虫荧光素酶及其底物荧光素的反应发出的峰值波长560纳米的光。
- 在阅读结束重复上述步骤Pump1和Pump2空冲洗空。
- 结果，现已在“Wallac 1420资源管理器”。
- 每个实验相关的检测数量，用户名，开始和结束日期。
- 结果现在可以导出为Excel文件。
- 计算，细胞分为三组：1。非震惊的参考样本（设置为100％的复性萤火虫荧光素酶）; 2。无细胞分子伴侣和震惊热; 3。细胞与分子伴侣和热震惊。
6。代表性的成果
蛋白复性是直接相关的恢复，因此，测试的时间，如果系统正亲 perly，测定在不同时间点收集细胞进行。复性时间/百分比有着直接的关系表明，实验已正确执行，因此代表了一个限制因素。然而，应当始终认为热休克后的复性是饱和的事件，因此任何实验开始前，应执行适当的时候当然分析。
图1实验概述 。在体内复性实验需要3到4天完成。天1细胞接种和转染。翌日细胞劈裂到一个较小的格式，并在第3天，他们热震惊。在这一点上可能执行后收获细胞的荧光素酶检测或保存于-80 ° C细胞沉淀，并执行在另一时刻的检测
图2细胞分裂 。第2天细胞分裂成6孔板。每个转染将被摊薄，以及为了所有的同一个盘子转染。每个板块将对应一个特定的恢复时间，加上非震惊的参考板。
图3。代表好的结果 。 A.复性的百分比直接测定萤火虫荧光素酶的活性。每个条形图表示复性的情况下（黑网吧）和存在的分子伴侣在不同的恢复时间点（红色条）的百分比。 B.相关的情况下（黑线）和存在的伴侣（红线）之间的时间和复性。 R平方值显示良好的相关性。
在连接g.3A是一个细胞的情况下热休克（黑网吧），15，30，45，60和120分钟后存在的分子伴侣（红色条）收集的有代表性的成果。复性与长时间的恢复时间，并与分子伴侣的转染荧光素酶增加的百分比。显示控制（ 图3B，黑线）和转染细胞的分子伴侣（ 图3B，红线）的复性和时间之间的相关性。
图4。代表坏的结果 。 A.复性的百分比直接测定荧光素酶活性。每个条形图表示复性的情况下（黑网吧）和存在的分子伴侣在不同的恢复时间点（红色条）的百分比。 B.相关性的情况下，在存在时间和复性之间（红升INE）的伴侣。 R平方值表示坏的相关性。
图4a显示了一个代表性的结果不正确执行一个实验。两个对照组（黑网吧）和转染细胞的分子伴侣（红色条）没有显示增加蛋白质复性时间。此外，转染的分子伴侣复性的增加并没有导致。 图证实这种相关性较差。 4B显示控制（黑线）和转染细胞的分子伴侣（红线）的R平方值分别为0.6619和0.1882。
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Discussion
在这项工作中来衡量细胞内分子伴侣复性活动的协议。整个实验可在3到4天，在图概述所示。 1。
萤火虫和海肾荧光素酶产生的光信号的鲁棒性和线性代表一个坚实的基础协议的重现性。
检测的关键步骤是一个有效率的转染试剂的选择，以确保分子伴侣和萤火虫荧光素酶的过度表达。报告基因可交付也与其他方法，如腺病毒感染 12或电击。另一种可能性是利用转基因细胞系表达的伴侣是化学诱导（如四环素反应启动子）13，而萤火虫荧光素酶基因转染。这种广泛的优化组件从而使可能的几个细胞株的检测，包括原代细胞的应用。
此外，如果一个细胞系是特别敏感，放线菌酮治疗，萤火虫荧光素酶蛋白质的翻译可能会被逮捕repressible /诱导系统的使用。
由于复性活动可以有所不同的分子伴侣，伴侣转染量滴定应经常做。一旦在一个特定的细胞系的建立，该技术可用于研究小分子和/或gentic操作如何影响伴侣活性。该试剂盒可在一个较小的格式，如6 - 甚至是12孔板。
最有吸引力的应用之一是测试，可以影响伴侣活性的化合物整个图书馆的可能性。在这种特殊情况下，细胞株稳定转染与记者的基因，以及CHaperone优先使用，以尽量减少由于转染效率的变化。
这也可以用来检测调查共同激活或在蛋白复性或影响如何根据不同的应激刺激（热，氧化应激，未折叠蛋白反应）的复性的分子伴侣共同阻遏作用。
即使从一个细胞为基础的的实验可能有更多的生理读数的化合物和/或一个特定的伴侣活动的蛋白质的作用，它是不可能的，这里提出的检测与量化伴侣活性。在这种情况下，会更适合像萤火虫荧光素酶或β-半乳糖苷酶在体外折叠检测细胞免费检测。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
达尼洛Maddalo是作为年轻的调查组，从卡尔斯鲁厄理工学院（YIG）的研究奖学金获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
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