في هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس البروتين داخل الخلايا refolding بعد الصدمة الحرارية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة foldases مثل المحرمين الجزيئية وتعاونها عوامل أو مركبات قادرة على التأثير على نشاطها. يستخدم يراعة النشاط luciferase كمراسلة لقياس النشاط refolding كوصي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس النشاط الإنزيمي للمرافقين الجزيئية في نظام خلية القاعدة والآثار المحتملة للمركبات مع النشاط المثبطة / محفزة. المحرمين الجزيئية هي البروتينات المشاركة في التنظيم من البروتين للطي (1) ويكون لها دور حاسم في تعزيز بقاء الخلية على الشتائم الإجهاد مثل الصدمة الحرارية 2 والتجويع المغذيات والتعرض للمواد الكيميائية / السموم 3. لهذا السبب تم العثور على المحرمين أن تشارك في المناسبات مثل التنمية الورم ، chemioresistance الخلايا السرطانية فضلا عن 4 5 تنكس عصبي. تصميم جزيئات صغيرة قادرة على تثبيط أو تحفز نشاط هذه الانزيمات وبالتالي واحدة من أكثر الاستراتيجيات درس لعلاج السرطان والاضطرابات العصبية 7 9. في مقايسة الموصوفة هنا توفر إمكانية لقياس النشاط refolding من كوصي على وجه الخصوص والجزيئية لدراسة تأثير شركاتounds على نشاطها. في هذا الأسلوب هو transfected الجين من كوصي الجزيئية التحقيق مع تعبير لناقلات ترميز الجين luciferase يراعة. وقد وصفته بالفعل يمكن denaturated يراعة luciferase refolded بواسطة المحرمين الجزيئية 10،11. كما تطبيع السيطرة ترنسفكأيشن ، يتم ترميز transfected ناقلات للجينات في luciferase renilla. يتم تنفيذ كافة transfections الموصوفة في هذا البروتوكول مع الأبله المتطرفة جين 11 (روش) في خلايا - 293 كلوة الجنين البشري. في الخطوة الأولى ، يتم منع تصنيع البروتين عن طريق علاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد. بعد ذلك يتم بفعل بروتين الصدمة الحرارية التي تتكشف في 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد شفائهم عند 37 درجة مئوية ، ويتم إعادة مطوية البروتينات في التشكل بصورة نشطة ، ويستخدم نشاط luciferase يراعة للقراءة المغادرة : سوف تنتج المزيد من الضوء ، سيكون لديك المزيد من البروتين إعادة التشكل اكتسبت الأصلي. يتم تعيين غير حرارة الخلايا صدمت كمرجع (100 ٪ من refoldedluciferase).
البروتوكول
1. بذر الخلايا
- قبل أن يبدأ الاحماء المتوسطة والثقافة ، وبرنامج تلفزيوني والتربسين 1X في حمام من الماء عند 37 ˚ C
- تأخذ الخلايا من الحاضنة ونضح في المتوسط.
- تطبق بلطف 5 مل من 1X PBS على خلايا لغسلها.
- نضح في برنامج تلفزيوني وتطبيق 1X 1 مل من التربسين التي تحتوي على 0025 ٪ EDTA.
- تدوير لوحة بلطف أن يكون هناك توزيع عادل للالتربسين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل هو تقديم بروتوكولا لقياس نشاط الخلايا refolding من المحرمين الجزيئية. ويمكن إجراء فحص كامل في 3 إلى 4 أيام كما هو مبين من خلال نظرة عامة في الشكل. 1.
متانة والخطي من الإشارات الضوئية التي تنتجها يراعة وluciferase renilla تمثل قاعدة صلبة للاستنساخ من البروتوكول.
الخطوة الحاسمة للمقايسة هو الخيار لكاشف ترنسفكأيشن فعال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
دانيلو Maddalo هو حاصل على زمالة بحثية والفريق محقق يونغ (YIG) من معهد كارلسروه للتكنولوجيا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
عن هذه التجربة "الخفيفة المتجهات' إلى Luminometer شكل بيركن إلمر عداد التلألؤ '1420كان يستخدم
برامج لLuminometer :
Renilla : مضخة 1 ، 100 حقن ميكرولتر
رد فعل الاحتياطي : Pump1 ، 70 حقن ميكرولتر
Luciferin : Pump2 ، حقن 30μl
لمخازن إعداد هذه الحلول الأسهم في الماء المقطر مزدوجة :
- -- 1M MgSO 4 : 246،48 ز MgSO 4 * 7H 2 O في 1 ليتر
- -- 0،5 م EGTA : 190،18 ز EGTA في 1 ليتر
- -- 1M KH 2 ص 4 : 136،09 ز KH 2 PO 4 في 1 ليتر
- -- 1M K2 هبو 4 : 228،23 ز ك 2 هبو 4 * 3H 2 O في 1 ليتر
- -- كلوريد الصوديوم 5M : 292،2 غرام كلوريد الصوديوم في 1 ليتر
- -- 0،5 م EDTA : 186،12 ز EDTA * 2H 2 O في 1 ليتر
الغليسين - الغليسين العازلة :
- -- 25mM Glycylglycin
- -- 15mM MgSO 4
- -- 4mM EGTA
1 لتر للاستخدام 3،3 غرام من Glycylglycin ، 15ml حل MgSO4 1M و8ml حل EGTA 0،5 م. حل في الماء ، وضبط درجة الحموضة إلى 7،8 وتقديمهم إلى إجمالي حجم 1 لتر.
العازلة للتفاعل Renilla / Coelenterazine العازلة :
- -- وملحوظةس ؛ 13،4 ملي KH 2 PO 4
- -- 86،6 ملي KH 2 PO 4
- -- كلوريد الصوديوم 0،5 M
- -- 1MM EDTA
1 مل ليتر 13،4 استخدام 1M KH 2 ص 4 حل ، 86،6 مل من محلول 1M K 2 4 هبو ، 100ML حل كلوريد الصوديوم و5M 2ml حل EDTA 0،5 م.
| شركة | كتالوج / رقم المنتج : | |
| DMEM (Dulbecco في التعديل النسر متوسطة 1X) | GIBCO | 41966029 |
| الجنين الذهب المصل البقري | PAA | A15 - 151 |
| الأبله المتطرفة جين 9 الحمض النووي ترنسفكأيشن الكاشف | روش | 06365809001 |
| برنامج تلفزيوني التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة 1X | GIBCO | 14190-094 |
| اجتماعات الأطراف 3 -- (N - Morpholino) Propanesulfonic حمض | SIGMA الدريخ | M1254 |
| سيكلوهيكسيميد | SIGMA الدريخ | C7698 |
| الاحتياطي السلبي تحلل 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin | SIGMA الدريخ روث روث | G7278 3054.2 P027.1 |
KH 2 PO 4 | روث روث روث روث | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 |
| Luciferin اليراع | Biosynth | L8200 |
| Coelenterazine | Biosynth | C7000 |
| DTT (Dithiothreitol) | روث | 6908.2 |
| اعبي التنس المحترفين (الأدينوساين ثلاثي) | روش | 10519987001 |
المراجع
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
