Summary
この記事では、帝王切開後に手術創傷部位での炎症性および生化学的な侵害受容性メディエーターを収集し、測定するための方法論の詳細と視覚的な説明を提供しています。この人間のバイオアッセイは、創傷および血清サイトカイン濃度および創傷サイトカイン、ケモカインおよび神経ペプチドにおける薬剤性の変化との相関関係を決定するために使用されています。
Abstract
我々は、我々が手術創傷部位での炎症性および生化学的な侵害受容性メディエーターを収集し、測定することができますそれによって方法論を記述する。部位特異的な生化学的マーカーを収集すると、血清中および手術創内のレベル間の関係を理解するメディエーター放出、痛み、鎮痛剤の使用および関心のある他の転帰との関連付けを決定し、手術創に全身および末梢薬物投与の効果を評価することは重要である生化学。この手法は、脊椎麻酔による選択的帝王切開分娩を受けて健康な女性に適用されています。私たちは、患者の疼痛スコアと最大48時間後に帝王切開分娩のための鎮痛剤の消費量と同じ時間間隔で創傷滲出液および血清メディエーターを測定した。この方法論を使用して我々は、神経成長因子（NGF）、プロスタグランジンE2（PG-E2）のサブスタンスPは、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7など、様々な生化学メディエーターを検出することができましたIL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、TNFα、INFγ、G-CSF、GM-CSF、MCP-1およびMIP-1β。この人間の手術創バイオアッセイを適用した研究は、創傷および血清サイトカイン濃度またはその時間の放出プロファイルの間には相関関係は認められません（J疼痛2008;。9（7）:650-7）1我々はまた、識別する手法の有用性を文書化した。薬剤媒介創傷サイトカイン量の変化（Anesth Analg 2010; 111:1452-9）。2
Introduction
外科的切開した後、常駐し、移行炎症細胞が痛みを開始および維持するために重要であるプロと抗炎症性サイトカイン、プロスタノイド、神経ペプチドとケモカインを放出する。3,4、サイト固有の生化学的マーカーを収集する能力を決定することが重要です血清および手術創内のレベル間の関係は、メディエーター放出と術後疼痛との間の複雑な関係を理解し、手術創生化学上の両方の全身および末梢薬剤投与の効果を評価できるようにする。研究は、生化学的メディエーターの全身測定に焦点を当てていると、サイト固有のリリースは考慮していません。サイトカインおよびケモカインの5,6血清測定値が局所手術創生化学的事象を反映するものとだけ外科的損傷へのグローバルな全身反応を示さないことがあります。この記事では、モミだったこの方法論の詳細とユニークな視覚的な説明を提供しています痛みのジャーナルで2008年に参照聖1は、このJoveの記事の目的は、メソッドのユニークで視覚的に強化された説明を提供することです。
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Protocol
1。研究プロトコル
- 治験審査委員会の承認と書面によるインフォームドコンセントを取得します。
- 研究実施のための適切な外科的集団を選択します。この方法論は、帝王切開の傷に適用されているが、ほとんどの手術の傷は適切でしょう。
- あなたの研究参加のための包含と除外の基準を考慮してください。手術創感染率の高い患者と手順は適切でないかもしれません。
- 潜在的な交絡因子を避けるために、すべての患者のための麻酔および術後管理を標準化します。
2。侵害受容性および炎症性メディエータ生化学コレクション
- 閉鎖（他の組織層が考えられる）を巻か直前に皮下層に、ON-Q SilverSoaker（I-フロー、レイクフォレスト、カリフォルニア州）でON-Q PainBusterを挿入します。 ON-Q PainBusterの痛みを軽減するシステムが継続的に2ミリリットル/ hの速度で生理食塩水を提供します。キャリアは櫛することができますとinedまたはそのような局所麻酔薬および非ステロイド性抗炎症薬のような目的の薬に比べて。
- 指定された時点で創傷滲出液の吸引を可能にするためにこのシステムに標準の三方活栓を組み込んでいる。連続注入、凝固からカテーテルを防止し、滲出液サンプルを生成するために、システムの信頼性を向上させます。滲出液の吸引が困難な場合（例約5％）、傷の上にそっと押す（ 例えば 、患者が座ったりが平らに横たわって）被写体の位置を変え、0.5〜1ミリリットル生理食塩水フラッシュを使用するか、撤退を検討カテーテル1〜2センチメートル。
- プロトコル（ 例えば 、1、4、6、24、帝王切開分娩48時間後）で指定された時点で、創傷滲出液の1ミリリットルを吸引し、撤退する。プロテイナーゼインヒビターの30μlを含むポリエチレンカップに滲出液を移す。我々は、我々の目的のために完全なプロテイナーゼ阻害剤（バイオサイエンスロシュ、パロアルト、CA）を使用しています。
- コレクションの1時間以内に、10分間3,000 rpmで氷と遠心分離機にサンプルを置く。
- -20℃での標準的なマイクロ遠心チューブや店舗における血清および創傷清と場所を削除する
3。アッセイ分析
- 一度すべての研究滲出および血清試料を収集し、保存、解凍し、同時にサンプルを分析しています。
- 我々は、マルチプレックスイムノアッセイを用いてサイトカインやケモカインを測定した。多重免疫アッセイ技術は、私たちは小さい（50μl）をボリュームサンプルから多数の検体をアッセイすることができます。マルチプレックスは、ELISA法を用いて得られたものと同等の結果を生成します。我々は17プレックスバイオPlexTMシステム（バイオラッド、ハークを使用していた我々の分析のためにULES、カリフォルニア州）。このアッセイは、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターフェロンα（INFα）、インターロイキン1β（IL-1β）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5を測定することが可能である）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン（IL-10）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン13（IL-13）、インターロイキン17（IL-17）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP-1β）。神経成長因子は、Bio-Plexのアミンカップリングキットと17-プレックスのプレートを追加することで、NGF DY256抗体を用いて測定した。
- 良い品質の分析を確実にするために、各測定が重複してなされるべきである。各分析対象成分の標準曲線は（0.20の濃度で、0.78、3.13、12.5、50、200、800、3200 pg / mlのプラスメーカーによって供給される基準の検体を使用して生成され生理食塩水はゼロ標準）。標準曲線は、各ランに含まれており、試料濃度は、Bio-Plexのマネージャーソフトウェアで計算されます。
- サブスタンスPおよびプロスタグランジンE2は非常に感度のELISAキットを用いて測定した。我々は、この分析のためにアッセイデザイン社（アナーバー、ミシガン州）が使用されています。メーカーの仕様によると、二重に分析を実行します。
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Representative Results
この方法論を使用して、我々は、創傷滲出液および血漿中のIL-5の例外を除いて上記のすべての生化学メディエーターを検出することができました。1,2いくつかの追加のサイトカインが（TNFα、IL-4、IL-17、、血漿中では検出されなかったINFγ 、GM-CSF）。報告された研究で測定されたサイトカインおよびケモカインの1時間コースでは、24時間の観察期間持続した最初の数時間以内にプラトーに達し、一貫していた... 1,2しかし、NGFはにわたって着実に増加全体的なプロとの互換性IL-10および局所麻酔薬ブピバカインを注入傷のサブスタンスPの増加したレベルのPGE2 1時間以内にピークに達し、その後徐々に減少した。1特に注目すべき結果が著しく減少しているレベルのに対し、24時間の収集期間、薬剤の炎症作用（ 図1）。2 つの異なる研究では、我々は帝王切開デ後にその鎮痛剤の消費を実証カラーリングの手術が悪影響傷滲出液IL-6、IL-1β、およびG-CSF濃度（ 図2）と相関していた。1
図1インターロイキン-10（IL-10）、サブスタンスPは1で測定された滲出液レベルの濃度（pg / ml）を、3、5、7、および24時間後に帝王切開を巻いた。生理食塩水群は、グレーダイヤモンドで示され、ブピバカイン群が黒い四角で表示されます。 * =群間で有意差（p <0.005）。
図2：インターロイキン-6（pg / ml）をと帝王切開分娩後最初の24時間のモルヒネ消費量との相関。
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Discussion
上記のこの方法は、創傷滲出液生化学的炎症と侵害受容性メディエーターを検出するのに十分な感度であることが判明している。各種の時点でのサンプリングはまた、私たちは時間をかけてこれらのメディエーターの変化を観察することができました。1,2は、我々 は逐次外科創傷滲出液における炎症と侵害受容性メディエーターの放出プロファイルを測定する他のどの人間の手術創検定を意識していません。手術切開部位から創傷滲出コレクションの我々の方法論からの結果は股関節からの排水を利用した研究とは異なる、その皮下創傷メディエーターの放出を示唆している7,8は、関節内または他の体腔生化学メディエーター放出とは異なる場合があります。さらに、排水溝で得られた結果は、傷に失血によって混乱することができ、したがって、彼らは正確にローカル生化学メディエーターの放出を反映しないかもしれません。
の間に低い相関傷や血清レベルは、手術創を勉強したときに、サイト固有のリリースを決定することの重要性を示しています。ローカルの変更が原因で外科手術による外傷やストレスに応答して、差動全身および現地生産を含む多くの要因に全身反映されない場合があります。我々は、他の外科のモデルに適用され、他の多くのことができる1,2の 、帝王切開分娩の傷からの滲出液から特定 のプロと抗炎症性サイトカインおよびケモカインの選択だけでなく、NGF、SPと、PG-E2を測定するためにこの方法を選択しているものの生化学メディエーター。
手術創の局所麻酔点滴は術後疼痛を改善するための一般的に使用されるテクニックです。9は方法論を適用して、私たちは傷の生化学に影響を与えない手術の傷にその局所麻酔薬注入を実証することができました。2は 、IL-10の低下やサブスタンスPの上昇ブピバカイン点滴による創傷滲出液で混乱oを示唆しているF抗炎症変調。末梢的に投与局所麻酔薬は、それによって部分的に手術後の関節の局所麻酔薬誘発性軟骨融解を占める可能性があります炎症過程、10,11に影響を与えることがあります12
ON-Q PainBusterの痛みを軽減するシステムが米国食品医薬品局（FDA）は、手術後の痛みを軽減するために外科的創傷部位に局所麻酔薬の送達のために使用されている1998年以降、デバイスを承認されています。これと他のカテーテルを用いた連続的な傷の点滴は、増加創傷感染に関連付けられていません。オンQ SilverSoakerと9,13のON-Q PainBusterは薬を注入すると繰り返し創傷滲出液をサンプリングしないように設計されています。我々はこの技術との創傷感染がなかったが、このシステムから創傷滲出液をサンプリングしながら、我々は無菌テクニックを強調している。サンプリングを容易にするために、私たちの提案した変更は、研究目的のために確保されるべきではなく、日常的な臨床uに対してSE。我々はまた、カテーテルがその場に残っている期間は48〜72時間に制限されることをお勧めします。
この手術部位のバイオアッセイ技術は、術後疼痛における炎症と侵害受容生化学メディエーターの間の関係を理解するための良いモデルを提供します。我々は、局所的に投与され、非ステロイド性抗炎症薬およびオピオイドの効果を調べるために、今後の研究方法論を使用します。技術はまた、創傷治癒、過度の瘢痕手術や創傷感染を調べる調査に自分自身を貸すかもしれません。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
博士カルバリョの仕事は女性の健康と母子保健と米国立衛生研究所（5K12 HD043452）の人間開発の国立研究所で研究局からの研究助成金によって支えられている。博士の不安は、I-フロー（レイクフォレスト、カリフォルニア州）からの供給（オンQ PainBuster術後痛みを軽減するシステム）と資金（生化学的アッセイ用）を受け取った。
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