Indsamling og måling sårekssudat Biokemiske mæglingsmænd i kirurgiske sår

Summary

Denne artikel indeholder en detaljeret og visuel beskrivelse af en metode til indsamling og måling af biokemiske inflammatoriske og nociceptive mediatorer ved det kirurgiske sårsted efter kejsersnit. Denne humane bioassay er blevet anvendt til at bestemme korrelationer mellem såret og serum cytokinkoncentrationer og lægemiddel-medierede ændringer i sår cytokiner, chemokiner og neuropetides.

Abstract

Vi beskriver en metode, hvorved vi er i stand til at indsamle og måle biokemiske inflammatoriske og nociceptive mediatorer ved operationssåret site. Indsamling stedspecifikke biokemiske markører er vigtigt at forstå forholdet mellem niveauer i serum og kirurgiske sår, bestemme eventuelle sammenhænge mellem mediatorfrigivelse, smerte, smertestillende brug og andre resultater af interesse, og evaluere effekten af ​​systemisk og perifere lægemiddeladministrering på operationssåret biokemi. Denne metode er blevet anvendt til raske kvinder, der gennemgår elektiv kejsersnit med spinal anæstesi. Vi har målt sårekssudat og serum mediatorer ved de samme tidsintervaller som patientens smertescore og analgetika forbrug i op til 48 timer efter kejsersnit. Anvendelse af denne metode har vi været i stand til at detektere forskellige biokemiske mediatorer, herunder nervevækstfaktor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) substans P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFy, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 og MIP-1β. Undersøgelser, der anvender denne menneskelige operationssåret bioassay har fundet nogen korrelation mellem sår og serum cytokinkoncentrationer eller deres tid-release profil (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ Vi har også dokumenteret anvendeligheden af teknikken til at identificere. lægemiddel-medierede ændringer i såret cytokin indhold (Anesth Analg 2010, 111:1452-9). ²

Introduction

Efter et kirurgisk snit, frigiver bor og migrerende inflammatoriske celler pro-og anti-inflammatoriske cytokiner, prostanoider, neuropeptider og chemokiner, der er vigtige til initiering og opretholdelse af smerte. ^3,4 Evnen til at samle sitespecifikke biokemiske markører er kritisk at bestemme forholdet mellem niveauer i serum og kirurgiske sår, forstår det komplekse forhold mellem mediatorfrigivelse og kirurgisk smerte og til at kunne vurdere virkningen af ​​både systemiske og perifere lægemiddeladministrering på operationssåret biokemi. Undersøgelser har fokuseret på systemiske målinger af biokemiske mediatorer og er ikke anset stedspecifik frigivelse. ^5,6 Serum målinger af cytokiner og chemokiner er muligvis ikke afspejler lokale operationssåret biokemiske begivenheder og kun viser en samlet systemisk reaktion på kirurgisk skade. Denne artikel indeholder en detaljeret og unik visuel beskrivelse af denne metode, der var first refereres i 2008 i Journal of Pain. ¹ Formålet med denne Jové artikel er at give en unik og visuelt forbedret beskrivelse af metoderne.

Protocol

1. Undersøgelse protokol

• Opnå Institutional Review Board godkendelse og skriftligt informeret samtykke.
• Vælg et passende kirurgisk befolkning for forsøgets gennemførelse. Denne metode er kun blevet anvendt på kejsersnit sår men de fleste kirurgiske sår ville være passende.
• Overvej inklusions-og eksklusionskriterier for dit studie deltagelse. Patienter og procedurer med høje kirurgisk sårinfektion måske ikke relevant.
• Standardiser anæstesi og postoperativ ledelse for alle patienter at undgå potentielle confoundere.

2. Nociceptiv og inflammatorisk Biokemisk Mediator Collection

• Sæt ON-Q PainBuster med ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) i det subkutane lag lige inden sårlukning (andre vævslag kan komme i betragtning). ON-Q PainBuster Smertelindring System kontinuerligt leverer normalt saltvand med en hastighed på 2 ml / time. Bæreren kan være kamined med eller sammenlignet med lægemidler af interesse, såsom et lokalanæstetikum og ikke-steroide anti-inflammatoriske midler.
• Indarbejde en standard trevejshanen ind i dette system til at tillade aspiration af sårekssudat på specificerede tidspunkter. Den kontinuerlige infusion forhindrer kateteret i at størkne, og forbedrer pålideligheden af ​​systemet til fremstilling af exudat prøver. Hvis aspiration af ekssudat er vanskelig (ca. 5% af tilfældene), overveje at skubbe blidt over såret, ændre motivets position (f.eks, sidder patienten eller ligger dem flade), ved hjælp af en 0,5-1 ml normalt saltvand flush eller tilbagekalde kateter 1-2 cm.
• På tidspunkter angivet af protokol (f.eks, 1, 4, 6, 24 og 48 timer efter kejsersnit), aspireres og udtages 1 ml af sårekssudat. Overføre væsken til et polyethylen bæger indeholdende 30 ul proteinaseinhibitor. Vi har anvendt Complete proteinaseinhibitor (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) til vores formål.
• Løbet af 1 time for indsamling, sætte prøverne på is og centrifugeres ved 3000 rpm i 10 min.
• Fjerne serum og såret supernatant og placeres i et standard mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.

3. Assay Analysis

• Når alle undersøgelsens ekssudat og serumprøver indsamles og lagres, optø og analysere prøverne på samme tid.
• Vi har målt de cytokiner og chemokiner ved anvendelse af en multiplex immunoassay. Det multiplex immunoassay teknik giver os mulighed for at analysere en lang række analytter fra små (50 pl) volumina. Den multiplex giver resultater sammenlignes med dem, der opnås med ELISA. Vi har brugt den 17-plex Bio-PlexTM system (BioRad, Hercbundmoduler, CA) i vores analyse. Dette assay kan måle tumornekrosefaktor α (TNFa), interferon α (INFα), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5 ), interleukin 6 (IL-6), interleukin 7 (IL-7), interleukin 8 (IL-8), interleukin (IL-10), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 17 (IL-17), granulocytkolonistimulerende faktor (G-CSF), granulocyt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF), monocyt-kemoattraktant protein 1 (MCP-1) og makrofaginflammatorisk protein 1 (MIP-1β). Nervevækstfaktor blev målt med NGF DY256 antistof ved at tilsætte det til 17-plex plade med Bio-Plex Amine Coupling Kit'et.
• For at sikre en god kvalitet analyse, bør hver måling ske i to eksemplarer. Standardkurver for hver analyt genereres ved hjælp af reference analytter leveret af producenten (ved koncentrationer på 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml plusen nul-standard for normal saltopløsning). Standardkurver er inkluderet i hver kørsel og prøve koncentrationer beregnes med Bio-Plex Manager-softwaren.
• Substans P og prostaglandin E2 blev målt ved anvendelse af stærkt følsomhed ELISA kits. Vi har anvendt Assay Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) til denne analyse. Udføre analysen i to eksemplarer ifølge producentens specifikationer.

Representative Results

Anvendelse af denne metode har vi været i stand til at detektere alle biokemiske mediatorer skitseret ovenfor med undtagelse af IL-5 i sårekssudat og plasma. ^1,2 Nogle yderligere cytokiner blev ikke påvist i plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFy , GM-CSF). ¹ Tidsforløbet af målte cytokiner og chemokiner i rapporterede studier var konsistente og nåede et plateau inden for de første par timer, blev opretholdt i 24 timers observationsperiode .. ^1,2 Dog NGF steg støt i den 24-timers indsamling periode, mens PGE2 toppede inden for 1 time og derefter faldt støt. ¹ Særligt bemærkelsesværdige resultater er markant nedsat niveauer af IL-10 og forhøjet indhold af substans P i sår indpodet med den lokalbedøvelse bupivacain, kompatibel med en samlet pro- inflammatorisk virkning af lægemidlet (fig. 1). ² I et andet studie har vi vist, at smertestillende forbrug efter kejsersnit delivery kirurgi blev negativt korreleret med sårekssudat IL-6, IL-1 β, og G-CSF-koncentrationer (figur 2). ^en

Fig. 1. Interleukin-10 (IL-10) og substans P sårekssudat niveauer niveauer (pg / ml) målt ved 1, 3, 5, 7 og 24 timer efter kejsersnit. Den normalt saltvand gruppe er angivet i grå diamanter, og bupivacain gruppen vises med sorte firkanter. * = Signifikant forskellig mellem grupper (P <0,005).

Figur 2. Korrelation mellem interleukin-6 (pg / ml) og morfin forbrug i de første 24 timer efter kejsersnit.

Discussion

Denne metode er skitseret ovenfor har vist sig at være følsom nok til at påvise biokemiske inflammatoriske og nociceptive mediatorer i sårekssudat. Prøveudtagning på forskellige tidspunkter med har også tilladt os at observere ændringer af disse mediatorer over tid. ^1,2 Vi er ikke bekendt med nogen anden menneskelig operationssåret assay, der kan serielt måle frigivelsesprofilen af inflammatoriske og nociceptive mediatorer i kirurgisk sårekssudat. Resultater fra vores metode sårekssudat kollektion fra det kirurgiske incisionssted er forskellig fra forsøg, hvori afløb fra hofteleddet, ^7,8 hvilket antyder, at subkutan sår mediatorfrigivelse kan være forskellig fra intraartikulære eller anden legemskaviteter biokemisk mediatorfrigivelse. Derudover kan resultaterne i afløb blive beskæmmet af blodtab i såret, og de kan derfor ikke nøjagtigt afspejler den lokale biokemisk mediatorfrigivelse.

Den ringe korrelation mellemsår og serumniveauer viser betydningen af ​​bestemmelse af sted-specifik frigivelse, når man studerer kirurgiske sår. Lokale ændringer kan ikke blive afspejlet systemisk på grund af mange faktorer, herunder forskellen systemisk og lokal produktion som reaktion på kirurgisk traume og stress. Selv om vi har valgt at måle et bestemt udvalg af pro-og anti-inflammatoriske cytokiner og chemokiner og NGF, SP og PG-E2 fra kejsersnit sårekssudat, ^1,2 denne metode kan anvendes på andre kirurgiske modeller og mange andre biokemiske mediatorer.

Kirurgisk sår lokalbedøvende instillation er en almindeligt anvendt teknik til forbedring postoperative smerter. ⁹ anvendelsen af metoden, har vi været i stand til at påvise, at lokalbedøvende instillation i kirurgiske sår påvirker sår biokemi. ² Et fald i IL-10 og stigning i substans P i viklede udsondringer med bupivacain drypning foreslår en afbrydelse of antiinflammatorisk modulation. Perifert administreret lokalanæstetika kan derved påvirke de inflammatoriske processer, ^10,11, som kan delvis tegner sig for lokalbedøvelse-induceret chondrolysis i leddene efter operationen. ¹²

ON-Q PainBuster Smertelindring System er en US Food and Drug Administration (FDA) godkendt enhed siden 1998, der bruges til levering af lokalanæstetika til det kirurgiske sårsted at mindske smerter efter operationen. Kontinuerlig sår instillation anvendelse af denne og andre katetre er ikke blevet forbundet med øget sårinfektion. ^9,13 ON-Q PainBuster med ON-Q SilverSoaker er designet til at tilføre lægemidler og ikke gentagne gange prøve sårekssudat. Selv om vi har haft nogen sårinfektioner med denne teknik, vi understrege en aseptisk teknik, mens du smager sårekssudat fra dette system. Vores foreslåede ændringer for at lette prøvetagning bør reserveres til forskningsformål og ikke til rutinemæssig klinisk use. Vi anbefaler også, at varigheden kateteret forbliver in situ være begrænset til 48-72 timer.

Denne operationsstedet bioassay teknik giver en god model til at forstå sammenhængen mellem inflammatoriske og nociceptive biokemiske mæglere i postoperative smerter. Vi vil bruge den metode i fremtidige studier for at undersøge virkningen af ​​lokalt administrerede non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler og opioider. Teknikken kan også egner sig til undersøgelser undersøger sårheling, overdreven kirurgiske ardannelse og sårinfektion.