Uppsamling och mätning sårvätska Biokemiska medlare i kirurgiska sår

Summary

Den här artikeln innehåller en detaljerad och visuell beskrivning av en metod för att samla in och mäta biokemiska inflammatoriska och nociceptiv mediatorer vid operationssåret webbplatsen efter kejsarsnitt. Denna mänskliga bioanalys har använts för att bestämma sambanden mellan sår och serum cytokin och narkotika-medierade förändringar i sår cytokiner, kemokiner och neuropetides.

Abstract

Vi beskriver en metod med vilken vi kan samla in och mäta biokemiska inflammatoriska och nociceptiv mediatorer vid operationssåret webbplatsen. Samla platsspecifika biokemiska markörer är viktigt att förstå sambandet mellan nivåer i serum och operationssåret, fastställa de samband mellan mediatorfrigöring, smärta, smärtstillande användning och andra resultat av intresse, och utvärdera effekten av systemisk och perifera läkemedelsadministrering på operationssåret biokemi. Denna metod har tillämpats på friska kvinnor som genomgår elektiv kejsarsnitt med spinal anestesi. Vi har mätt sårexsudat och serum medlare vid samma tidsintervall som patientens smärtupplevelse och analgetika konsumtion för upp till 48 timmar efter kejsarsnitt. Med användning av denna metodik har vi kunnat detektera olika biokemiska mediatorer, inklusive nervtillväxtfaktor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) substans P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFy, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 och MlP-1β. Studier som tillämpar denna mänskliga operationssåret bioanalys har inte funnit några samband mellan sår och serumkoncentrationer cytokin eller deras tid frisättningsprofil (J Pain 2008,. 9 (7) :650-7) ¹ Vi har även dokumenterat nyttan av tekniken att identifiera. läkemedel-förmedlade förändringarna i sår cytokin innehåll (Anesth Analg 2010, 111:1452-9). ²

Introduction

Efter ett kirurgiskt snitt, bosatt och migrerande inflammatoriska celler släpper pro-och anti-inflammatoriska cytokiner, prostanoider, neuropeptider och kemokiner som är viktiga för att initiera och upprätthålla smärta. ^3,4 Förmågan att samla platsspecifika biokemiska markörer är avgörande för att bestämma Förhållandet mellan nivåer i serum och operationssåret, förstå det komplicerade förhållandet mellan mediatorfrigöring och kirurgisk smärta och kunna utvärdera effekten av både systemisk och perifer läkemedelsadministrering på operationssåret biokemi. Studier har fokuserat på systemiska mätningar av biokemiska mediatorer och har inte vara platsspecifika frisättning. ^5,6 Serum mätningar av cytokiner och kemokiner kan vara reflekterande av lokala kirurgiska sår biokemiska händelser och endast indikerar en global systemiskt svar på kirurgisk skada. Den här artikeln innehåller en detaljerad och unik visuell beskrivning av denna metod som var granst refereras i 2008 i Journal of Pain. ¹ Syftet med denna JUPITER artikel är att ge en unik och visuellt bättre beskrivning av metoderna.

Protocol

1. Studie protokollet

• Skaffa Institutional godkännande Review Board och skriftligt informerat samtycke.
• Välj en lämplig kirurgisk befolkningen för försökets genomförande. Denna metod har endast använts för sår kejsarsnitt men mest kirurgiska sår skulle vara lämpligt.
• Tänk inkludering och exkludering kriterier för dina studier deltagande. Patienter och förfaranden höga kirurgiska sårinfektion kanske inte är lämpligt.
• Standardisera anestesi och postoperativ förvaltning för alla patienter att undvika potentiella confounders.

2. Nociceptiv och inflammatoriska Biokemisk medlare Insamling

• Sätt in ON-Q PainBuster med ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) i den subkutana vävnaden strax före tillslutning av sår (andra vävnadsskikt kan anses). ON-Q PainBuster smärtlindring System levererar kontinuerligt normal saltlösning med en hastighet av 2 ml / tim. Bäraren kan vara kamINED med eller jämföras med droger av intresse, såsom lokalbedövning och icke-steroida antiinflammatoriska medel.
• Införliva en vanlig trevägskran i detta system för att möjliggöra aspiration av sårvätska vid angivna tidpunkter. Den kontinuerliga infusionen hindrar katetern från koagulering och förbättrar tillförlitligheten hos systemet att producera exsudat prover. Om aspiration av exsudat är svårt (ca 5% av fallen), överväga att pressa försiktigt över såret, ändra motivets position (t.ex., sitter patienten upp eller ligger dem platt), med hjälp av en 0,5-1 ml fysiologisk koksaltlösning spolning eller återkalla kateter 1-2 cm.
• Vid tidpunkter som anges av protokollet (t.ex. 1, 4, 6, 24, och 48 timmar efter kejsarsnitt), aspirera och dra 1 ml sårexsudat. Överför sårsekret till en polyeten kopp innehållande 30 pl av proteinas-inhibitor. Vi har använt Complete proteinasinhibitor (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) för våra ändamål.
• Inom 1 timme av insamling, sätta prover på is och centrifugera vid 3.000 rpm under 10 minuter.
• Ta serum och sår supernatanten och placera det i en vanlig mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.

3. Analys Analys

• När alla studien exsudatet och serumprover samlas in och lagras, tina och analysera proverna samtidigt.
• Vi har mätt cytokiner och kemokiner med en multiplex immunanalys. Multiplex immuno-assay teknik tillåter oss att analysera flera analyter från små (50 pl) volymer prover. Multiplex ger resultat som är jämförbara med de som erhölls med ELISA. Vi har använt 17-plex Bio-PlexTM systemet (BioRad, Hercmoduler, CA) för vår analys. Denna analys kan mäta tumör α nekros faktor (TNFa), interferon α (INFα), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5 ), interleukin 6 (IL-6), interleukin 7 (IL-7), interleukin 8 (IL-8), interleukin (IL-10), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 17 (IL-17), granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), monocytkemoattraherande protein 1 (MCP-1) och makrofag inflammatoriskt protein 1 (MIP-1β). Nervtillväxtfaktor mättes med NGF DY256 antikropp genom att lägga till den 17-plex plattan med Bio-Plex amin koppling kit.
• För att säkerställa god kvalitet analysen bör varje mätning göras i två exemplar. Standardkurvor för varje analyt som alstras genom användning hänvisningsbeteckningar analyter från tillverkaren (vid koncentrationer av 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3.200 pg / ml plusen noll standard för normal saltlösning). Standardkurvor ingår i varje körning och prov koncentrationer beräknas med Bio-Plex Manager.
• Substans P och prostaglandin E2 mättes med hjälp av mycket känsliga ELISA Kit. Vi har använt Analys Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) för denna analys. Utför analysen i två exemplar i enlighet med tillverkarens specifikation.

Representative Results

Med användning av denna metodik har vi kunnat upptäcka alla biokemiska mediatorer anges ovan med undantag av IL-5 i sårexsudat och plasma. ^1,2 Några ytterligare cytokiner inte detekterades i plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFy , GM-CSF). ¹ Tidsförloppet för uppmätta cytokiner och kemokiner i redovisade studier var konsekvent, når en platå inom de första timmarna som upptas under 24 timmar observationsperioden .. ^1,2 ökade dock NGF stadigt under 24-timmars period för insamling, medan PGE2 topp inom 1 timme och därefter stadigt minskat. ¹ Särskilt anmärkningsvärda resultat markant minskade nivåer av IL-10 och ökade nivåer av substans P i sår ingjutit med lokalbedövningsmedlet bupivakain, kompatibel med en total pro- inflammatorisk effekt av läkemedlet (figur 1). ² I en annan studie har vi visat att analgetiska konsumtion efter kejsarsnitt delivery kirurgi var negativt korrelerad med sårvätska IL-6, IL-1 β, och G-CSF koncentrationer (Figur 2). ¹

Figur 1. Interleukin-10 (IL-10) och substans P sårexsudat nivåer nivåer (pg / ml) mätt vid 1, 3, 5, 7, och 24 timmar efter kejsarsnitt. Den normala koksaltlösning gruppen anges i grå diamanter och bupivakain gruppen visas med svarta rutor. * = Signifikant skild mellan grupperna (P <0,005).

Figur 2. Korrelation mellan interleukin-6 (pg / ml) och morfin förbrukningen i den första 24 timmar efter kejsarsnitt.

Discussion

Denna metod beskrivs ovan har befunnits vara tillräckligt känsliga för att detektera biokemiska inflammatoriska och nociceptiva mediatorer i sårexsudat. Provtagning vid olika tidpunkter har också gett oss möjlighet att observera förändringar av dessa mediatorer över tiden. ^1,2 Vi är inte medvetna om någon annan människa operationssåret analys som seriellt kan mäta frisättningsprofilen av inflammatoriska och nociceptiv mediatorer i kirurgisk sårvätska. Resultat från vår metodik för sårvätska samling från kirurgiska snitt webbplatsen skiljer sig från studier som använder avlopp från höftleden, ^7,8 vilket tyder på att subkutan sår mediatorfrisättning kan skilja sig från intraartikulära eller andra kroppshåligheter biokemisk mediatorfrisättning. Dessutom kan resultaten i avloppet komma på skam genom blodförlust i såret, och därför kanske inte korrekt återspeglar lokala biokemiska mediatorfrisättning.

Den dåliga korrelationen mellansår och serum visar på vikten av att bestämma platsspecifik frisättning när man studerar kirurgiska sår. Lokala förändringar kan inte återspeglas systemiskt på grund av många faktorer, inklusive differentiell systemisk och lokal produktion som svar på kirurgiskt trauma och stress. Även om vi har valt att mäta ett särskilt val av pro-och anti-inflammatoriska cytokiner och kemokiner samt NGF, SP och PG-E2 från kejsarsnitt sårexsudat, ^1,2 denna metod kan tillämpas på andra kirurgiska modeller och många andra biokemiska mediatorer.

Operationssåret lokalbedövningsmedel instillation är en ofta använd teknik för att förbättra postoperativ smärta. ⁹ tillämpning av den metod, har vi kunnat visa att lokalbedövningsmedel instillation i kirurgiska sår påverkar sår biokemi. ² En minskning av IL-10 och ökade substans P i sårexsudat med bupivakain indrypning antyder en störning of antiinflammatorisk modulering. Perifert administrerade lokalbedövningsmedel kan därmed påverka de inflammatoriska processer, ^10,11 som delvis kan stå för lokalbedövning-inducerad chondrolysis i leder efter operationen. ¹²

ON-Q PainBuster Smärta System är ett US Food and Drug Administration (FDA) godkänt enhet sedan 1998 som används för leverans av lokalanestetika till kirurgiska såret för att minska smärta efter operation. Kontinuerlig sår instillation använder denna och andra katetrar har inte förknippats med ökad sårinfektion. Syftar till att ingjuta droger och inte upprepat prov sårvätska ^9,13 ON-Q PainBuster med ON-Q SilverSoaker. Även om vi har haft några sårinfektioner med denna teknik, betonar vi aseptisk teknik medan provtagning sårvätska från detta system. Vår föreslagna ändringen att underlätta provtagningen bör reserveras för forskning och inte för rutinmässig klinisk use. Vi rekommenderar också att varaktigheten katetern kvar in situ begränsas till 48-72 timmar.

Denna operationsområdet bioassay teknik ger en bra modell för att förstå sambandet mellan inflammatoriska och nociceptiv biokemiska mediatorer i postoperativ smärta. Vi kommer att använda metoden i framtida studier för att undersöka effekter av lokalt administrerade icke-steroida anti-inflammatoriska läkemedel och opioider. Tekniken kan också lämpar sig för undersökningar undersöker sårläkning, överdriven kirurgiska ärrbildning och sårinfektion.