Summary
Dans ce protocole, une méthode pour mesurer le repliement des protéines intracellulaires, après choc thermique est décrite. Cette méthode peut être utilisée pour étudier foldases comme chaperons moléculaires et leurs co-facteurs ou des composés capables d'influencer leur activité. Firefly activité luciférase est utilisée en tant que reporter pour mesurer l'activité de repliement chaperon.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode pour mesurer l'activité enzymatique de chaperons moléculaires dans un système basé sur des cellules et les effets possibles des composés ayant une activité inhibitrice / stimulant. Chaperons moléculaires sont des protéines impliquées dans la régulation de repliement des protéines 1 et ont un rôle crucial dans la promotion de la survie des cellules après les insultes de stress comme deux de choc thermique, la famine en éléments nutritifs et l'exposition aux produits chimiques / poisons 3. Pour cette raison, les accompagnateurs sont trouvés d'être impliqués dans des événements comme le développement des tumeurs, chemioresistance de 4 cellules cancéreuses ainsi que la neurodégénérescence 5. Conception de petites molécules capables d'inhiber ou de stimuler l'activité de ces enzymes est donc l'une des stratégies les plus étudiés pour 7 thérapie du cancer et les maladies neurodégénératives 9. Le test décrit ici offre la possibilité de mesurer l'activité de repliement d'un chaperon moléculaire particulière et d'étudier l'effet de la maquetteounds sur son activité. Dans cette méthode, le gène de l'enquête chaperon moléculaire est transfecté avec une vecteur d'expression codant pour le gène de la luciférase de luciole. Il a déjà été décrit que dénaturée luciférase de luciole peut être replié par des chaperons moléculaires 10,11. Comme normaliser le contrôle de transfection, un vecteur codant pour le gène de la luciférase Renilla est transfecté. Toutes les transfections décrites dans ce protocole sont effectués avec X-treme Gene 11 (Roche) dans les cellules HEK-293. Dans la première étape, la synthèse protéique est inhibée par le traitement des cellules avec du cycloheximide. Par la suite, le dépliement des protéines est induite par choc thermique à 45 ° C pendant 30 minutes. Lors de la récupération à 37 ° C, les protéines sont à nouveau repliés dans leur conformation active et l'activité de la luciférase de luciole est utilisé comme lecture: plus la lumière sera produite, le plus de protéines auront regagné la conformation d'origine. Non-thermique cellules choqués sont fixés comme référence (100% des repliéeluciférase).
Protocol
1. Ensemencement des cellules
- Avant de commencer, faites chauffer le milieu de culture, le PBS 1X et la trypsine dans un bain d'eau à 37 ˚ C
- Prenez les cellules de l'incubateur et aspirer le milieu.
- Appliquez doucement 5 ml de PBS 1X sur les cellules pour les laver.
- Aspirer le PBS 1X et appliquer 1 ml de trypsine EDTA contenant 0,025%.
- Tournez doucement la plaque pour avoir une distribution uniforme de la trypsine.
- Placez les cellules dans l'incubateur à 37 ˚ C pendant 5-10 minutes (selon le type de cellule). Du temps de vérifier le temps si les cellules sont détachées en secouant la plaque.
- Resuspendre les cellules dans 10-20 ml de milieu et de les recueillir dans un tube Falcon de 50 ml.
- Compter les cellules en utilisant un compteur Beckman. Le nombre de cellules devrait être suffisant pour assurer une confluence d'environ 60-70%.
- Assiette des cellules et leur permettent de graines pendant 6-8 heures.
2. Transperfection
- Avant la transfection, réchauffer une aliquote de milieu sans sérum dans un bain d'eau à 37 ˚ C.
- Porter le gène X-treme de 9 à température ambiante.
- Déposer le milieu sans sérum dans des tubes Eppendorf 2 (1 = 1 tube de transfection).
- Déposer le gène X-treme 9 dans l'attention du milieu sans sérum payer que la pointe ne touche pas le mur en plastique de l'eppendorf et incuber pendant 5 minutes. En attendant de préparer deux mélanges d'ADN: dans un tube mélanger les plasmides pour Renilla, luciole et une lutte antivectorielle vide, dans un autre tube de Renilla, luciole et le chaperon moléculaire.
- Ajouter le mélange d'ADN à chaque Eppendorf contenant milieu sans sérum + X-treme Gene 9, vortex et incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
- Ajouter goutte à goutte de chaque mélange sur chaque assiette et laisser incuber pendant 24 heures à 37 ° C et CO 2 5%
3. Fractionnement des cellules
- 24 heures après transfection, trypsinize les cellules comme décrit dans 1.4 à 1.6 et les diluer à une confluence finale de 60-70% dans une plaque à 6 puits.
- Préparer une plaque pour le contrôle non choqué et que de nombreuses plaques que les points de temps de récupération qui doivent être analysés, comme l'a montré dans la Fig. 2.
4. Choc thermique
- Pour un choc thermique, préchauffer le sérum contenant du milieu dans un bain d'eau à 37 ˚ C.
- Préparer «tampon de choc thermique» par dilution dans la cycloheximide milieu contenant du sérum à une concentration finale de 20 ug / ml et à 20 mM MOPS.
- Maintenant sortez les plaques de l'incubateur et aspirer le milieu.
- Ajouter à chaque puits 1 ml de «tampon de choc thermique», et incuber pendant 30 minutes à 37 ˚ C et 5% de CO 2 (inclure également la plaque de référence dans ce traitement). Cela arrêtera la synthèse de novo de protéines.
- En attendant le passage sur un bain d'eau et mettre le température à 45 ˚ C.
- Après incubation, sceller le couvercle des plaques avec du Parafilm préalablement coupés en bandes. La plaque de référence (100% de refolfed Firefly) est laissé dans l'incubateur.
- Incuber les plaques à 45 ˚ C pendant 30 minutes.
- Retirez les plaques du bain d'eau, retirez le parafilm et mettre les plaques de revenir à l'incubateur pour permettre la récupération.
- A chaque récolte point dans le temps les cellules et les laver dans du PBS 1X par centrifugation à 2000Xg pendant 1 minute à 4 ˚ C.
5. La lyse cellulaire et le dosage de luciférase
- Pour une lyse cellulaire efficace, snap figer le culot cellulaire dans l'azote liquide.
- Ajouter 200 ul de tampon de lyse passive dilué à 1:5 dans l'eau bidistillée dans un tube de verre.
- Ajouter 30 ul du lysat cellulaire dans une plaque 96 puits. Chaque échantillon est pipeté en trois exemplaires.
- Seul le «non choqués» des échantillons de référence seront utilisées pourlire l'activité Renilla luciférase, puisque cette étape est utilisé pour vérifier l'efficacité de transfection égaux.
- Préparer les solutions pour le dosage. Pour la solution de luciférine diluer luciférine à une concentration finale de 0,2 mM dans Gly-Gly tampon. Pour diluer le tampon de réaction de la TNT et l'ATP à 1mm concentration finale dans Gly-Gly tampon. Pour un tampon de réaction coelentérazine, diluer coelentérazine à une concentration finale de 0,2 uM dans un tampon de coelentérazine. Conserver la solution luciférine et la lumière du tampon de réaction coelentérazine protégés.
- Maintenant, placez la plaque de 96 puits dans le luminomètre et démarrer le programme «Wallac 1420 Workstation.
- Introduire le PUMP1 dans le tube contenant la solution Falcon coelentérazine. Fermer le couvercle afin qu'aucune lumière ne puisse entrer en contact avec le tube.
- Choisissez dans le menu 'entretien Distributeur »de l'option et cochez PUMP1.
- Sélectionnez l'option 'Fill'.
- Pour modifier la disposition de la plaque choisissez l'option «Explorer le protocole et les résultats» dans le menu. Sélectionnez le protocole et cliquez deux fois dessus. Maintenant, sélectionnez le puits d'être lu.
- Retour à «Wallac Manager 'et cliquez sur" Démarrer ". La réaction entre la luciférase Renilla et son substrat coelentérazine émet de la lumière avec une longueur d'onde maximale de 482 nm.
- Après la lecture, allez sur «l'entretien distributeur» et sélectionnez «vide» et à libérer tous les PUMP1 la solution résiduelle vers le tube.
- Maintenant, déplacez le tube à un tube Falcon contenant de l'eau et de cocher la case "Flush".
- Après l'étape de rinçage, vider le tube en sélectionnant 'vide'.
- Placer le tube d'PUMP1 dans le tube de réaction de tampon faucon et celle de Pump2 dans le tube de luciférine faucon.
- Modifier la mise en assiette.
- Sélectionnez «Remplir» pour PUMP1 et Pump2 du Di 'Spenser entretien »du menu.
- Sélectionnez le protocole et commencer la lecture. La réaction entre la luciférase Firefly et son substrat luciférine émet de la lumière avec une longueur d'onde maximale de 560 nm.
- A la fin de la lecture répéter la procédure vide-Flush-vide pour PUMP1 et Pump2.
- Les résultats sont maintenant disponibles dans le «Wallac 1420 Explorer».
- Chaque expérience est associée à un numéro d'essai, identifiant, mot de commencer et la date de fin.
- Les résultats peuvent maintenant être exportés dans un fichier Excel.
- Pour les calculs, les cellules sont divisées en trois groupes: 1. échantillons de référence non choqué (fixée à 100% de la luciférase de luciole repliée), 2. cellules sans chaperon moléculaire et à un choc thermique; 3. cellules avec chaperon moléculaire et choc thermique.
6. Les résultats représentatifs
Repliement des protéines est directement liée au temps de récupération donc de tester si le système fonctionne Pro Perly, un test doit être effectuée la collecte des cellules à différents temps. Une corrélation directe du temps / pourcentage de repliement indique que l'expérience a été correctement effectuée et représente donc un facteur limitant. Cependant, il faut toujours considéré que le repliement après le choc thermique est un événement saturer et donc une analyse en temps bon parcours doit être effectué avant de commencer toute expérimentation.
Figure 1. Vue d'ensemble de l'expérience. En test in vivo requiert repliement 3 à 4 jours pour être complétée. Le jour 1, les cellules sont ensemencées et transfectées. Les cellules sont lendemain découpée en un format plus petit et le jour 3, ils sont choqués de la chaleur. À ce point est possible d'effectuer le dosage de luciférase juste après la récolte des cellules ou de sauver le culot cellulaire à -80 ° C et effectuer les essais en un autre moment
Figure 2. Fractionnement cellulaire. Le jour 2 cellules sont réparties dans une plaque à 6 puits. Chaque transfection sera dilué dans un puits afin d'avoir tous la transfection sur la même plaque. Chaque plaque correspond à un temps de récupération, plus particulièrement une plaque de référence non choqué.
Figure 3. Représentant bon résultat. A. Pourcentage de repliement directement mesurée par la luciole activité luciférase. Chaque graphique représente le pourcentage de repliement en l'absence (barres noires) et en présence (barres rouges) d'un chaperon moléculaire à différents moments de récupération. B. Corrélation entre le temps et en l'absence de repliement (ligne noire) et en présence (ligne rouge) du chaperon. Les valeurs r au carré montrent une bonne corrélation.
Dans Fig.3A est montré un résultat représentatif où les cellules ont été collectées de 15 minutes, 30, 45, 60 et 120 après un choc thermique en l'absence (barres noires) et en présence (barres rouges) de chaperon moléculaire. Pourcentage des replié augmente la luciférase avec le temps de récupération prolongée et à la transfection du chaperon moléculaire. La corrélation entre le repliement et l'heure pour le contrôle (figure 3B, la ligne noire) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (figure 3B, la ligne rouge) est montré.
Figure 4. Représentant mauvais résultat. A. Pourcentage de repliement directement mesurée par l'activité luciférase. Chaque graphique représente le pourcentage de repliement en l'absence (barres noires) et en présence (barres rouges) d'un chaperon moléculaire à différents moments de récupération. B. Corrélation entre le temps et en l'absence de repliement et en présence (rouge L) ine du chaperon. Les valeurs de corrélation r au carré indiquent mauvais.
La figure 4A. Montre un résultat représentatif d'une expérience pas correctement effectué. Tant le contrôle (barres noires) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (barres rouges) ne montrent pas une augmentation des protéines de repliement avec le temps. En outre, la transfection du chaperon moléculaire n'a pas abouti à une augmentation de repliement. Cette faible corrélation est confirmée dans la Fig. 4B montrant une valeur r au carré de 0,6619 et de 0,1882 respectivement pour le contrôle (ligne noire) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (ligne rouge).
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Discussion
Dans ce travail, un protocole visant à mesurer l'activité de repliement intracellulaire de chaperons moléculaires sont présentés. Le dosage de l'ensemble peut être réalisé en 3 à 4 jours comme indiqué par la vue d'ensemble sur la Fig. 1.
La robustesse et la linéarité du signal de la lumière produite par la luciole et la luciférase Renilla représentent une base solide pour la reproductibilité du protocole.
L'étape critique de l'essai est le choix d'un réactif de transfection efficaces pour assurer la surexpression de la chaperone moléculaire et la luciférase de luciole. Les gènes rapporteurs pourraient être livrées également avec d'autres méthodes comme l'infection adénovirale 12 ou l'électroporation. Une autre possibilité est l'utilisation d'une lignée de cellules transgéniques où l'expression du chaperon est chimiquement inductible (par exemple, un promoteur tétracycline-réactive) 13, tandis que le gène de la luciférase de luciole est transfectées de façon stable. Ce large éventail d'Options rend ainsi possible l'application de l'épreuve à plusieurs lignées cellulaires, y compris les cellules primaires.
Par ailleurs, si une lignée cellulaire est particulièrement sensible à un traitement cycloheximide, traduction firefly luciférase protéines pourraient être arrêtés par l'utilisation d'un répressible / système inductible.
Puisque l'activité de repliement peut varier entre les chaperons moléculaires, une titration de la quantité de chaperon à transfecter devrait toujours être fait. Une fois établi dans une lignée cellulaire particulière, la technique peut être utilisée pour étudier comment les petites molécules et / ou des manipulations gentic peut affecter l'activité chaperon. Le dosage peut être effectué aussi dans un format plus petit, comme un 6 - ou même une plaque de 12 puits.
Une des applications les plus attrayants est la possibilité de tester des bibliothèques entières de composés qui peuvent influencer l'activité chaperon. Dans ce cas particulier, les lignées de cellules transfectées de façon stable avec le gène rapporteur ainsi que le CHaperone sont préférentiellement utilisés, afin de minimiser les variations dues à l'efficacité de la transfection.
Ce test peut être également utilisé pour étudier le rôle des co-activateurs ou co-répresseur de l'chaperons moléculaires dans le repliement des protéines ou comment ils influencent le repliement sur des stimuli différents stress (chaleur, le stress oxydatif, déplié la réponse des protéines).
Même si à partir d'une expérience basée sur des cellules est possible d'avoir une lecture plus physiologique de l'effet des composés et / ou de protéines sur l'activité d'un chaperon en particulier, il n'est pas possible de quantifier l'activité chaperon avec le test présenté ici. Dans ce cas, serait plus approprié un test sans cellule comme dans un test in vitro de repliement de la luciférase de luciole ou β-galactosidase.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Danilo Maddalo est récipiendaire d'une bourse de recherche du groupe Young Investigator (YIG) de l'Institut de Technologie de Karlsruhe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
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