Summary
En este artículo se ofrece una descripción detallada y visual de una metodología para la recogida y medición de mediadores bioquímicos inflamatorios y nociceptivos en el sitio de la herida quirúrgica después de un parto por cesárea. Este bioensayo humano se ha utilizado para determinar las correlaciones entre la herida y las concentraciones séricas de citoquinas y fármaco mediada por los cambios en la herida citoquinas, quimioquinas y neuropetides.
Abstract
Se describe un método por el que somos capaces de recoger y medir bioquímicos mediadores inflamatorios y nociceptivos en el sitio de la herida quirúrgica. Recopilación de sitios específicos marcadores bioquímicos es importante entender la relación entre los niveles en suero y herida quirúrgica, determinar las posibles asociaciones entre la liberación de mediadores, dolor, uso de analgésicos y otros resultados de interés, y evaluar el efecto de la administración sistémica de fármacos y periférico en la herida quirúrgica bioquímica. Esta metodología se ha aplicado a las mujeres sanas sometidas a cesárea electiva con anestesia espinal. Hemos medido exudado de la herida y mediadores de suero en los intervalos de tiempo que las puntuaciones de dolor del paciente y el consumo de analgésicos por hasta 48 horas post-parto por cesárea. Usando esta metodología hemos sido capaces de detectar diferentes mediadores bioquímicos, incluyendo el factor de crecimiento nervioso (NGF), la prostaglandina E2 (PG-E2) sustancia P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 y MIP-1β. Los estudios que aplican este bioensayo humana herida quirúrgica no han encontrado correlaciones entre la herida y las concentraciones séricas de citoquinas o su perfil de tiempo de liberación (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) 1 También documentado la utilidad de la técnica de identificar. mediadas por la droga cambios en el contenido herida citoquinas (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). 2
Introduction
Después de una incisión quirúrgica, residente y migración de las células inflamatorias liberan citoquinas pro-y anti-inflamatoria, prostanoides, neuropéptidos y quimiocinas que son importantes para iniciar y mantener el dolor. 3,4 La posibilidad de recopilar específicas del sitio marcadores bioquímicos es crítico para determinar la relación entre los niveles en suero de la herida quirúrgica y, comprender la compleja relación entre la liberación de mediadores y dolor quirúrgico, y para ser capaz de evaluar el efecto de tanto sistémica como la administración del fármaco periférico en la bioquímica de la herida quirúrgica. Los estudios se han centrado en las mediciones sistémicos de mediadores bioquímicos y no han considerado específica del sitio de liberación. 5,6 mediciones séricos de citocinas y quimiocinas no puede ser el reflejo de los eventos locales de heridas quirúrgicas y bioquímicos sólo indican una respuesta sistémica global a la lesión quirúrgica. Este artículo proporciona una descripción visual detallada y única de esta metodología que fue first referencia en 2008 en el Journal of Pain. 1 El objetivo de este artículo JoVE es proporcionar una descripción única y mejorada visualmente de los métodos.
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Protocol
1. Protocolo de estudio
- Obtener la aprobación del Comité de Revisión Institucional y el consentimiento informado por escrito.
- Seleccione una población apropiada para la conducta quirúrgica estudio. Esta metodología sólo se ha aplicado a las heridas de parto por cesárea, pero las heridas quirúrgicas más sería apropiado.
- Considerar los criterios de inclusión y exclusión para su participación en el estudio. Los pacientes y los procedimientos con altas tasas de infección de la herida quirúrgica no puede ser apropiado.
- Estandarizar anestesia y postoperatorio de los pacientes para evitar posibles factores de confusión.
2. Colección Bioquímica mediador inflamatorio y nociceptivo
- Inserte el PainBuster ON-Q con ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) en la capa subcutánea justo antes de cierre de la herida (las otras capas de tejido puede ser considerado). El ON-Q Pain PainBuster de alivio del sistema suministra continuamente solución salina normal a una velocidad de 2 ml / h. El vehículo puede ser peineINED o con respecto a los medicamentos de interés, tales como un anestésico local y no esteroides antiinflamatorios.
- Incorporar un estándar de llave de tres vías en este sistema para permitir la aspiración de exudado de la herida en puntos de tiempo especificados. La infusión continua impide que el catéter se coagule y se mejora la fiabilidad del sistema para producir muestras de exudado. Si la aspiración de exudado es difícil (aproximadamente 5% de los casos), considere empujando suavemente encima de la herida, el cambio de la posición del sujeto (por ejemplo, el paciente sentado o acostado ellos plana), utilizando un 0.5-1 ml de solución salina al ras normal o la retirada de la catéter 1-2 cm.
- En los puntos de tiempo especificados por el protocolo (por ejemplo, 1, 4, 6, 24, y 48 horas después del parto por cesárea), aspirar y retirar 1 ml de exudado de la herida. Transferir el exudado en un vaso de polietileno que contiene 30 l de inhibidor de la proteinasa. Hemos utilizado inhibidor de proteinasa Complete (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) para nuestros propósitos.
- Dentro de 1 hora de la recogida, poner las muestras en hielo y centrifugar a 3.000 rpm durante 10 min.
- Retire el suero y sobrenadante herida y colocar en un tubo de microcentrífuga estándar y almacenar a -20 ° C.
3. Ensayo de análisis
- Una vez que todo el exudado estudio y las muestras de suero se recogen y almacenan, descongelar y analizar las muestras al mismo tiempo.
- Hemos medido las citocinas y quimiocinas usando un inmunoensayo múltiplex. El múltiplex inmunoensayo técnica nos permite ensayo de analitos numerosas pequeñas muestras de volumen (50 l). El múltiplex producir resultados comparables con los obtenidos con ELISA. Hemos utilizado el 17-plex Bio-PlexTM sistema (BioRad, Hercdulos, CA) para nuestro análisis. Este ensayo es capaz de medir el factor de necrosis tumoral α (TNF), interferón α (INFα), interleucina 1β (IL-1β), interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5 ), interleucina 6 (IL-6), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 17 (IL-17), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) y la proteína inflamatoria de macrófagos 1 (MIP-1β). Factor de crecimiento nervioso se midió con NGF DY256 anticuerpo mediante la adición a la placa de 17-plex con el kit de amina Bio-Plex acoplamiento.
- Para garantizar el análisis de buena calidad, cada medición debe hacerse por duplicado. Las curvas de calibración para cada analito se generan mediante el uso de analitos de referencia suministrados por el fabricante (en concentraciones de 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3.200 pg / ml, másun nivel cero para la solución salina normal). Las curvas de calibración se incluyen en cada ejecución y concentraciones de la muestra se calculó con el software de Administrador de Bio-Plex.
- La sustancia P y la prostaglandina E2 se midieron usando kits de ELISA altamente sensibilidad. Hemos utilizado Ensayo Designs, Inc. (Ann Arbor, Michigan) para este análisis. Realizar el análisis por duplicado de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
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Representative Results
Usando esta metodología hemos sido capaces de detectar todos los mediadores bioquímicos descritos anteriormente con la excepción de IL-5 en el exudado de la herida y plasma. 1,2 Algunos citoquinas adicionales no se detectaron en plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). 1 El curso temporal de citocinas y quimiocinas medidos en los estudios informados fueron consistente, alcanzando una meseta dentro de las primeras horas que se mantuvo durante el período de observación de 24 horas .. 1,2 Sin embargo, el NGF aumentado de forma constante durante el las 24 horas del período de recolección, mientras que PGE2 alcanzó su punto máximo en 1 hora y luego disminuyó de manera constante. 1 resultados particularmente notables son marcadamente disminuido los niveles de IL-10 y el aumento de los niveles de la sustancia P en las heridas inculcados con el anestésico local bupivacaína, compatible con un total de pro- efecto inflamatorio del fármaco (Figura 1). 2 En un estudio diferente hemos demostrado que el consumo de analgésicos después de una cesárea decirugía librea se correlacionó negativamente con el exudado de la herida IL-6, IL-1 β y G-CSF concentraciones (Figura 2). 1
P Figura 1. Interleucina-10 (IL-10) y la sustancia herida niveles de exudado niveles (pg / ml) medida a 1, 3, 5, 7, y 24 horas después de la entrega por cesárea. El grupo de solución salina normal se indica en diamantes grises, y el grupo de la bupivacaína se muestra con cuadrados negros. * = Diferencia significativa entre los grupos (P <0,005).
Figura 2. Correlación entre la interleucina-6 (pg / ml) y el consumo de morfina en la primera 24 horas después del parto por cesárea.
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Discussion
Esta metodología esbozada se ha encontrado para ser lo suficientemente sensible como para detectar bioquímicas mediadores inflamatorios y nociceptivos en el exudado de la herida. El muestreo en diferentes puntos de tiempo también nos ha permitido observar los cambios de estos mediadores en el tiempo. 1,2 No tenemos conocimiento de ningún otro ensayo humano herida quirúrgica que en serie puede medir el perfil de liberación de mediadores inflamatorios y nociceptivos en exudado de la herida quirúrgica. Los resultados de nuestra metodología de recogida de exudado de la herida desde el sitio de la incisión quirúrgica es diferente de los estudios que utilizan tuberías de desagüe de la articulación de la cadera, 7,8, lo que sugiere que la herida subcutánea liberación de mediadores pueden ser diferentes de las cavidades del cuerpo o de otro intraarticulares liberación de mediadores bioquímicos. Además, los resultados obtenidos en los drenajes pueden ser confundidos por la pérdida de sangre en la herida, y por lo tanto no pueden reflejar con precisión la liberación local mediador bioquímico.
La escasa correlación entreherida y los niveles séricos demuestra la importancia de la determinación específica de sitio de liberación cuando se estudian las heridas quirúrgicas. Los cambios locales no pueden reflejarse sistémica debido a muchos factores, incluyendo la producción diferencial sistémica y local en respuesta al trauma quirúrgico y el estrés. Aunque hemos elegido para medir una selección particular de las citoquinas pro-y anti-inflamatorias y quimiocinas, así como NGF, SP y PG-E2 de parto por cesárea exudado de la herida, 1,2 esta metodología se puede aplicar a otros modelos quirúrgicos y muchas otras mediadores bioquímicos.
Instilación herida quirúrgica anestésico local es una técnica comúnmente utilizada para mejorar el dolor postoperatorio. 9 La aplicación de la metodología, hemos sido capaces de demostrar que la instilación de anestésico local en heridas quirúrgicas afecta bioquímica herida. 2 Una disminución en la IL-10 y aumento de la sustancia P en exudados de la herida con bupivacaína instilación sugiere una interrupción of anti-inflamatoria modulación. Administrados periféricamente anestésicos locales así puede afectar a los procesos inflamatorios, 10,11 lo que en parte puede explicar anestesia local inducida condrólisis en las articulaciones después de la cirugía 12.
ON-Q Pain Relief PainBuster System es un EE.UU. Food and Drug Administration (FDA) aprobó el dispositivo desde el año 1998 que se utiliza para la administración de anestésicos locales en el sitio de la herida quirúrgica para reducir el dolor después de la cirugía. Instilación herida continuo utilizando catéteres de este y otros no ha sido asociado con infección de la herida mayor. 9,13 ON-Q PainBuster con ON-Q SilverSoaker está diseñado para infundir medicamentos y no para muestrear repetidamente exudado de la herida. A pesar de que no han tenido infecciones de la herida con esta técnica, hacemos hincapié en una técnica aséptica mientras degustan exudado de la herida de este sistema. Nuestra modificación propuesta para facilitar el muestreo se debe reservar para fines de investigación y no para u clínica habitualse. También se recomienda que la duración del catéter permanece in situ se limitará a las 48-72 horas.
Esta técnica de bioensayo sitio quirúrgico proporciona un buen modelo para entender la relación entre los mediadores bioquímicos inflamatorios y nociceptivos del dolor postoperatorio. Vamos a utilizar la metodología en futuros estudios para investigar los efectos de la administración local no esteroides anti-inflamatorios no esteroideos y opiáceos. La técnica también se puede prestar a las investigaciones que examinan la curación de heridas, infección excesiva cicatrización quirúrgica y la herida.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo del Dr. Carvalho fue apoyado por una beca de investigación de la Oficina de Investigación en Salud de la Mujer y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud (5K12 HD043452). Angst Dr recibido suministros (On-Q PainBuster Post-Op Sistema de alivio del dolor) y fondos (para los ensayos bioquímicos) de I-Flow (Lake Forest, California).
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