Summary
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि गर्मी झटका के बाद intracellular प्रोटीन refolding उपाय है. इस विधि आणविक संरक्षिकाओं और उनके सह कारकों या यौगिकों के लिए उनकी गतिविधि को प्रभावित करने में सक्षम की तरह foldases का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जुगनू luciferase गतिविधि निगरानी refolding गतिविधि को मापने के संवाददाता के रूप में प्रयोग किया जाता है.
Abstract
इस प्रोटोकॉल करने के लिए एक सेल आधारित एक प्रणाली और निरोधात्मक / उत्तेजक गतिविधि के साथ यौगिकों के संभावित प्रभावों में आणविक संरक्षिकाओं के enzymatic गतिविधि को मापने की विधि का वर्णन करता है. आण्विक संरक्षिकाओं 1 तह प्रोटीन के विनियमन में शामिल प्रोटीन होते हैं और गर्मी झटका, 2 पोषक तत्व भुखमरी और रसायनों / 3 विष के लिए जोखिम की तरह तनाव अपमान पर सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका है . इस कारण के लिए संरक्षिकाओं ट्यूमर के विकास, कैंसर 4 कोशिकाओं के chemioresistance के रूप में अच्छी तरह के रूप में 5 neurodegeneration तरह की घटनाओं में शामिल होना पाया जाता है. को बाधित करने के लिए या इन एंजाइमों की गतिविधि को प्रोत्साहित करने में सक्षम छोटे अणुओं के डिजाइन है इसलिए कैंसर 7 चिकित्सा और neurodegenerative विकारों 9 के लिए सबसे अधिक अध्ययन रणनीतियों में से एक है. यहाँ वर्णित परख के लिए एक विशेष आणविक निगरानी की refolding गतिविधि को मापने के लिए और COMP के प्रभाव का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता हैअपनी गतिविधि पर ounds. इस विधि में आणविक निगरानी जांच के जीन के साथ जुगनू luciferase जीन के लिए एक अभिव्यक्ति वेक्टर एन्कोडिंग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है. यह पहले से ही वर्णित किया गया है कि denaturated जुगनू luciferase आणविक 10,11 संरक्षिकाओं द्वारा refolded किया जा सकता है. अभिकर्मक नियंत्रण सामान्य रूप में, renilla luciferase जीन के लिए एक वेक्टर एन्कोडिंग ट्रांसफ़ेक्ट है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी transfections X-treme 11 HEK 293 कोशिकाओं में जीन (Roche) के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. पहले चरण में प्रोटीन संश्लेषण cycloheximide के साथ कोशिकाओं के इलाज से हिचकते हैं. इसके बाद खुलासा प्रोटीन गर्मी सदमे से 45 ° C पर 30 मिनट के लिए प्रेरित किया है. 37 पर वसूली करने पर डिग्री सेल्सियस, प्रोटीन फिर से जोड़ रहे हैं और उनके सक्रिय रचना में जुगनू luciferase की गतिविधि पढ़ने के बाहर के रूप में इस्तेमाल किया जाता है: और अधिक प्रकाश का उत्पादन किया जाएगा, अधिक प्रोटीन मूल रचना फिर से प्राप्त की. गैर गर्मी हैरान कक्ष संदर्भ (refolded के 100% के रूप में सेट कर रहे हैंluciferase).
Protocol
1. कोशिकाओं सीडिंग
- शुरू करने से पहले, 37 में मध्यम संस्कृति, Pbs 1X trypsin और गर्म पानी के स्नान में ˚ सी
- इनक्यूबेटर की कोशिकाओं से बाहर ले लो और मध्यम महाप्राण (व्यंजन).
- पीबीएस 1X के 5 एमएल धीरे उन्हें धोने के कोशिकाओं पर लागू होते हैं.
- पीबीएस 1X महाप्राण (व्यंजन) और trypsin EDTA 0,025% से युक्त 1 एमएल लागू.
- धीरे थाली बारी बारी से करने के लिए trypsin का एक भी वितरण.
- इनक्यूबेटर में 37 में कोशिकाओं प्लेस ˚ सी 5-10 मिनट के लिए (सेल प्रकार पर निर्भर करता है). अगर कोशिकाओं समय की जाँच करने के लिए समय से थाली मिलाते द्वारा अलग कर रहे हैं.
- Resuspend माध्यम की 10-20 एमएल में कोशिकाओं और उन्हें एक 50 एमएल बाज़ ट्यूब में एकत्रित.
- Beckman काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना. कक्षों की संख्या लगभग 60-70% की एक संगम सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
- प्लेट कोशिकाओं और बीज के लिए उन्हें 6-8 घंटे के लिए अनुमति देते हैं.
2. ट्रांसfection
- अभिकर्मक के लिए, पहले एक पानी के स्नान में 37 सीरम मुक्त मध्यम के एक विभाज्य सी. ˚ गर्म
- कमरे के तापमान पर X-treme जीन 9 लाओ.
- Pipet 2 Eppendorf ट्यूबों में सीरम मुक्त मध्यम (1 ट्यूब = 1 अभिकर्मक).
- X-treme सीरम मुक्त मध्यम ध्यान दे कि टिप 5 मिनट के लिए Eppendorf और सेते की प्लास्टिक की दीवार छू नहीं करता है में 9 जीन Pipet. बीच में दो डीएनए घोला जा सकता है तैयार: एक ट्यूब में एक साथ एक और ट्यूब renilla, जुगनू और आणविक निगरानी में renilla, जुगनू और एक खाली वेक्टर नियंत्रण के लिए plasmids मिश्रण.
- प्रत्येक सीरम मुक्त मध्यम + X-treme 9 जीन, भंवर और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते युक्त Eppendorf डीएनए के मिश्रण जोड़ें.
- प्रत्येक और 24 घंटे के लिए थाली सेते पर 37 बजे प्रत्येक मिश्रण dropwise में जोड़ें डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2
3. कोशिकाओं बंटवारे
- 24 घंटे अभिकर्मक tryps के बादकोशिकाओं के रूप में 1.4 में वर्णित inize - 1.6 और उन्हें 6 अच्छी तरह से एक थाली में एक 60-70% के अंतिम confluency पतला.
- गैर हैरान नियंत्रण के लिए एक थाली तैयार है और वसूली समय बताते हैं कि विश्लेषण किया जाना है के रूप में के रूप में कई प्लेटें, के रूप में छवि में दिखाया. 2.
4. गर्मी झटका
- गर्मी झटका, पूर्व गर्म सीरम 37 पर एक पानी के स्नान में मध्यम युक्त ˚ सी.
- 20 μg / मिलीलीटर MOPS और अंतिम एकाग्रता सीरम युक्त मध्यम cycloheximide में 20 मिमी के लिए गिराए द्वारा तैयार 'गर्मी बफर सदमे'.
- अब इनक्यूबेटर से प्लेटें लेने के लिए और मध्यम महाप्राण (व्यंजन).
- 'हीट सदमे बफर' हर अच्छी तरह से 1 एमएल जोड़ें, और 37 पर 30 मिनट के लिए सेते ˚ सी और सीओ 2 के 5% (भी इस उपचार में संदर्भ प्लेट शामिल हैं) . यह डे प्रोटीन संश्लेषण नोवो बंद हो जाएगा.
- एक पानी के स्नान पर इस बीच स्विच और टी सेट45 में emperature ˚ सी.
- ऊष्मायन के बाद, Parafilm साथ प्लेटों के ढक्कन सील पहले धारियों में कटौती. संदर्भ प्लेट (refolfed जुगनू 100%) इनक्यूबेटर में छोड़ दिया है.
- 45 ˚ सी 30 मिनट के लिए पर प्लेटें सेते हैं.
- पानी के स्नान से निकालें प्लेटें, parafilm हटाने और प्लेटें वापस इनक्यूबेटर करने के लिए वसूली की अनुमति डाल दिया.
- हर बार बिंदु फसल कोशिकाओं से कम है और पीबीएस 1X में उन्हें 2000Xg पर 1 मिनट के लिए 4 ˚ सी centrifuging धोने
5. सेल lysis और luciferase परख
- एक कुशल सेल lysis के लिए, तरल नाइट्रोजन में सेल गोली स्थिर तस्वीर.
- निष्क्रिय lysis दोहरा आसुत जल में एक ग्लास ट्यूब में 01:05 पतला बफर के 200 μl जोड़ें.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली में सेल lysate के 30 μl जोड़ें. तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूना pipetted है.
- केवल 'गैर हैरान' संदर्भ नमूने लिए इस्तेमाल किया जाएगाrenilla luciferase गतिविधि पढ़ने के बाद से इस कदम के बराबर अभिकर्मक दक्षता की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- परख के समाधान के लिए तैयार. Luciferin समाधान के लिए Gly-Gly बफर में एक 0.2 मिमी की अंतिम एकाग्रता luciferin पतला. प्रतिक्रिया बफर के लिए 1mm Gly-Gly बफर में अंतिम एकाग्रता डीटीटी और एटीपी पतला. Coelenterazine प्रतिक्रिया बफर के लिए, coelenterazine बफर में 0.2 सुक्ष्ममापी की अंतिम एकाग्रता coelenterazine पतला. Luciferin समाधान और coelenterazine प्रतिक्रिया बफर प्रकाश संरक्षित रखें.
- अब luminometer में 96 अच्छी तरह से थाली की जगह है और कार्यक्रम 'Wallac 1420 कार्य केंद्र' शुरू.
- बाज़ coelenterazine समाधान युक्त ट्यूब में Pump1 परिचय. ढक्कन बंद तो कोई प्रकाश ट्यूब के साथ संपर्क में आ सकता है.
- मेनू विकल्प 'औषधि रखरखाव से चुनें और Pump1 टिकटिक.
- 'भरण' विकल्प का चयन करें.
- संपादित थाली लेआउट विकल्प चुन मेनू पर प्रोटोकॉल और परिणाम का अन्वेषण '. प्रोटोकॉल और उस पर डबल क्लिक करें का चयन करें. अब कुओं पढ़ा जा चयन करें.
- 'Wallac प्रबंधक' वापस जाओ और 'प्रारंभ' पर क्लिक करें. renilla luciferase और उसके सब्सट्रेट coelenterazine के बीच प्रतिक्रिया के 482 एनएम के एक चोटी तरंगदैर्ध्य के साथ प्रकाश का उत्सर्जन करता है.
- पढ़ने के बाद, 'औषधि रखरखाव' पर जाने के लिए और 'खाली' और Pump1 का चयन करने के लिए ट्यूब के लिए सभी अवशिष्ट समाधान वापस रिलीज.
- अब एक बाज़ पानी युक्त ट्यूब ट्यूब चाल और टिकटिक 'फ्लश'.
- निस्तब्धता कदम के बाद, 'खाली' का चयन करके ट्यूब खाली.
- से Pump1 रिएक्शन बफर बाज़ ट्यूब में Pump2 luciferin बाज़ ट्यूब में से एक ट्यूब रखें.
- थाली लेआउट बदलें.
- चुनें Pump1 और Pump2 के लिए 'डि से भरेंस्पेंसर 'रखरखाव मेनू.
- प्रोटोकॉल का चयन करें और शुरू पढ़ने. जुगनू luciferase और उसके सब्सट्रेट luciferin के बीच प्रतिक्रिया के 560 एनएम के एक चोटी तरंगदैर्ध्य के साथ प्रकाश का उत्सर्जन करता है.
- Pump1 और Pump2 के लिए पढ़ने के अंत में खाली फ्लश - खाली प्रक्रिया को दोहराने.
- परिणाम अब 'Wallac 1420 एक्सप्लोरर' में उपलब्ध हैं.
- प्रत्येक एक परख नंबर प्रयोग करने के लिए जुड़ा हुआ है, उपयोगकर्ता नाम शुरू और अंत तिथि.
- परिणाम अब एक Excel फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है.
- 1: गणना के लिए, कोशिकाओं को तीन समूहों में विभाजित हैं. गैर हैरान संदर्भ नमूने (सेट के रूप में 100% जुगनू luciferase refolded), 2. आणविक निगरानी और गर्मी हैरान बिना कोशिकाओं, 3. आणविक निगरानी और गर्मी के साथ कोशिकाओं को हैरान.
6. प्रतिनिधि परिणाम
प्रोटीन refolding सीधे इसलिए वसूली करने के लिए परीक्षण के समय से संबंधित है अगर सिस्टम समर्थक काम कर रहा है perly, एक परख के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं का संग्रह किया जा है. एक सीधा संबंध समय की प्रतिशतता / refolding इंगित करता है कि प्रयोग ठीक से प्रदर्शन किया है और इसलिए एक सीमित कारक का प्रतिनिधित्व करता है. लेकिन यह हमेशा से विचार किया जाना चाहिए कि गर्मी सदमे के बाद refolding saturating घटना है और इसलिए किसी भी प्रयोग शुरू करने से पहले एक उचित समय बेशक विश्लेषण किया जाना चाहिए.
चित्रा 1 प्रयोग का अवलोकन. Vivo refolding परख में 3 से 4 दिनों के लिए पूरा किया जा आवश्यकता है. पर 1 दिन कोशिकाओं वरीयता प्राप्त और ट्रांसफ़ेक्ट हैं. अगले दिन की कोशिकाओं के एक छोटे प्रारूप में splitted रहे हैं और 3 दिन वे गर्मी हैरान हैं. इस बिंदु पर संभव है सही कोशिकाओं कटाई के बाद luciferase परख करने या -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली बचाने के लिए और दूसरे पल में परख प्रदर्शन
चित्रा 2 सेल बंटवारे. दिन में 2 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से एक थाली में विभाजित कर रहे हैं. प्रत्येक अभिकर्मक एक अच्छी तरह से पतला हो जाएगा क्रम में सभी एक ही थाली पर अभिकर्मक है. प्रत्येक प्लेट एक विशेष वसूली समय के साथ साथ एक संदर्भ गैर हैरान थाली के अनुरूप होगा.
चित्रा 3 प्रतिनिधि अच्छा परिणाम. ए प्रतिशत की refolding सीधे जुगनू luciferase गतिविधि के द्वारा मापा जाता है. प्रत्येक पट्टी चार्ट अलग वसूली समय बिंदुओं पर एक आणविक निगरानी की अनुपस्थिति (काली सलाखों) और उपस्थिति में (लाल बार) refolding का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है. समय और अनुपस्थिति (काला लाइन) में और निगरानी (लाल रेखा) की उपस्थिति में refolding के बीच सहसंबंध बी. आर चुकता मान अच्छा सहसंबंध संकेत मिलता है.
फाई मेंg.3A एक प्रतिनिधि परिणाम जहां कोशिकाओं को 15, 30, 45, 60, और 120 मिनट के अभाव में गर्मी झटका (काली सलाखों) के बाद और आणविक निगरानी की उपस्थिति (लाल बार) में एकत्र किए गए थे दिखाया गया है. का प्रतिशत लंबे समय तक वसूली समय के साथ और आणविक निगरानी की अभिकर्मक के साथ refolded luciferase बढ़ जाती है. refolding और नियंत्रण (छवि 3B, काला लाइन) के लिए समय और आणविक निगरानी ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (छवि 3B, लाल रेखा) के बीच सहसंबंध दिखाया गया है.
चित्रा 4 प्रतिनिधि बुरा परिणाम. ए प्रतिशत की refolding सीधे luciferase गतिविधि के द्वारा मापा जाता है. प्रत्येक पट्टी चार्ट अलग वसूली समय बिंदुओं पर एक आणविक निगरानी की अनुपस्थिति (काली सलाखों) और उपस्थिति में (लाल बार) refolding का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है. समय और refolding के बीच अभाव में और उपस्थिति में बी सहसंबंध (लाल एलनिगरानी के ine). आर चुकता मान बुरा सहसंबंध संकेत मिलता है.
चित्रा 4A. प्रयोग ठीक से नहीं प्रदर्शन के एक प्रतिनिधि के परिणाम से पता चलता है. दोनों (काली सलाखों) नियंत्रण और आणविक निगरानी ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (लाल बार) समय के साथ refolding प्रोटीन में वृद्धि नहीं दिखा था. इसके अलावा, आणविक निगरानी की अभिकर्मक refolding की वृद्धि में परिणाम नहीं था. इस गरीब संबंध में छवि में पुष्टि की है . 4B .६,६१९ और 0.१,८८२ के एक r चुकता मूल्य नियंत्रण (काला लाइन) और आणविक निगरानी ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (लाल रेखा) के लिए क्रमशः दिखा .
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Discussion
इस काम में आणविक संरक्षिकाओं के intracellular refolding गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत है. 3 से 4 दिनों में पूरी परख प्रदर्शन किया जा सकता है जैसा कि चित्र में सिंहावलोकन द्वारा दिखाया गया है. 1.
मजबूती और प्रकाश जुगनू और renilla luciferase द्वारा उत्पादित संकेत के linearity प्रोटोकॉल के reproducibility के लिए एक ठोस आधार का प्रतिनिधित्व करते हैं.
परख की महत्वपूर्ण कदम एक कुशल अभिकर्मक अभिकर्मक के चुनाव के लिए आणविक निगरानी और जुगनू luciferase की overexpression सुनिश्चित है. रिपोर्टर जीन adenoviral संक्रमण 12 या electroporation जैसे अन्य तरीकों के साथ भी दिया जा सकता है. एक और संभावना एक ट्रांसजेनिक सेल लाइन है जहां निगरानी की अभिव्यक्ति रासायनिक inducible है (एक टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी प्रमोटर जैसे) 13 का उपयोग है, जबकि जुगनू luciferase जीन stably ट्रांसफ़ेक्ट है . Opti के इस विस्तृत रेंजons है इस प्रकार संभव प्राथमिक कोशिकाओं सहित कई सेल लाइनों, के लिए परख के आवेदन बनाता है.
इसके अलावा, अगर एक कोशिका लाइन विशेष रूप से cycloheximide इलाज के लिए संवेदनशील है, जुगनू luciferase प्रोटीन अनुवाद का उपयोग repressible / inducible प्रणाली द्वारा गिरफ्तार किया जा सकता है.
चूंकि refolding गतिविधि आणविक संरक्षिकाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं, ट्रांसफ़ेक्ट हो निगरानी की राशि का एक टाइट्रेट करना हमेशा किया जाना चाहिए. एक बार एक विशेष सेल लाइन में स्थापित, तकनीक जांच करने के लिए कैसे छोटे अणुओं और / या gentic जोड़तोड़ निगरानी गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परख एक छोटे प्रारूप में भी प्रदर्शन कर सकते हैं एक 6 की तरह, या भी एक 12 अच्छी तरह से थाली.
एक सबसे आकर्षक अनुप्रयोगों के यौगिकों के पूरे पुस्तकालयों कि निगरानी गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं परीक्षण करने की संभावना है. इस विशेष मामले में, सेल लाइनों stably जीन पत्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चर्चा के साथ ट्रांसफ़ेक्टaperone preferentially, क्रम में अभिकर्मक दक्षता के कारण भिन्नरूपों कम से कम उपयोग किया जाता है.
यह परख भी सह activators या प्रोटीन refolding में या कैसे वे अलग तनाव उत्तेजनाओं (गर्मी, oxidative तनाव, प्रोटीन प्रतिक्रिया सामने आया) पर refolding प्रभाव आणविक संरक्षिकाओं के सह repressor की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यहां तक कि अगर एक सेल आधारित प्रयोग से संभव है यौगिकों और / या एक विशेष निगरानी की गतिविधि पर प्रोटीन के प्रभाव की एक अधिक शारीरिक readout है, यहाँ प्रस्तुत परख के साथ निगरानी गतिविधि यों यह संभव नहीं है. इस मामले में अधिक उपयुक्त जैसे इन विट्रो जुगनू luciferase या β-galactosidase refolding परख में सेल मुक्त परख होगी.
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Disclosures
लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
Danilo Maddalo कार्लज़ूए प्रौद्योगिकी संस्थान से युवा अन्वेषक समूह (YIG) के रूप में एक शोध फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
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