Coleta e medição de mediadores bioquímicos feridas exsudato em feridas cirúrgicas

Summary

Este artigo fornece uma descrição detalhada e visual de uma metodologia de coleta e medição bioquímicos mediadores inflamatórios e nociceptivos no local da ferida cirúrgica após cesariana. Este bioensaio humano tem sido usado para determinar a correlação entre a ferida e concentrações de citocinas no soro e de drogas mediadas mudanças na ferida citocinas, quimiocinas e neuropetides.

Abstract

Nós descrevemos uma metodologia pela qual somos capazes de recolher e medir bioquímicos mediadores inflamatórios e nociceptivos no local da ferida cirúrgica. Coleta de site-specific marcadores bioquímicos é importante para entender a relação entre os níveis de soro e ferida cirúrgica, determinar quaisquer associações entre a liberação do mediador, dor, uso de analgésicos e outros resultados de interesse, e avaliar o efeito da administração da droga sistêmica e periférica da ferida operatória bioquímica. Esta metodologia foi aplicada a mulheres saudáveis ​​submetidos a cesariana eletiva com raquianestesia. Nós medimos exsudato da ferida e mediadores séricos em intervalos de tempo iguais pontuações paciente da dor e consumo de analgésicos por até 48 horas pós-parto cesariana. Utilizando esta metodologia, foram capazes de detectar vários mediadores bioquímicos, incluindo factor de crescimento do nervo (NGF), a prostaglandina E2 (PG-E2) substância P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 e MIP-1β. Estudos que aplicam este bioensaio ferida cirúrgica humano foi encontrado nenhum correlações entre ferida e concentrações séricas de citocinas ou seu perfil de liberação de tempo (J Dor 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ Nós também documentou a utilidade da técnica para identificar. drogas mediadas por alterações no conteúdo de citocinas ferida (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). ²

Introduction

Depois de uma incisão cirúrgica, residente e migração de células inflamatórias liberam citocinas pró-e anti-inflamatórias, prostanóides, neuropéptidos e quimiocinas, que são importantes para a iniciação e manutenção da dor. ^3,4 A capacidade de recolher-site marcadores bioquímicos específicos é essencial para determinar o relação entre os níveis no soro e da ferida cirúrgica, compreender a complexa relação entre a libertação de mediadores e dor cirúrgica, e para ser capaz de avaliar o efeito de ambos sistémica e administração da droga periférica sobre a bioquímica da ferida cirúrgica. Estudos têm-se centrado em medidas sistêmicas de mediadores bioquímicos e não considerou site-specific lançamento. ^5,6 medições séricos de citocinas e quimiocinas podem não ser reflexo de eventos locais de feridas cirúrgicas bioquímicos e apenas indicam uma resposta sistémica global a lesão cirúrgica. Este artigo fornece uma descrição detalhada e visual único da metodologia que foi abetoSão referenciados em 2008 no Journal of Pain. ¹ O objetivo deste artigo JoVE é fornecer uma descrição única e visualmente melhor dos métodos.

Protocol

1. Protocolo de estudo

• Obter a aprovação do Conselho de Revisão Institucional e consentimento informado por escrito.
• Selecione uma população adequada cirúrgico para condução do estudo. Esta metodologia tem sido somente aplicado em feridas cesarianas mas as feridas cirúrgicas seria mais apropriada.
• Considerar os critérios de inclusão e exclusão de sua participação no estudo. Pacientes e procedimentos com altas taxas de infecção da ferida cirúrgica não pode ser apropriado.
• Padronizar anestesia e pós-operatório para todos os pacientes, para evitar potenciais fatores de confusão.

2. Colecção Mediador nociceptiva e inflamatória Bioquímica

• Inserir o PainBuster ON-Q com ON-Q SilverSoaker (I-Flow, de Lake Forest, CA) para dentro da camada subcutânea imediatamente antes de fecho de feridas (camadas de tecido podem ser consideradas outras). O ON-Q PainBuster sistema proporciona o alívio da dor continuamente solução salina normal a uma taxa de 2 ml / h. O transportador pode ser penteINED ou comparado com medicamentos de interesse, tais como um anestésico local e não-esteróides anti-inflamatórios.
• Incorporar uma torneira de três vias padrão para este sistema para permitir a aspiração de exsudado da ferida em pontos de tempo especificados. A infusão contínua impede que o cateter de coagulação e melhora a fiabilidade do sistema para a produção de amostras de exsudato. Se a aspiração de exsudado é difícil (a cerca de 5% dos casos), considere empurrando suavemente acima da ferida, alterando a posição do sujeito (por exemplo, o paciente sentado ou deitado eles se plana), utilizando uma descarga 0,5-1 ml de solução salina normal ou a retirar o centímetros cateter 1-2.
• Em pontos de tempo especificados pelo protocolo (por exemplo, 1, 4, 6, 24, e 48 h após a cesariana), aspirar e retirar 1 ml de exsudado da ferida. Transferir o exsudado dentro de um copo de polietileno contendo 30 ul de inibidor de proteinase. Temos usado inibidor de protease completa (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) para nossos propósitos.
• Dentro de 1 hora de recolha, colocar as amostras em gelo e centrifugar a 3000 rpm durante 10 min.
• Remover sobrenadante soro e ferida e colocar num tubo de microcentrífuga de padrão e armazenar a -20 ° C.

3. Análise ensaio

• Uma vez que todo o exsudado o estudo e as amostras de soro são colhidas e armazenadas, descongelar e análise das amostras ao mesmo tempo.
• Medimos as citocinas e quimiocinas, utilizando um imunoensaio multiplex. A técnica de multiplex de imuno-ensaio permite ensaio analitos a partir de numerosas pequenas amostras (50 ul) do volume. O multiplex produzir resultados comparáveis ​​com aqueles obtidos com ELISA. Temos utilizado o sistema de 17-Plex Bio-PlexTM (BioRad, HercEGRAS, CA) para nossa análise. Este ensaio é capaz de medir o factor de necrose tumoral α (TNFa), interferon α (INFα), interleucina 1β (IL-1β), interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5 ), interleucina 6 (IL-6), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 17 (IL-17), factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF), de granulócitos-macrófagos factor estimulador de colónias (GM-CSF), proteína quimioatractiva de monócitos 1 (MCP-1) e uma proteína inflamatória de macrófagos (MIP-1β). Factor de crescimento do nervo foi medida com NGF anticorpo DY256 adicionando-o da placa de 17-plex com o kit de acoplamento de amina Bio-Plex.
• Para garantir a análise de boa qualidade, cada medição deve ser feita em duplicata. As curvas padrão para cada analito são gerados usando os analitos de referência fornecidos pelo fabricante (em concentrações de 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml, maisum padrão de zero para a solução salina normal). As curvas padrão são incluídos em cada ensaio e as concentrações de amostra são calculadas com Bio-Plex Manager.
• A substância P e de prostaglandina E2 foram medidos utilizando kits de sensibilidade altamente ELISA. Temos usado Ensaio Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) para esta análise. Realizar a análise em duplicado, de acordo com a especificação do fabricante.

Representative Results

Utilizando esta metodologia, foram capazes de detectar todos os mediadores bioquímicos descritos acima com a excepção de IL-5 no exsudado da ferida e plasma. ^1,2 Algumas citocinas adicionais não foram detectados no plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). ¹ curso O tempo de citocinas e quimiocinas, medidos em estudos relatados foram consistentes, atingindo um patamar dentro das primeiras horas que foi mantida durante o período de observação de 24 horas .. ^1,2 No entanto, NGF aumentou regularmente durante o 24 horas período de recolha, enquanto que a PGE2, ocorreram dentro de 1 hora e, em seguida, diminuiu continuamente. ¹ resultados particularmente notáveis ​​são marcadamente diminuição dos níveis de IL-10 e aumento dos níveis de substância P em feridas instilados com o anestésico local bupivacaína, compatível com um conjunto pro- efeito inflamatório do fármaco (Figura 1). ^{2 Num} outro estudo demonstrou-se que o consumo de analgésicos, depois de cesarianacirurgia livery foi negativamente correlacionado com o exsudado da ferida IL-6, IL-1 β, e concentrações de G-CSF (Figura 2) ^1.

P Figura 1. Interleucina-10 (IL-10) e da substância enrolada níveis de exsudado níveis (pg / ml), medida a 1, 3, 5, 7, e 24 horas pós-parto de cesariana. O grupo de solução salina normal é indicada em diamantes cinzentos, e o grupo da bupivacaína é mostrada com quadrados pretos. * = Significativamente diferente entre os grupos (P <0,005).

Figura 2. Correlação entre a interleucina-6 (pg / ml) e o consumo de morfina no primeiro após 24 h por cesariana.

Discussion

Esta metodologia descrita acima foi encontrado para ser suficientemente sensível para detectar bioquímicos mediadores inflamatórios e nociceptiva no exsudado da ferida. A amostragem em vários pontos de tempo também permitiu observar mudanças de tais mediadores com o tempo. ^1,2 Não temos conhecimento de qualquer ensaio outra ferida cirúrgica humana que pode série medir o perfil de liberação de mediadores inflamatórios e nociceptivos em exsudato da ferida cirúrgica. Os resultados da nossa metodologia de recolha de exsudado da ferida a partir do local da incisão cirúrgica é diferente a partir de estudos que utilizam drenos da articulação da anca, o que sugere que ^7,8 subcutânea a libertação de mediadores da ferida pode ser diferente a partir de cavidades do corpo ou outro intra-articulares de libertação mediador bioquímico. Além disso, os resultados obtidos nos drenos podem ser confundidos com a perda de sangue para dentro da ferida, e, portanto, eles podem não refletem com precisão a libertação de mediadores locais bioquímica.

A fraca correlação entreferida e os níveis séricos demonstra a importância da determinação específica do local de libertação, quando o estudo feridas cirúrgicas. Alterações locais não pode ser refletida sistemicamente devido a muitos fatores, incluindo a produção diferencial sistêmica e local, em resposta ao trauma cirúrgico e estresse. Embora tenhamos escolhido para medir uma selecção particular de citocinas pró-e anti-inflamatórias e quimiocinas, bem como o NGF, SP e PG-E2 de cesariana exsudado da ferida, ^1,2 presente metodologia pode ser aplicada a outros modelos cirúrgicos e muitos outros mediadores bioquímicos.

Ferida cirúrgica instilação de anestésico local é uma técnica vulgarmente utilizada para melhorar a dor no pós-operatório. ⁹ A aplicação da metodologia, fomos capazes de demonstrar que a instilação de anestésico local em feridas cirúrgicas afeta bioquímica da ferida. ² A diminuição da IL-10 e aumento da substância P nos exsudados da ferida com bupivacaína instilação sugere uma perturbação of modulação anti-inflamatória. Perifericamente administrados anestésicos locais podem, assim, afetar os processos inflamatórios, que podem ^10,11 parciais para condrólise anestésico induzida locais nas articulações após a cirurgia. ¹²

ON-Q PainBuster Sistema alívio da dor é um EUA Food and Drug Administration (FDA) aprovou o dispositivo, desde 1998, que é usado para a entrega de anestésicos locais no local da ferida cirúrgica para diminuir a dor após a cirurgia. Instilação ferida contínuo utilizando cateteres esta e outras não tem sido associada com a infecção da ferida aumentou. ^9,13 ON-Q PainBuster com ON-Q SilverSoaker foi concebido para infusão de drogas e não para amostrar repetidamente o exsudado da ferida. Apesar de ter tido nenhuma infecção da ferida com esta técnica, destacamos uma técnica asséptica, enquanto prova exsudado a partir deste sistema. Nosso modificação proposta para facilitar a amostragem deve ser reservado para fins de pesquisa e não para u clínico de rotinase. Recomenda-se também que a duração do cateter permanece in situ ser limitado a 48-72 horas.

Esta técnica cirúrgica bioensaio site fornece um bom modelo para entender a relação entre inflamatórios e nociceptivos mediadores bioquímicos na dor pós-operatória. Vamos utilizar a metodologia em estudos futuros para investigar os efeitos de administrados localmente não-esteróides anti-inflamatórios e analgésicos opióides. A técnica também pode prestar-se a investigações que examinam a cicatrização de feridas, infecções de feridas cirúrgicas e cicatrização excessiva.