Summary
En este protocolo un método para medir el replegamiento de proteínas intracelulares tras el choque térmico se describe. Este método puede ser usado para estudiar foldases como chaperones moleculares y sus co-factores o componentes capaces de influir en su actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se utiliza como reportero para medir la actividad de las chaperonas replegado.
Abstract
Este protocolo describe un método para medir la actividad enzimática de las chaperonas moleculares en un sistema basado en células y los posibles efectos de los compuestos con actividad inhibitoria / estimulante. Chaperonas moleculares son proteínas implicadas en la regulación de un plegamiento de proteínas y tienen un papel crucial en la promoción de la supervivencia celular al estrés, como los insultos de choque térmico 2, el hambre de nutrientes y la exposición a productos químicos / venenos 3. Por esta razón, los acompañantes se encuentran para participar en eventos como el desarrollo de tumores, chemioresistance de 4 células de cáncer, así como la neurodegeneración 5. El diseño de pequeñas moléculas capaces de inhibir o estimular la actividad de estas enzimas es por lo tanto, una de las estrategias más estudiadas para el tratamiento del cáncer y enfermedades neurodegenerativas 7 9. El ensayo aquí descrito ofrece la posibilidad de medir la actividad de replegamiento de una chaperona molecular en particular y para estudiar el efecto de un borradorHeridas en su actividad. En este método el gen de la chaperona molecular se investiga transfectadas con un vector de codificación de expresión para el gen de la luciferasa de luciérnaga. Ya se ha descrito que desnaturalizan luciferasa de luciérnaga puede ser replegada por chaperonas moleculares 10,11. Como la normalización de control de transfección, un vector de codificación para el gen de la luciferasa Renilla es transfectadas. Todas las transfecciones se describe en este protocolo se realizan con X-treme Gene 11 (Roche) en células HEK-293. En el primer paso, la síntesis de proteínas es inhibida por el tratamiento de las células con cicloheximida. A partir de entonces se desarrolla la proteína inducida por choque térmico a 45 ° C durante 30 minutos. Sobre la recuperación a 37 ° C, las proteínas son re-doblado en su conformación activa y la actividad de la luciferasa de luciérnaga se utiliza como lectura: la luz se producirá más, la proteína más tendrá recuperó la conformación original. No-calor células sorprendido se establecen como referencia (100% de replegarseluciferasa).
Protocol
1. Sembrar las células
- Antes de empezar, calentar el medio de cultivo, el PBS 1X y tripsina en un baño de agua a 37 ˚ C
- Tomar las células de la incubadora y se aspira el medio.
- Aplique suavemente 5 ml de PBS 1X en las células para lavarlos.
- Aspirar el PBS 1X y aplicar 1 ml de tripsina que contiene 0,025% de EDTA.
- Gire suavemente la placa para tener una distribución uniforme de la tripsina.
- Coloque las células de la incubadora a 37 ˚ C durante 5-10 minutos (dependiendo del tipo de célula). De vez en vez, compruebe si las células están separadas por agitación de la placa.
- Resuspender las células en 10-20 ml de medio y recoger en un tubo Falcon de 50 ml.
- Contar las células mediante un contador Beckman. El número de células debería ser suficiente para garantizar una confluencia de 60-70%.
- Placa de las células y les permiten a las semillas durante 6-8 horas.
2. Transinfección
- Antes de la transfección, se caliente una alícuota de medio libre de suero en un baño de agua a 37 ˚ C.
- Lleva el gen X-treme 9 a temperatura ambiente.
- Pipetear el medio libre de suero en dos tubos eppendorf (1 tubo = 1 transfección).
- Pipeta de la Gene X-treme 9 en la atención de medio libre de suero que paga la punta no toque la pared de plástico del eppendorf y se incuban durante 5 minutos. Mientras tanto preparar dos mezclas de ADN: en un tubo se mezclan los plásmidos de renilla, luciérnagas y un control de vector vacío, en otro tubo de renilla, luciérnaga y la chaperona molecular.
- Añadir la mezcla de ADN a cada eppendorf conteniendo medio libre de suero + X-treme Gene 9, vortex e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Añadir gota a gota cada mezcla en cada plato y se incuba durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2
3. La división de las células
- 24 horas después de la transfección, trypsinize las células como se describe en 1,4 a 1,6 y se diluye a una confluencia final de 60-70% en una placa de 6 pocillos.
- Preparar un plato para el control no sorprendió y tantas placas como los puntos de tiempo de recuperación que tienen que ser analizados, como se muestra en la fig. 2.
4. De choque térmico
- De choque térmico, pre-caliente el suero que contienen medio de un baño de agua a 37 ˚ C.
- "Amortiguador de choque térmico" preparar diluyendo en medio que contenía suero cicloheximida a una concentración final de 20 mg / ml y MOPS a 20 mm.
- Ahora, corta las placas de la incubadora y aspirar el medio.
- Añadir a cada pocillo 1 ml de "amortiguador de choque térmico, y se incuba durante 30 minutos a 37 ˚ C y 5% de CO 2 (incluye también la placa de referencia en este tratamiento). Esto evitará que la síntesis de novo de proteínas.
- Mientras tanto en el interruptor en un baño de agua y establecer el temperatura a 45 ˚ C.
- Después de la incubación, el sello de la tapa de las placas con Parafilm previamente cortado en tiras. La placa de referencia (100% de refolfed luciérnaga) se deja en la incubadora.
- Las placas se incuban a 45 ˚ C durante 30 minutos.
- Retire las placas del baño de agua, quitar la parafina y poner las placas de nuevo a la incubadora para permitir la recuperación.
- En cada punto de tiempo de la cosecha de las células y los lava en PBS 1X por centrifugación a 2000Xg durante 1 minuto a 4 ˚ C.
5. Lisis celular y ensayo luciferasa
- Para una lisis celular eficiente, snap congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido.
- Añadir 200 ul de buffer de lisis pasiva diluida 1:5 con agua destilada en un tubo de vidrio.
- Añadir 30 l de lisado de células en una placa de 96 pocillos. Cada muestra está contaminada por triplicado.
- Sólo el "no sorprendió" muestras de referencia será utilizado paraleer la actividad de la luciferasa Renilla, ya que este paso se utiliza para comprobar la eficacia de transfección de igualdad.
- Preparar las soluciones para el ensayo. Para la solución de luciferina diluir luciferina a una concentración final de 0,2 mM de Gly-Gly buffer. Para el tampón de reacción diluir la TDT y la concentración de ATP 1 mM final en Gly-Gly buffer. Para el buffer de coelenterazine reacción, diluir coelenterazine a una concentración final de 0,2 M en tampón coelenterazine. Conservar la solución de luciferina y la reacción coelenterazine luz buffer protegida.
- Ahora coloque la placa de 96 pozos en el luminómetro e iniciar el programa "Wallac 1420 estaciones de trabajo".
- Introducir el Pump1 en el tubo Falcon que contiene la solución coelenterazine. Cierre la tapa de la luz por lo que no puede entrar en contacto con el tubo.
- Seleccione en el menú de mantenimiento de dispensador de 'la opción y marque Pump1.
- Seleccione la opción 'Fill'.
- Para modificar el diseño de la placa de elegir la opción "Explorar el protocolo y los resultados" en el menú. Seleccione el protocolo y haga clic dos veces en la misma. A continuación, seleccione los pozos para ser leído.
- Volver a 'Wallac Manager' y haga clic en 'Inicio'. La reacción entre la luciferasa Renilla y su sustrato coelenterazine emite luz con una longitud de onda máxima de 482 nm.
- Después de la lectura, ir a "mantenimiento del dispensador" y seleccione "Vaciar y Pump1 a liberar a todos de nuevo la solución residual al tubo.
- Ahora mueva el tubo a un tubo Falcon que contiene agua y marca la casilla "Flush".
- Tras la etapa de lavado, vaciar el tubo mediante la selección de "vacío".
- Coloque el tubo de Pump1 en el buffer de tubo de reacción de halcón y el de Pump2 en el tubo de la luciferina halcón.
- Cambiar el diseño de la placa.
- Seleccione 'Fill' para Pump1 y Pump2 de la Di-Spenser menú de mantenimiento.
- Seleccione el protocolo y empezar la lectura. La reacción entre la luciferasa de luciérnaga y su sustrato luciferina emite luz con una longitud de onda máxima de 560 nm.
- Al final de la lectura, repita el procedimiento vacía-Flush-vacío para Pump1 y Pump2.
- Los resultados ya están disponibles en el 'Wallac 1420 Explorer'.
- Cada experimento se asocia a un número de prueba, nombre de usuario, fecha de inicio y fin.
- Los resultados ya se pueden exportar como un archivo de Excel.
- Para los cálculos, las células se dividen en tres grupos: 1. no sorprendió las muestras de referencia (fijado en un 100% de replegarse luciferasa de luciérnaga), 2. células sin chaperón molecular y sometidos a desconchado térmico, 3. células con chaperón molecular y el calor sorprendió.
6. Resultados representante
Plegamiento de proteínas se relaciona directamente con el tiempo de recuperación por lo tanto, para probar si el sistema está trabajando a favor Perly, un ensayo se debe realizar la recogida de las células en diferentes momentos. Existe una correlación directa tiempo / porcentaje de replegamiento indica que el experimento ha sido realizado correctamente y por lo tanto representa un factor limitante. Sin embargo debe ser considerado siempre que el repliegue tras el choque térmico es un evento de saturación y por lo tanto, un análisis de tiempo de curso apropiado se debe realizar antes de comenzar cualquier experimento.
Figura 1. Descripción general del experimento. En el ensayo in vivo replegado requiere de 3 a 4 días para ser completado. El día 1 se siembran las células y transfectadas. El día siguiente, las células están divididos en un formato más pequeño y el día 3 que son sometidos a desconchado térmico. En este punto es posible realizar el ensayo de luciferasa después de recoger las células o para guardar el pellet de células a -80 ° C y realizar el ensayo en otro momento
Figura 2. División celular. El día 2 las células se dividen en una placa de 6 pocillos. Cada transfección se diluye en un pozo con el fin de tener toda la transfección en la misma placa. Cada placa se corresponderá con un tiempo de recuperación concreto, más una placa de referencia no sorprendió.
Figura 3. Representante buen resultado. Porcentaje de A. replegado medido directamente por la actividad luciferasa de luciérnaga. Cada gráfico de barras representa el porcentaje de replegado en ausencia (barras de color negro) y en presencia (barras rojas) de una chaperona molecular en diferentes puntos de tiempo de recuperación. B. La correlación entre el tiempo y replegado en ausencia (línea en negro) y en presencia (línea roja) de acompañante. Los valores de r cuadrado indican una buena correlación.
En Fig.3A se muestra un resultado representativo, donde las células se recogieron 15, 30, 45, 60 y 120 después del choque térmico en ausencia (barras de color negro) y en presencia (barras rojas) de chaperona molecular. Porcentaje de aumento de replegarse luciferasa con el tiempo de recuperación prolongado y con la transfección de la chaperona molecular. La correlación entre el repliegue y el tiempo para el control (Fig. 3B, la línea de negro) y el acompañante molecular transfectadas las células (Fig. 3B, línea roja) se muestra.
Figura 4. Representante mal resultado. Porcentaje de A. replegado mide directamente la actividad de luciferasa. Cada gráfico de barras representa el porcentaje de replegado en ausencia (barras de color negro) y en presencia (barras rojas) de una chaperona molecular en diferentes puntos de tiempo de recuperación. B. La correlación entre el tiempo y replegado en ausencia y en presencia (rojo lINE) de acompañante. Los valores de r cuadrado indican correlación mal.
Figura 4A. Muestra un resultado representativo de un experimento no se realiza correctamente. Tanto el control (barras de color negro) y el acompañante molecular transfectadas las células (barras rojas) no mostraron un aumento de la proteína replegado con el tiempo. Además, la transfección de la chaperona molecular no se tradujo en un aumento de replegamiento. Esta mala correlación se confirma en la figura. 4B muestra un valor de R cuadrado de 0,6619 y 0,1882, respectivamente, para el control (línea en negro) y el acompañante molecular transfectadas las células (línea roja).
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Discussion
En este trabajo un protocolo para medir la actividad intracelular de replegado de las chaperonas moleculares se presenta. Todo el ensayo se puede realizar en 3 ó 4 días como lo demuestra la visión de la figura. 1.
La robustez y la linealidad de la señal de luz producida por la luciérnaga y la luciferasa Renilla representan una base sólida para la reproducibilidad del protocolo.
El paso crítico de la prueba es la elección de un reactivo de transfección eficientes para asegurar la sobre-expresión de la chaperona molecular y la luciferasa de luciérnaga. Genes reporteros se pudo entregar también con otros métodos como la infección viral o 12 electroporación. Otra posibilidad es el uso de una línea de células transgénicas, donde la expresión de la chaperona es químicamente inducida (por ejemplo, un promotor de tetraciclina sensible) 13, mientras que el gen de la luciferasa de luciérnaga se transfectadas de forma estable. Esta amplia gama de optimismoFirefox hace lo que sea posible la aplicación de la prueba a varias líneas celulares, incluyendo células primarias.
Por otra parte, si una línea de células es particularmente sensible al tratamiento con cicloheximida, la traducción de proteínas luciferasa de luciérnaga podría ser arrestado por el uso de un reprimible / sistema inducible.
Dado que la actividad replegado puede variar entre los chaperones moleculares, una valoración de la cantidad de acompañantes que se transfectadas debe ser hecho siempre. Una vez establecidos en una línea celular particular, la técnica se puede utilizar para investigar cómo las moléculas pequeñas y / o manipulaciones gentic pueden afectar la actividad chaperona. El ensayo se puede realizar también en un formato más pequeño, al igual que un niño de 6 - o incluso una placa de 12 pocillos.
Una de las aplicaciones más atractivas es la posibilidad de probar bibliotecas enteras de compuestos que pueden influir en la actividad chaperona. En este caso particular, las líneas celulares transfectadas establemente con el gen reportero, así como la chaperone se utiliza preferentemente, con el fin de minimizar las variaciones debidas a la eficacia de transfección.
Este ensayo también se puede utilizar para investigar el papel de co-activadores o co-represor de las chaperonas moleculares en el plegamiento de proteínas o cómo influyen replegado a diferentes estímulos de estrés (calor, el estrés oxidativo, desplegado respuesta de la proteína).
Incluso si de un experimento basada en células es posible tener una lectura más fisiológica de los efectos de los compuestos y / o proteínas en la actividad de un acompañante especial, no es posible cuantificar la actividad de acompañante con el ensayo que aquí se presentan. En este caso sería más adecuado un ensayo libre de células como en el ensayo in vitro refolding de luciferasa de luciérnaga o β-galactosidasa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Danilo Maddalo es un beneficiario de una beca de investigación como el Grupo de Jóvenes Investigadores (YIG) del Instituto de Tecnología de Karlsruhe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
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Programs for the Luminometer: |
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Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
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Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
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Luciferin: Pump2, 30μl injection |
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For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
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GLY-GLY-buffer: |
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For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
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Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
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For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
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| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
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