Summary
I denne protokollen en metode for å måle intracellulært protein refolding etter varmesjokkproteiner er beskrevet. Denne metoden kan brukes til å studere foldases som molekylær anstand og deres co-faktorer eller forbindelser i stand til å påvirke deres aktivitet. Firefly luciferase aktivitet brukes som reporter for å måle anstand refolding aktivitet.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode for å måle enzymatisk aktivitet av molekylære anstand i en celle-basert system, og mulige effekter av forbindelser med hemmende / stimulerende aktivitet. Molecular anstand er proteiner involvert i regulering av protein folding 1 og har en avgjørende rolle i å fremme celle overlevelse ved stresset fornærmelser som heat shock 2, nærings sult og eksponering for kjemikalier / giftstoffer 3. Av denne grunn anstand er funnet å være involvert i hendelser som tumor utvikling, chemioresistance av kreft celler 4 samt neurodegeneration 5. Design av små molekyler i stand til å hemme eller stimulere aktiviteten av disse enzymene er derfor en av de mest studerte strategier for kreftbehandling 7 og nevrodegenerative lidelser 9. Analysen her er beskrevet gir muligheten til å måle refolding aktiviteten til et bestemt molekylær anstand og å studere effekten av compounds på sin virksomhet. I denne metoden genet av molekylære anstand undersøkt er transfektert sammen med et uttrykk vektor koding for ildfluen luciferase genet. Det er allerede beskrevet som denaturated ildflue luciferase kan refolded av molekylær anstand 10,11. Som normalisering transfeksjon kontroll, er en vektor koding for renilla luciferase genet transfektert. Alle transfections beskrevet i denne protokollen er utført med X-treme Gene 11 (Roche) i HEK-293 celler. I det første trinnet, er proteinsyntesen hemmes ved å behandle cellene med cycloheximide. Deretter protein unfolding er indusert av varme sjokk ved 45 ° C i 30 minutter. Ved utvinning ved 37 ° C, er proteiner re-brettet i sine aktive konformasjon og aktiviteten av ildfluen luciferase brukes som read-out: jo mer lys vil bli produsert, jo mer protein vil ha re-fått den opprinnelige eksteriør. Non-varme sjokkert celler er satt som referanse (100% av refoldedluciferase).
Protocol
1. Seeding cellene
- Før du begynner, varm opp kulturen medium, PBS 1X og trypsin i et vannbad ved 37 ˚ C
- Ta cellene ut av inkubatoren og aspirer mediet.
- Forsiktig gjelder 5 ml PBS 1X på cellene for å vaske dem.
- Aspirer PBS 1X og gjelder 1 mL trypsin inneholder 0025% EDTA.
- Forsiktig rotere plate til å ha en jevn fordeling av trypsin.
- Plasser cellene i inkubator ved 37 ˚ C i 5-10 minutter (avhengig av celletype). Fra tid til annen se om cellene er frittliggende ved å riste på plate.
- Suspender cellene i 10-20 mL medium og samle dem i en 50 mL falk tube.
- Telle cellene ved hjelp av en Beckman teller. Antall celler bør være nok til å sikre en sammenfletting av ca 60-70%.
- Plate cellene og tillate dem å frø i 6-8 timer.
2. Transsjon
- Før transfeksjon, varm opp en delmengde av serum-free medium i et vannbad ved 37 ˚ C.
- Ta med X-treme Gene 9 til romtemperatur.
- Pipet serum fritt medium i 2 Eppendorf rør (1 tube = 1 transfeksjon).
- Pipet X-treme Gene 9 i serum fritt medium betaler oppmerksomhet at spissen ikke berører plast veggen av Eppendorf og inkuberes i 5 minutter. I mellomtiden forbereder to DNA mikser: i ett rør bland sammen plasmider for renilla, ildflue og en tom vektor kontroll, i en annen tube renilla, ildflue og molekylære anstand.
- Tilsett DNA blandingen til hver Eppendorf inneholder serum fritt medium + X-treme 9 Gene, vortex og inkuber ved romtemperatur i 20 minutter.
- Legg dropwise hver blanding på hver tallerken og inkuber i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2
3. Splitting cellene
- 24 timer etter transfeksjon, trypsinize cellene som beskrevet i 1.4 til 1.6 og fortynn dem til en endelig confluency på 60-70% i en 6-brønns plate.
- Forbered en plate for de ikke-sjokkert kontroll og så mange plater som restitusjonstid punkter som må analyseres, som viste i fig. 2.
Fire. Heat sjokk
- For varme sjokk, pre-varm serum som inneholder medium i et vannbad ved 37 ˚ C.
- Forbered 'heat shock buffer "ved å fortynne i serum som inneholder medium cycloheximide til en endelig konsentrasjon på 20 mg / ml og mopper til 20 mm.
- Nå tar ut platene fra inkubator og aspirer mediet.
- Legg til i hver brønn 1 mL "Heat sjokk buffer", og inkuberes i 30 minutter ved 37 ˚ C og 5% av CO 2 (inkluderer også henvisningen plate i denne behandlingen). Dette vil stoppe de novo proteinsyntesen.
- I mellomtiden bryteren på et vannbad og sett temperature på 45 ˚ C.
- Etter inkubasjon forsegle lokket av platene med Parafilm tidligere kuttet i striper. Henvisningen plate (100% av refolfed Firefly) er igjen i inkubatoren.
- Inkuber skålene ved 45 ˚ C i 30 minutter.
- Ta platene fra vannbad, fjern Parafilm og legg platene tilbake til inkubatoren å tillate utvinning.
- På hvert tidspunkt høste cellene og vask dem i PBS 1X ved sentrifugering ved 2000Xg i 1 minutt ved 4 ˚ C.
5. Cellelyse og luciferase assay
- For en effektiv cellelyse, snap fryse cellepelleten i flytende nitrogen.
- Tilsett 200 mL av passiv lysis buffer fortynnet i forholdet 1:5 i dobbelt destillert vann i et glassrør.
- Tilsett 30 mL av cellen lysate i en 96 godt plate. Hver prøve er pipetteres i tre eksemplarer.
- Bare 'ikke sjokkert' referanseprøver skal brukes tilles renilla luciferase aktivitet, siden dette trinnet brukes til å sjekke lik transfeksjon effektivitet.
- Forbered løsninger for analysen. For luciferin løsningen fortynnes luciferin til en endelig konsentrasjon på 0,2 mm i Gly-Gly buffer. For reaksjonen buffer tynn DTT og ATP til 1mm endelig konsentrasjon i Gly-Gly buffer. For coelenterazine reaksjon buffer, tynnes coelenterazine til en endelig konsentrasjon på 0,2 mikrometer i coelenterazine buffer. Hold luciferin løsning og coelenterazine reaksjon buffer lys beskyttet.
- Nå plasserer 96-godt plate i luminometer og start programmet "Wallac 1420 Workstation '.
- Introduser Pump1 inn falken tube inneholder coelenterazine løsningen. Lukk lokket slik at ingen lys kan komme i kontakt med røret.
- Velg fra menyen alternativet "Dispenser vedlikehold 'og kryss Pump1.
- Velg alternativet "Fill '.
- Hvis du vil redigere Plateoppsettet velge alternativet "Explore protokoll og resultater" på menyen. Velg protokollen og dobbeltklikk på den. Velg nå brønnene som skal leses.
- Gå tilbake til 'Wallac Manager' og klikk 'Start'. Reaksjonen mellom renilla luciferase og underlaget coelenterazine avgir lys med en topp bølgelengde på 482 nm.
- Etter lesing, gå på "Dispenser vedlikehold 'og velg' Empty" og Pump1 å løslate alle gjenværende løsningen tilbake til røret.
- Nå flytte røret til en falk rør som inneholder vann og trykk deretter på 'Flush ".
- Etter skylling skritt, tomme røret ved å velge "Tøm".
- Plasser røret fra Pump1 i Reaction buffer falk tube og en fra Pump2 i luciferin falk tube.
- Endre plate layout.
- Velg "Fyll" for Pump1 og Pump2 fra "DiSpenser Vedlikehold "-menyen.
- Velg protokollen og begynne lesingen. Reaksjonen mellom Firefly luciferase og underlaget luciferin avgir lys med en topp bølgelengde på 560 nm.
- På slutten av lesing gjenta prosedyren Tom-flush-Tomme for Pump1 og Pump2.
- Resultatene er nå tilgjengelig i 'Wallac 1420 Explorer'.
- Hver eksperimentet er knyttet til en analyse nummer, brukernavn, begynner og sluttdato.
- Resultatene kan nå eksporteres som en Excel-fil.
- For beregningene, er celler delt inn i tre grupper: 1. ikke sjokkert referanseprøver (angitt som 100% av refolded Firefly luciferase), 2. celler uten molekylære anstand og varme sjokkert; 3. celler med molekylære anstand og varme sjokkert.
Seks. Representant Resultater
Protein refolding er direkte knyttet til tidspunktet for utvinning derfor å teste om systemet fungerer pro perly har en analyse som skal utføres samle cellene ved ulike tidspunkt. En direkte sammenheng tid / andel av refolding indikerer at forsøket har vært riktig utført og representerer derfor en begrensende faktor. Men det skal alltid anses som refolding etter varme sjokk er en saturating arrangement og derfor et riktig tidspunkt selvsagt analyse bør utføres før du starter noe eksperiment.
Figur 1. Oversikt over eksperimentet. In vivo refolding analysen krever 3 til 4 dager å bli ferdig. På dag 1 celler er seeded og transfektert. Dagen etter cellene er delt inn i et mindre format og på dag 3 er de varme sjokkert. På dette punktet er mulig å utføre luciferase assay rett etter høsting cellene eller lagre cellepelleten ved -80 ° C og utføre analysen i et annet øyeblikk
Figur 2. Cell splitting. På dag 2 celler er delt inn i en 6-brønns plate. Hver transfeksjon vil bli utvannet i en brønn for å ha alle transfeksjon på samme plate. Hver plate vil tilsvare en bestemt utvinning tid pluss en ikke-sjokkert referanse plate.
Figur 3. Representative godt resultat. A. Prosentandel av refolding direkte målt ved Firefly luciferase aktivitet. Hver stolpediagram representerer prosentandelen av refolding i fravær (svarte striper) og i nærvær (røde streker) av en molekylær anstand på ulike restitusjonstid poeng. B. Sammenheng mellom tid og refolding i fravær (sort linje) og i nærvær (rød linje) av anstand. R squared verdier indikerer god korrelasjon.
I Fig.3A vises et representativt resultater der cellene ble samlet inn 15, 30, 45, 60 og 120 minutter etter varme sjokk i fravær (svarte striper) og i nærvær (røde søyler) av molekylære anstand. Prosentandel av refolded luciferase øker med forlenget utvinning tid og med transfeksjon av molekylære anstand. Korrelasjonen mellom refolding og tid for kontroll (Fig. 3B, sort linje) og molekylære anstand-transfektert celler (Fig. 3B, rød linje) vises.
Figur 4. Representative dårlig resultat. A. Prosentandel av refolding direkte målt ved luciferase aktivitet. Hver stolpediagram representerer prosentandelen av refolding i fravær (svarte striper) og i nærvær (røde streker) av en molekylær anstand på ulike restitusjonstid poeng. B. Sammenheng mellom tid og refolding i fravær og nærvær (rød lIne) av anstand. R squared verdier indikerer dårlig korrelasjon.
Figur 4A. Viser et representativt resultat av et eksperiment ikke riktig utført. Både kontroll (svarte striper) og molekylære anstand-transfektert celler (røde streker) ikke viser en økning i protein refolding med tiden. I tillegg gjorde transfeksjon av molekylære anstand ikke resultere i en økning av refolding. Denne dårlig korrelasjon er bekreftet i fig. 4B viser en r kvadrert verdi på 0,6619 og 0,1882 henholdsvis for kontroll (svart linje) og molekylære anstand-transfektert celler (rød linje).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet en protokoll for å måle intracellulære refolding aktivitet av molekylære anstand presenteres. Hele analysen kan utføres i 3 til 4 dager slik det fremkommer av oversikten i fig. 1.
Robusthet og linearitet av lyset signal produsert av ildflue og renilla luciferase representerer en solid base for reproduserbarheten av protokollen.
Den kritiske trinn i analysen er valget av en effektiv transfeksjon reagens å sikre overekspresjon av molekylære anstand og ildfluen luciferase. Reporter gener kunne leveres også med andre metoder som adenoviral infeksjon 12 eller electroporation. En annen mulighet er bruk av en transgen cellelinje der uttrykket av anstand er kjemisk induserbar (f.eks en tetracyklin-responsiv promoter) 13, mens de gen av ildfluen luciferase er stabilt transfektert. Denne bredt spekter av options gjør det dermed mulig anvendelse av analysen til flere cellelinjer, inkludert primære celler.
Dessuten, hvis en cellelinje er spesielt følsomme for cycloheximide behandling, kunne ildflue luciferase protein oversettelse bli arrestert ved å bruke en repressible / induserbar system.
Siden refolding aktivitet kan variere blant de molekylære anstand, bør en titrering av mengden av anstand å være transfektert alltid gjort. Gang etablert i en bestemt cellelinje, kan teknikken brukes til å undersøke hvor små molekyler og / eller gentic manipulasjoner kan påvirke anstand aktivitet. Analysen kan utføres også i et mindre format, som en 6 - eller til og med en 12-brønns plate.
En av de mest attraktive programmene er muligheten til å teste hele biblioteker av forbindelser som kan påvirke anstand aktivitet. I dette spesielle tilfellet, cellelinjer stabilt transfektert med reporteren genet samt lmaperone blir fortrinnsvis brukt, for å minimere variasjoner på grunn av transfeksjon effektivitet.
Denne analysen kan også brukes til å undersøke rollen som co-aktivatorer eller co-repressor av molekylære anstand i protein refolding eller hvordan de påvirker refolding på ulike stresset stimuli (varme, oksidativt stress, utfoldet protein respons).
Selv om det fra en celle-basert eksperimentet er mulig å ha en mer fysiologisk avlesning av effekten av forbindelser og / eller proteiner på aktiviteten av en bestemt anstand, er det ikke mulig å kvantifisere anstand aktivitet med analysen her presentert. I dette tilfellet ville være mer passende en celle-free assay som in vitro refolding analysen av Firefly luciferase eller β-galaktosidase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Danilo Maddalo er en mottaker av en stipendiatstilling som Young Investigator Group (YIG) fra Karlsruhe Institute of Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
