Сбор и измерения раневого экссудата биохимических медиаторов в хирургических ран

Summary

В этой статье дается подробное и наглядное описание методологии сбора и измерения биохимических воспалительных и ноцицептивных посредников на месте операции раны после кесарева сечения. Этот человек биотестирования были использованы для определения корреляции между раной и сывороточных концентраций цитокинов и лекарственно-опосредованного изменения в ране цитокинов, хемокинов и neuropetides.

Abstract

Мы описываем методологию, которую мы можем собирать и оценивать биохимические воспалительных и ноцицептивных посредников на месте операции рану. Сбор сайт-специфические биохимические маркеры важно понять взаимосвязь между уровнем в сыворотке крови и хирургические раны, определить любую связь между медиатора, боль, анальгетиков и других решений интерес, и оценить влияние системного и периферического введения препарата на хирургические раны биохимия. Эта методика была применена для здоровых женщин перенесших плановое кесарево сечение со спинальной анестезией. Мы измерили экссудатом раны и сыворотки посредников в те же сроки, как боль пациента оценки и анальгетики потребления до 48 часов после кесарева сечения. С помощью этой методики мы смогли обнаружить различных биохимических медиаторов, включая фактор роста нервов (ФРН), простагландина Е2 (ПГ-Е2), субстанции Р, ИЛ-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,Ил-10, Ил-12, Ил-13, Ил-17, TNF, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 и MIP-1β. Исследования применения этого человека хирургических ран биотестирования не нашли корреляции между раной и сывороточных концентраций цитокинов или их временной профиль высвобождения (J Боль 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ Мы также документально полезность технику для идентификации. Препарат-опосредованных изменений в ране содержание цитокинов (Anesth Analg 2010; 111:1452-9) ^2.

Introduction

После хирургического разреза, проживающих и миграции воспалительных клеток освободить про-и противовоспалительных цитокинов, простагландинов, нейропептидов и хемокинов, которые важны для инициирования и поддержания боли. ^3,4 способность собирать сайт-специфические биохимические маркеры имеет решающее значение для определения Отношения между уровнями в сыворотке крови и хирургические раны, разобраться в сложных отношениях между релизе посредника и хирургической боли, и, чтобы иметь возможность оценить влияние как системные и периферическое введение препарата на хирургические раны биохимии. Исследования были направлены на системное определение биохимических посредников и не рассматривали сайт-специфического выпуска. ^5,6 Сыворотка измерения цитокинов и хемокинов могут не отражать местные хирургической раны биохимических событий, и только указывают на глобальный системный ответ на хирургическую травму. В этой статье дается подробное и уникальное визуальное описание этой методологии, которая была ельул ссылки в 2008 году в журнале Pain. ¹ Цель этой Юпитер статьи заключается в предоставлении уникальной и визуально расширенные описания методов.

Protocol

1. Протокол исследования

• Получить Институциональные утверждение наблюдательного совета и письменного информированного согласия.
• Выберите соответствующие хирургические населения для изучения поведения. Эта методика применялась только к ранам кесарево сечение, но большинство хирургических ран было бы уместно.
• Рассмотрим критерии включения и исключения для участия в исследовании. Пациенты и процедур с высоким уровнем хирургической раневой инфекции не может быть целесообразно.
• Стандартизация анестезии и послеоперационного ведения всех пациентов, чтобы избежать возможных вмешивающихся факторов.

2. Ноцицептивная и воспалительные Биохимические Коллекция посредник

• Вставьте ON-Q PainBuster с ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) в подкожном слое незадолго до закрытия раны (другие слои ткани можно рассматривать). ON-Q PainBuster Pain Relief система непрерывно подает физиологического раствора со скоростью 2 мл / час. Носитель может быть расческаINED с или по сравнению с препаратами интерес, такие как местный анестетик и нестероидные противовоспалительные средства.
• Включение стандартных трех-ходовой кран в эту систему, чтобы стремление раневого экссудата на указанные моменты времени. Непрерывной инфузии катетер предотвращает свертывание и повышает надежность системы для получения экссудата образцов. Если стремление экссудат трудно (около 5% случаев), рассмотрим нажатия мягко выше раны, меняя положение субъекта (например, сидя пациент или лежа их квартира), используя 0,5-1 мл физиологического раствора заподлицо или снятии Катетер 1-2 см.
• В моменты времени, указанные в протоколе (например, 1, 4, 6, 24 и 48 часов после кесарева сечения), аспирации и снять 1 мл раны экссудат. Передача экссудата в полиэтиленовую чашку, содержащую 30 мкл ингибитора протеиназ. Мы использовали Полное ингибитора протеиназ (Roche Bioscience, Пало-Альто, Калифорния) для наших целей.
• В течение 1 часа сбора, положить образцы на льду и центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин.
• Удалить сыворотке крови и ран надосадочную жидкость и поместить в стандартную трубку микроцентрифужных и хранят при температуре -20 ° C.

3. Пробирного анализа

• После того как все экссудата исследования и образцы сыворотки собираются и хранятся, разморозить и анализа проб в то же время.
• Мы измерили цитокинов и хемокинов использованием мультиплексирования иммуноанализа. Мультиплексе иммуноферментный анализ техники позволяет нам анализе многочисленных компонентов из небольшого (50 мкл) образца объема. Мультиплексе производят результаты, сопоставимые с результатами, полученными с ELISA. Мы использовали 17-сложных био-PlexTM системы (BioRad, Геркдулей, CA) для нашего анализа. Этот тест позволяет измерять фактор некроза опухоли α (ФНО), интерферон-α (INFα), интерлейкина 1β (IL-1β), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5 ), интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкина-8 (IL-8), интерлейкин (IL-10), интерлейкин-12 (IL-12), интерлейкин-13 (IL-13), интерлейкин 17 (IL-17), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитов-макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF), моноцитов хемоаттрактанта белок 1 (MCP-1) и макрофагов воспалительный белок 1 (MIP-1β). Фактор роста нервов была измерена с NGF DY256 антитела, добавив его в 17-сложная табличка с Bio-Plex комплекте связи амина.
• Для обеспечения хорошего качества анализа, каждое измерение должно быть составлен в двух экземплярах. Стандартные кривые для каждого анализируемого создаются с помощью ссылки аналитов, предоставляемая изготовителем (при концентрации 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 пг / мл плюснулевой стандарт для нормального физиологического раствора). Стандартные кривые входят в каждом опыте и образцом концентрации рассчитываются с Bio-Plex менеджер программного обеспечения.
• Вещество Р и простагландин E2 были измерены с помощью высокой чувствительности ELISA Kits. Мы использовали анализа Designs, Inc (Анн-Арбор, штат Мичиган) для этого анализа. Проведение анализа в двух экземплярах в соответствии со спецификацией производителя.

Representative Results

С помощью этой методики мы были в состоянии обнаружить все биохимические медиаторы, изложенных выше, за исключением ИЛ-5 в экссудате раны и плазмы. ^1,2 Некоторые дополнительные цитокины не были обнаружены в плазме крови (IL-4, IL-17, TNF, INFγ , GM-CSF). ¹ Время хода измеряется цитокинов и хемокинов в опубликованных исследованиях были последовательны, достигая плато в течение первых нескольких часов, сохранялась на протяжении 24-часового периода наблюдения ^1,2 .. Тем не менее, NGF постоянно увеличивался 24-часовой период сбора, в то время как PGE2 пика в течение 1 часа, а затем неуклонно снижалась. ¹ Особого внимания заслуживают результаты заметно снижение уровня IL-10 и повышение уровня субстанции Р в ранах привили с местной анестезией бупивакаином, совместимый с общей про- противовоспалительное действие препарата (рис. 1). ² В другом исследовании мы показали, что обезболивающий потребления после кесарева де-ливреях операция была отрицательно коррелирует с раневого экссудата IL-6, IL-1 β и G-CSF концентрации (рис. 2) ^1.

Рисунок 1. Интерлейкин-10 (IL-10) и вещество Р раневого экссудата уровни уровни (пг / мл) на расстоянии 1, 3, 5, 7 и 24 часов после кесарева сечения. Физиологический группы, указанные в серых бриллиантов, и группа бупивакаина отображаются с черными квадратами. * = Существенно отличаются между группами (р <0,005).

Рисунок 2. Корреляция между интерлейкина-6 (пг / мл) и потребление морфина в первые 24 ч после кесарева сечения.

Discussion

Это методологии, изложенной выше, было установлено, что достаточно чувствительны, чтобы обнаружить биохимические воспалительных и ноцицептивных медиаторов в раны экссудат. Отбор проб на различные моменты времени также позволила нам наблюдать изменения этих медиаторов с течением времени. ^1,2 Мы не знаем другого человека хирургических ран анализа, которые могут серийно измерения профиля высвобождения воспалительных и ноцицептивных медиаторов в хирургическом экссудатом раны. Результаты нашей методологии раны коллекцию экссудата из хирургического разреза сайт отличается от исследований с использованием стоков от тазобедренного сустава, ^7,8 которая предполагает, что подкожная рана медиатора может отличаться от внутрисуставных или другие полости тела биохимических выпуска посредника. Кроме того, результаты, полученные в стоки могут быть озадачены потери крови в рану, и поэтому они не могут точно отражать местные биохимические выпуска посредника.

Слабая корреляция междураны и сыворотке крови свидетельствует о важности определения конкретных участков выпуска при изучении хирургических ран. Локальные изменения могут быть не отражены системно из-за многих факторов, в том числе дифференциальной системного и местного производства в ответ на хирургическую травму и стресс. Хотя мы выбрали для оценки конкретного выбора про-и противовоспалительных цитокинов и хемокинов, а также NGF, SP и ПГ-Е2 от кесарева сечения раневого экссудата, ^1,2 эта методика может быть применена к другим хирургическим моделей и многое другое биохимических медиаторов.

Хирургические раны местным анестетиком инстилляции является широко используемым методом для улучшения послеоперационных болей. ⁹ Применение методологии, мы смогли продемонстрировать, что местный анестетик инстилляции в хирургических ран влияет на рану биохимии ^2. Снижение IL-10 и увеличение вещества P В экссудате раны бупивакаина закапывания предполагает нарушение OF противовоспалительное модуляции. Периферического введения местного анестетика может таким образом влиять на воспалительные процессы, ^10,11, который может частично объяснить местным анестетиком-индуцированной хондролиз в суставах после операции ^12.

ON-Q PainBuster Pain Relief Система продуктами и лекарствами США (FDA) утвердило устройство начиная с 1998 года, которые используются для доставки местных анестетиков в хирургическое сайта ране, чтобы уменьшить боль после операции. Непрерывная закапывания раны использования этого и других катетеров не было связано с повышенным раневой инфекции. ^9,13 ON-Q PainBuster с ON-Q SilverSoaker предназначен для инфузионного введения лекарственных средств и не раз попробовать раны экссудат. Хотя у нас не было раневой инфекции с этой техникой, мы подчеркиваем асептики, пробуя раневого экссудата из этой системы. Наши предложили модификацию для облегчения отбора проб должны быть зарезервированы для научно-исследовательских целей, а не для рутинных клинических иЮ-В. Мы также рекомендуем, чтобы продолжительность катетер остается на месте ограничивается 48-72 часов.

Этот хирургический метод биотестирования сайт представляет собой хорошую модель, чтобы понять взаимосвязь между воспалительными и ноцицептивных биохимических посредников в послеоперационной боли. Мы будем использовать методику в будущем исследования для изучения последствий локально управляемый нестероидных противовоспалительных препаратов и опиоидов. Этот метод может также поддается изучению исследования заживления раны, чрезмерная хирургических рубцов и раневой инфекции.