Summary
このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。
Abstract
このプロトコルは、セルベースのシステムと抑制性/刺激活性を持つ化合物の可能性のある影響で、分子シャペロンの酵素活性を測定する方法を説明します。分子シャペロンは、1を折るタンパク質の調節に関与するタンパク質であり、熱ショック2のようなストレスの侮辱、栄養飢餓および化学薬品/毒3に曝すと細胞の生存を促進する上で重要な役割を持っている。このような理由からシャペロンは、腫瘍の開発、がん細胞4のchemioresistanceだけでなく、神経変性5のようなイベントに関与していることが発見されています。これらの酵素の活性を阻害または刺激することができる小分子の設計は、したがって、癌治療7と神経変性疾患9のほとんどの研究戦略の1つです。ここに記載のアッセイは、特定の分子シャペロンのリフォールディング活性を測定すると、コンピュータの効果を研究する可能性を提供その活動上ounds。この方法で調査、分子シャペロンの遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターのエンコーディングと一緒にトランスフェクトされる。それはすでに変性ホタルルシフェラーゼが分子シャペロン10,11によってリフォールディングすることができることが記載されている。トランスフェクションのコントロールを正常化するとして、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のコードするベクターをトランスフェクトされる。このプロトコルで説明されているすべてのトランスフェクションは、HEK - 293細胞におけるX -番手ジーン11（ロシュ）で実行されます。最初のステップでは、タンパク質合成は、シクロヘキシミドで細胞を処理することにより阻害される。その後、アンフォールディングタンパク質は、30分間45℃での熱ショックによって誘導される。 37回復° C時には、タンパク質はその活性コンフォメーションに再折り畳まれているとホタルルシフェラーゼの活性は、読み出しとして使用される：より多くの光が生成される、より多くの蛋白質は元のコンフォメーションを再度得ているだろう。非熱ショック細胞は、参照（リフォールディングの100％として設定されていますルシフェラーゼ）。
Protocol
1。細胞を播種
- 開始する前に、37℃の水浴中に培地、PBS 1Xおよびトリプシンをウォームアップ˚C
- インキュベーターから細胞を取り出し、培地を吸引除去する。
- 静かにそれらを洗浄する細胞にPBS 1X 5 mLを適用する。
- PBS 1Xを吸引し、0025パーセントEDTAを含有するトリプシンの1 mLを適用します。
- ゆっくりとトリプシンの均一な分布を持つようにプレートを回転させる。
- 37℃インキュベーターで細胞を配置˚C、5〜10分間（細胞の種類によって異なります）。時間からの細胞がプレートを振とうすることにより切り離されているかどうかを確認時に。
- 培地の10〜20 mLで細胞を再懸濁し、50mlファルコンチューブでそれらを収集する。
- ベックマンのカウンタを使用してセルを数える。細胞の数は約60〜70％の合流を確保するために十分なはずです。
- プレート細胞と6〜8時間のためにシードするためにそれらを許可する。
2。トランスてトランスフェクション
- トランスフェクションに先立ち、˚37℃の水浴中で無血清培地のアリコートをウォームアップ
- 室温にX -番手ジーン9をもたらす。
- ピペットで2エッペンドルフチューブ（1チューブ= 1トランスフェクション）の無血清培地。
- 先端が5分間エッペンドルフおよびインキュベートのプラスチック製の壁に接触しないように注意を払って無血清培地でのピペットX -番手遺伝子9。その間に二つのDNAミックスを準備する：1本のチューブに別のチューブのシイタケ、ホタルと分子シャペロンで、シイタケ、ホタルと空のベクトル制御のためのプラスミドを一緒に混ぜる。
- 無血清培地の+ X -番手遺伝子9、20分間室温でボルテックスし、インキュベートを含む各エッペンドルフにDNAミックスを追加。
- ℃、5％CO 2 37℃で24時間各プレートとインキュベートに各ミックスを滴下して追加します。
3。分裂細胞
- トランスフェクション24時間後、tryps1.4で説明したように細胞inize - 1.6を、6ウェルプレートで60から70パーセントの最後のコンフルエンシーにそれらを希釈する。
- 非ショック制御のために一つのプレートを準備して分析する必要が復旧時点と同じくらい多くのプレートは、 図3に示した。 2。
4。熱ショック
- 熱ショック、37℃水浴中で培地を含有するプレ暖かい血清˚Cの
- 20μg/ mlの20 mMのMOPSへの最終濃度に血清含有培地のシクロヘキシミドで希釈することによって"熱ショックバッファ"を準備します。
- 今インキュベーターからプレートを取り出し、培地を吸引除去する。
- "ヒートショックバッファ"の各ウェルに1mLに追加し、37℃で30分間インキュベート˚CとCO 2の5％（また、この治療法の基準板を含む）。これは 、de novoタンパク質合成を停止します。
- 水浴上で一方のスイッチにしてtを設定します。45℃emperature˚C.
- インキュベーション後、以前のストライプにカットパラフィルムでプレートのふたを密封する。基準板（refolfedホタルの100％）インキュベーターに残されている。
- ˚Cで30分間45℃培養する。
- 水浴から板を削除する、パラフィルムを除去し、回復を可能にするためにインキュベーターにバックプレートを置く。
- 各時点の収穫で、細胞と˚Cの4℃で1分間2000Xgで遠心分離することによってPBS 1Xでそれらを洗う
5。細胞溶解とルシフェラーゼアッセイ
- 効率的な細胞溶解のために、液体窒素中で細胞ペレットを凍結スナップ。
- ガラス管に蒸留水で1:5に希釈した受動的溶解緩衝液200μlを追加。
- 96ウェルプレートに細胞ライセート30μlを添加する。各サンプルは三重にピペットで入れる。
- 唯一の"非ショック"参照サンプルがするために使用されます。この手順は同じトランスフェクション効率を確認するために使用されているため、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を読んで。
- アッセイのためのソリューションを準備する。ルシフェリン溶液のためのGly - Glyは、バッファ内の0.2mMの最終濃度にルシフェリンを希釈する。反応バッファーのためのGly - Glyのバッファに1mMの最終濃度になるようにDTTとATPを希釈する。セレンテラジンの反応バッファーの場合は、セレンテラジンのバッファで0.2μMの最終濃度にセレンテラジンを希釈する。ルシフェリン溶液とセレンテラジンの反応バッファーのライトプロテクトをしてください。
- 今ルミノメーターに96ウェルプレートを配置し、プログラム"ワラック1420ワークステーション"を開始します。
- セレンテラジン溶液の入ったファルコンチューブにPump1を導入する。光がチューブに接触することはできませんので、蓋を閉じます。
- オプション'ディスペンサーのメンテナンス"メニューから選択し、Pump1をチェックします。
- オプション'fill'を選択します。
- プレートレイアウトオプションを選択する編集するには、メニューの"プロトコルと結果を見る"。その上のプロトコルとダブルクリックを選択します。今読まれる井戸を選択します。
- "ワラックマネージャ"に戻り、"スタート"をクリックします。ウミシイタケルシフェラーゼおよびその基質セレンテラジンとの反応は、482 nmのピーク波長で発光する。
- お読みになったあと、"ディスペンサーのメンテナンス"に行くとチューブに戻し、すべての残液を解放するために"空"とPump1]を選択します。
- 今水の入ったファルコンチューブにチューブを移動し、"フラッシュを"ダニ。
- フラッシング工程の後に、"空"を選択することでチューブを空にします。
- 反応バッファーファルコンチューブにPump1とルシフェリンファルコンチューブにPump2から一からチューブを置きます。
- プレートのレイアウトを変更。
- "ディからPump1とPump2ために"塗りつぶし"を選択しますスペンサーメンテナンス"メニュー。
- プロトコルを選択して、読み取りを開始します。ホタルルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンとの反応は、560nmのピーク波長で発光する。
- 読書の終わりにPump1とPump2の空 - フラッシュ - 空の手順を繰り返します。
- 結果は、"ワラック1420エクスプローラ"で利用できるようになりました。
- 各実験は、検定番号に関連付けられている、ユーザ名、開始と日付を終了します。
- 結果は、現在、Excelファイルとしてエクスポートすることができます。
- 1：計算では、細胞を3グループに分かれています。非ショックリファレンスサンプル（リフォールディングホタルルシフェラーゼの100％と設定）、2。分子シャペロンと熱ショックなしで細胞を、3。分子シャペロンと熱を持つ細胞がショックを受けた。
6。代表的な結果
タンパク質のリフォールディングは、直接システムがプロに動作しているかどうかをテストするため、回復の時間に関連しています perly、アッセイは、異なる時点で細胞を集め実行する必要があります。直接的な相関時間/リフォールディングの割合は、実験が適切に実施し、そのための制限要因を表していることを示しています。しかしそれは、常に熱ショック後にリフォールディングする飽和イベントであるため、適切な時間経過の分析は、任意の実験を開始する前に実行する必要があることを考慮すべきである。
図1実験の概要 。 in vivoでリフォールディングのアッセイで完了するまでに3〜4日を要します。日に1細胞を播種し、トランスフェクトされる。翌日細胞が小さい形式に分割されているため、3日目では、これらは、熱ショックを受けています。この時点で右の細胞を採取した後、ルシフェラーゼアッセイを実行するか、-80 ° Cで細胞ペレットを保存し、別の瞬間にアッセイを行うことが可能である
図2セルの分割 。 2日目の細胞を6ウェルプレートに分割されます。各トランスフェクションを同じプレート上のすべてのトランスフェクションを持たせるために、ウェルに希釈されます。各プレートには、特定の回復時間を加えたノンショック基準板に対応します。
図3。代表良い結果 。リフォールディングのA.の割合は、直接ホタルルシフェラーゼ活性により測定。各棒グラフは、別の回復時間の点での分子シャペロンの不在下でリフォールディングの割合（黒棒）及び存在下で（赤いバー）を表します。不在（黒線）およびシャペロンの存在（赤線）の時間とリフォールディングの間にBの相関。 R二乗値は良好な相関を示している。
回線のg.3Aは、細胞が15、30、45、60、120分不在の熱ショック（黒棒）の後に、分子シャペロンの存在（赤棒）で収集された代表的な結果を示されています。の割合は、長期の回復時間とし、分子シャペロンのトランスフェクションとルシフェラーゼが増加してリフォールディング。制御のためのリフォールディングと時間との相関関係（ 図3B、黒線）と分子シャペロン-トランスフェクト細胞（ 図3B、赤色の線）が表示されます。
図4代表的な悪い結果 。リフォールディングのA.の割合で直接ルシフェラーゼ活性により測定。各棒グラフは、別の回復時間の点での分子シャペロンの不在下でリフォールディングの割合（黒棒）及び存在下で（赤いバー）を表します。存在しない場合と存在感で、時間とリフォールディングの間にBの相関（レッドLシャペロンのジアミン）。 R二乗の値が不正な相関関係を示している。
図4Aは。正しく行わない実験の代表的な結果を示しています。制御（黒棒）と分子シャペロン-トランスフェクション細胞（赤棒）の両方は、時間の経過とともにリフォールディングタンパク質の増加を示していない。さらに、分子シャペロンのトランスフェクションは、リフォールディングの増加には至っていない。この貧しい相関関係を図で確認されている。制御（黒線）と分子シャペロン-トランスフェクション細胞（赤線）のためにそれぞれ0.6619と0.1882のR二乗値を示す4B。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究では分子シャペロンの細胞内のリフォールディング活性を測定するためのプロトコルが表示されます。 図の概要が示すように全体のアッセイは、3〜4日で行うことができます。 1。
ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼによって生成される光信号の堅牢性と直線性は、プロトコルの再現性のための強固な基盤を表しています。
アッセイの重要なステップは、分子シャペロンとホタルルシフェラーゼの過剰発現を確保するための効率的なトランスフェクション試薬の選択です。レポーター遺伝子は、アデノウイルス感染症の12またはエレクトロポレーションのような他の方法でも配信される可能性があります。ホタルルシフェラーゼの遺伝子を安定にトランスフェクトされている間に、別の可能性は、シャペロンの発現が（テトラサイクリン応答性プロモーターを例えば）13化学的に誘導可能な遺伝子組換え細胞株を使用することです。最適のこの広い範囲アドオンは、一次電池を含むいくつかの細胞株へのアッセイのアプリケーションを、こうして可能になります。
また、細胞株はシクロヘキシミド治療に特に敏感である場合、ホタルルシフェラーゼタンパク質の翻訳を使用する抑制性/誘導システムによって逮捕される可能性があります。
リフォールディング活性は分子シャペロン間で異なる可能性があるので、トランスフェクトされるシャペロンの量の滴定は常に行う必要があります。一度特定の細胞株で確立された、技術は、小分子および/またはgentic操作がシャペロン活性に影響を与えることができる方法を調査するために使用することができます。あるいは12ウェルプレート - アッセイは、6のように、小さいフォーマットでも行うことができます。
最も魅力的なアプリケーションの一つは、シャペロン活性に影響を与えることができる化合物のライブラリ全体をテストする可能性があります。この特定のケースでは、細胞株は安定的にレポーター遺伝子と同様にchでトランスフェクトaperoneは、優先的にトランスフェクション効率に起因する変動を最小限にするために、使用されています。
このアッセイはまた、共同活性化剤または蛋白質のリフォールディングにおけるまたはそれらがどのように異なるストレス刺激（熱、酸化ストレスは、小胞体ストレス応答）によりリフォールディングに影響を与える分子シャペロンのコリプレッサーの役割を調べるために使用することができます。
細胞ベースの実験から、特定のシャペロンの活性に対する化合物および/またはタンパク質の効果をより生理的な読み出しを持つことが可能な場合でも、それはここで紹介するアッセイでシャペロン活性を定量化することはできません。この場合、ホタルルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼの in vitroリフォールディングアッセイのような無細胞アッセイより適切であろう。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
ダニーロMaddaloは、カールスルーエ工科大学から若手研究者グループ（YIG）などの研究フェローシップの受賞者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
