Summary
I denne protokol en metode til at måle intracellulært protein, hvorved man genfolder efter heat shock er beskrevet. Denne metode kan bruges til at studere foldases som molekylær anstandsdamer og deres co-faktorer eller stoffer i stand til at påvirke deres aktivitet. Firefly luciferase aktiviteten bruges som reporter til at måle anstandsdame hvorved man genfolder aktivitet.
Abstract
Denne protokol beskriver en metode til at måle den enzymatiske aktivitet af molekylære anstandsdamer i en celle-baseret system og de mulige virkninger af stoffer med hæmmende / stimulerende aktivitet. Molekylær anstandsdamer er proteiner involveret i reguleringen af proteinfoldning 1 og spiller en afgørende rolle i at fremme cellernes overlevelse på stress fornærmelser som heat shock 2, næringsstof sult og eksponering for kemikalier / giftstoffer 3. Af denne grund anstandsdamer er fundet at være involveret i begivenheder som tumor udvikling, chemioresistance af kræftceller 4 samt neurodegeneration 5. Design af små molekyler i stand til at hæmme eller stimulere aktiviteten af disse enzymer er derfor en af de mest undersøgte strategier for kræftbehandling 7 og neurodegenerative sygdomme 9. Analysen her beskrevne giver mulighed for at måle hvorved man genfolder aktiviteten af et bestemt molekylær anstandsdame og for at undersøge effekten af compounds om sine aktiviteter. I denne metode gen af den molekylære undersøgte anstandsdame er transficeret sammen med en vektor kodning for ildflue luciferase genet. Det er allerede blevet beskrevet, at denatureret ildflue luciferase kan refolded ved molekylær anstandsdamer 10,11. Som normalisering transfektion kontrol, er en vektor kodning for renilla luciferase genet transfekteret. Alle transfections beskrevet i denne protokol udføres med X-treme Gene 11 (Roche) i HEK-293 celler. I det første trin, er proteinsyntesen hæmmes ved at behandle cellerne med cycloheximid. Derefter protein udfoldning er foranlediget af heat shock ved 45 ° C i 30 minutter. Ved genopretning ved 37 ° C, er proteiner igen foldet ind i deres aktive kropsbygning og aktivitet ildflue luciferase bruges som read-out: jo mere lys vil blive produceret, jo mere protein vil have igen fået de oprindelige kropsbygning. Ikke-varme chokeret celler er sat som reference (100% af refoldedluciferase).
Protocol
1. Seeding cellerne
- Før du starter, varme op dyrkningsmediet, PBS 1X og trypsin i et vandbad ved 37 ˚ C
- Tag de celler ud af kuvøsen og aspirér medium.
- Forsigtigt på 5 mL PBS 1X på cellerne til at vaske dem.
- Aspirer PBS 1X og anvende 1 mL trypsin indeholder 0,025% EDTA.
- Drej forsigtigt pladen for at få en jævn fordeling af trypsin.
- Placer celler i inkubator ved 37 ˚ C i 5-10 minutter (afhængig af celletype). Fra tid til anden kontrollere, om celler er fritliggende ved at ryste plade.
- Cellerne i 10-20 ml medium og samle dem i et 50 ml Falcon rør.
- Tælle celler ved hjælp af en Beckman tæller. Antallet af celler bør være nok til at sikre et sammenløb af ca 60-70%.
- Plate cellerne og lade dem frø til 6-8 timer.
2. Transinfektion
- Forud for transfektion, varme op en portion af serum-fri medium i et vandbad ved 37 ˚ C.
- Bring X-treme Gene 9 til stuetemperatur.
- Pipette serum frit medie i 2 Eppendorf rør (1 rør = 1 transfektion).
- Pipette X-treme Gene 9 i serum frit medium opmærksom på, at spidsen ikke rører plastik væg Eppendorf og inkuber i 5 minutter. I mellemtiden forbereder to DNA-miks: i det ene rør Bland plasmider for renilla, Firefly og en tom vektor kontrol, i et andet rør renilla, Firefly og den molekylære anstandsdame.
- Tilsæt DNA-mix til hver Eppendorf indeholder serum frit medium + X-treme Gene 9, vortex og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Tilsæt dråbevis hver blanding på hver tallerken og inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2
3. Opdeling af celler
- 24 timer efter transfektion, trypsinize de celler, som beskrevet i 1,4 til 1,6 og fortyndes dem til en endelig confluency af 60-70% i en 6-brønds plade.
- Forbered en plade for den ikke-chokeret-kontrol og lige så mange plader, efterhånden som opsvinget tidspunkter, der skal analyseres, som viste i Fig. 2.
4. Heat shock
- For varme chok, præ-varme serum, der indeholder medium i et vandbad ved 37 ˚ C.
- Forbered 'heat shock buffer "ved at fortynde i serum, der indeholder medium cycloheximid til en endelig koncentration på 20 mg / ml og MOPS til 20 mm.
- Nu tager ud pladerne fra rugemaskinen, og aspirér medium.
- Tilføj til hver brønd 1 mL 'Heat shock buffer', og inkuber i 30 minutter ved 37 ˚ C og 5% af CO 2 (omfatter også henvisningen pladen i denne behandling). Dette vil stoppe de novo proteinsyntese.
- I mellemtiden kontakten på et vandbad og sæt temperatur ved 45 ˚ C.
- Efter inkubation forsegle låget af pladerne med Parafilm tidligere skåret i striber. Henvisningen plade (100% af refolfed Firefly) er tilbage i inkubatoren.
- Pladerne inkuberes ved 45 ˚ C i 30 minutter.
- Fjern pladerne fra vandbadet, fjern parafilm og læg pladerne tilbage til kuvøsen til at tillade genvinding.
- På hvert tidspunkt høste celler og vaske dem i PBS 1X ved centrifugering på 2000Xg i 1 minut ved 4 ˚ C.
5. Cellelysis og luciferase assay
- For en effektiv cellelysis, snap fryse cellepelleten i flydende kvælstof.
- Tilsæt 200 μl af passiv lysisbuffer fortyndet 1:5 i dobbelt destilleret vand i et glasrør.
- Tilsæt 30 μl af cellen lysat i en 96 brønds plade. Hver prøve er pipetterede i tre eksemplarer.
- Kun de »ikke chokeret 'referenceprøver vil blive brugt tilLæs renilla luciferase aktiviteten, da dette trin bruges til at kontrollere lige transfektion effektivitet.
- Forbered løsninger til analysen. For luciferin løsning fortyndes luciferin til en endelig koncentration på 0,2 mM i Gly-Gly buffer. For Reaktionsbufferen fortyndede DTT og ATP til 1mm endelige koncentration i Gly-Gly buffer. For coelenterazine Reaktionsbufferen, fortyndes coelenterazine til en endelig koncentration på 0,2 ìm i coelenterazine buffer. Hold luciferin løsning og coelenterazine Reaktionsbufferen lys beskyttet.
- Læg nu 96-brønds plade i luminometeret og start programmet "Wallac 1420 Workstation".
- Indføre Pump1 ind i falk rør, der indeholder coelenterazine løsning. Luk låget, så intet lys kan komme i kontakt med røret.
- Vælg fra menuen indstillingen 'Dispenser vedligeholdelse' og marker Pump1.
- Vælg indstillingen 'fylde'.
- For at redigere pladelayout vælge funktionen "Udforsk protokol og resultater" på menuen. Vælg den protokol, og dobbeltklik på den. Vælg nu brønde, der skal læses.
- Gå tilbage til 'Wallac Manager' og klik på 'Start'. Reaktionen mellem renilla luciferase og dets substrat coelenterazine udsender lys med en peak bølgelængde på 482 nm.
- Efter læsning, gå på 'Dispenser vedligeholdelse' og vælg 'Empty' og Pump1 at frigive alle de resterende opløsningen tilbage til glasset.
- Flyt nu tuben til en falk rør, som indeholder vand og marker 'Flush'.
- Efter skylning trin, tømme røret ved at vælge 'Empty'.
- Læg røret fra Pump1 i Reaktionsbuffer falk røret og en fra Pump2 i luciferin falken røret.
- Skift pladen layout.
- Vælg 'Fyld' for Pump1 og Pump2 fra 'DiSpenser Vedligeholdelse 'menuen.
- Vælg protokollen og start læsning. Reaktionen mellem Firefly luciferase og dets substrat luciferin udsender lys med en peak bølgelængde på 560 nm.
- I slutningen af aflæsningen gentages proceduren Empty-Flush-Tomme for Pump1 og Pump2.
- Resultaterne er nu tilgængelige i 'Wallac 1420 Explorer'.
- Hvert eksperiment er tilknyttet en analyse nummer, brugernavn, begynder og slutter dato.
- Resultaterne kan nu eksporteres som en Excel-fil.
- Til beregninger, der er celler inddelt i tre grupper: 1. ikke-chokeret referenceprøver (indstillet som 100% af refolded ildflue luciferase), 2. celler uden molekylære anstandsdame chokeret og varme; 3. celler med molekylære anstandsdame og varme chokeret.
6. Repræsentative resultater
Protein hvorved man genfolder er direkte relateret til tidspunktet for genopretning derfor at teste, om systemet fungerer pro perly, en analyse skal udføres indsamling af celler på forskellige tidspunkter. En direkte korrelation tid / procent, hvorved man genfolder indikerer, at forsøget er korrekt udført, og repræsenterer derfor en begrænsende faktor. Det skal dog altid ment, hvorved man genfolder efter heat shock er en mætning begivenhed og derfor en ordentlig gang kursus analyse bør udføres, før du begynder at eksperimentere.
Figur 1. Oversigt over forsøget. In vivo hvorved man genfolder analyse kræver 3 til 4 dage for at være afsluttet. På dag 1 celler er seedet og transfekteret. Den følgende dag Cellerne er splittet i et mindre format, og på dag 3, de er varme chokerede. På dette punkt er muligt at foretage den luciferase testen lige efter høst cellerne eller gemme cellepelleten ved -80 ° C og udføre analysen i et andet øjeblik
Figur 2. Cell opdelingen. På dag 2 celler er opdelt i en 6-brønds plade. Hver transfektion vil blive fortyndet i en brønd for at få alle de transfektion på samme plade. Hver plade vil svare til en bestemt opsving tid plus et ikke-chokeret henvisning plade.
Figur 3. Repræsentant godt resultat. A. Andel af hvorved man genfolder direkte målt ved ildflue luciferase aktiviteten. Hver søjle diagrammet repræsenterer procentdelen af hvorved man genfolder i fravær (sorte bjælker) og i tilstedeværelse (røde søjler) af en molekylær anstandsdame på forskellige restitutionstid point. B. Sammenhæng mellem tid og hvorved man genfolder i fravær (sort linje) og i tilstedeværelse (rød linje) af anstandsdame. Den r kvadrerede værdier indikerer en god korrelation.
I Fig.3A vises et repræsentativt resultater, hvor cellerne blev indsamlet 15, 30, 45, 60 og 120 minutter efter heat shock i fravær (sorte bjælker) og i tilstedeværelse (røde søjler) af molekylær anstandsdame. Andel af refolded luciferase stiger med forlænget restitutionstid og med transfektion af den molekylære anstandsdame. Sammenhængen mellem hvorved man genfolder og tid til kontrol (Fig. 3B, sort linje) og den molekylære anstandsdame-transfekterede celler (Fig. 3B, rød linje) er vist.
Figur 4. Repræsentant dårligt resultat. A. Andel af hvorved man genfolder direkte målt ved luciferase aktiviteten. Hver søjle diagrammet repræsenterer procentdelen af hvorved man genfolder i fravær (sorte bjælker) og i tilstedeværelse (røde søjler) af en molekylær anstandsdame på forskellige restitutionstid point. B. Sammenhæng mellem tid og hvorved man genfolder i fravær og nærvær (rød lINE) af anstandsdame. Den r kvadrerede værdier indikerer dårlig korrelation.
Figur 4A. Viser et repræsentativt resultat af et eksperiment ikke korrekt udført. Både kontrol (sorte bjælker) og den molekylære anstandsdame-transfekterede celler (røde søjler) ikke viser en stigning i protein hvorved man genfolder med tiden. Desuden har transfektion af de molekylære anstandsdame ikke resultere i en stigning på hvorved man genfolder. Dette dårlige korrelation bekræftes i Fig. 4B viser en R-kvadreret værdi på 0,6619 og 0,1882 for henholdsvis kontrol (sort linje) og den molekylære anstandsdame-transfekterede celler (rød linje).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde en protokol til måling af intracellulære hvorved man genfolder aktivitet molekylære anstandsdamer præsenteres. Hele analysen kan udføres i 3 til 4 dage som det fremgår af oversigten i Fig. 1.
Robusthed og linearitet lyssignal produceret af ildflue og renilla luciferase repræsenterer en solid base for reproducerbarheden af protokollen.
Den kritiske trin i analysen er valget af en effektiv transfektion reagens for at sikre, at overekspression af den molekylære anstandsdame og ildflue luciferase. Reporter gener kunne leveres også med andre metoder som adenoviral infektion 12 eller elektroporation. En anden mulighed er brugen af en transgen cellelinie, hvor udtryk for anstandsdame er kemisk inducerbare (fx en tetracyklin-responderende promotor) 13, mens det gen af ildflue luciferase stabilt er transfekteret. Denne brede vifte af Options gør det således muligt at anvende analysen til flere cellelinjer, herunder primære celler.
Desuden, hvis en celle linie er særligt følsomme over for cycloheximid behandling, kunne ildflue luciferase protein oversættelse blive arresteret af bruge en repressible / inducerbare system.
Siden hvorved man genfolder aktivitet kan variere mellem de molekylære anstandsdamer, bør en titrering af mængden af anstandsdame at være transficeret altid gjort. Når de er etableret i en bestemt celle linje, kan teknikken bruges til at undersøge, hvordan små molekyler og / eller gentic manipulationer kan påvirke anstandsdame aktivitet. Analysen kan udføres også i et mindre format, som en 6 - eller endda en 12-brønds plade.
En af de mest attraktive programmer, er muligheden for at teste hele biblioteker af forbindelser, der kan påvirke anstandsdame aktivitet. I dette særlige tilfælde, stabilt cellelinier tilført de reportergen samt lmaperone er fortrinsvis bruges, for at minimere udsving, der skyldes transfektion effektivitet.
Denne analyse kan også bruges til at undersøge den rolle, som co-aktivatorer eller co-repressor for de molekylære anstandsdamer i protein hvorved man genfolder eller hvordan de påvirker hvorved man genfolder på forskellige stress-stimuli (varme, oxidativ stress, udfoldede protein respons).
Selv om det var fra en celle-baseret eksperiment er muligt at have en mere fysiologisk udlæsning af effekten af stoffer og / eller proteiner på aktiviteten af et bestemt anstandsdame, er det ikke muligt at kvantificere anstandsdame aktivitet med testen her præsenteret. I dette tilfælde ville være mere passende en celle-fri assay som in vitro hvorved man genfolder analyse af ildflue luciferase-eller β-galactosidase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Danilo Maddalo er en modtager af et forsknings-fællesskab, som Young Investigator Group (YIG) fra Karlsruhe Institute of Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
