Summary
本文介绍了利用萤火虫荧光素-GFP融合蛋白进行调查
Abstract
proteostasis，定义为蛋白质折叠/生物合成的组合过程中，复性/维修，和退化，必须维护，以避免有害的后果1细胞是一个微妙的平衡。外部或内部因素破坏这种平衡可以导致蛋白质聚集，毒性和细胞死亡。对于人类来说，这是一个主要因素与神经退行性疾病相关的症状，如亨廷顿氏，帕金森氏症和阿尔茨海默氏病10。因此，它是必不可少的蛋白质参与维护proteostasis的被确定为了开发这些使人衰弱的疾病的治疗方法。本文中所描述的技术用于监测体内蛋白质折叠使用的模型蛋白萤火虫荧光素酶，绿色荧光蛋白（FFL-GFP）融合，以接近实时的时间分辨率。 FFL-GFP是一个独特的模型嵌合的蛋白质，FFL部分是极其敏感的应激诱导米isfolding和聚合，失活的酶12。监测使用酶法测定荧光素酶活性，在GFP部分提供了一种方法，可视化的水溶性或凝集的平板荧光灯用自动化显微镜。这些耦合的方法包括两个平行和技术上独立的方法来分析应力后一种酶复性和功能重新。恢复活性，可直接与分类和重溶动力学，以便更好地了解蛋白质的质量控制因素，如蛋白质伴侣协作来执行这些功能。此外，基因的缺失或突变可用于测试特定的蛋白质或蛋白质亚基的贡献，这个过程。在这篇文章中，我们研究的贡献HSP104的蛋白质disaggregase的13，被称为折叠系统5与Hsp40/70/nucleotide的交换因子（NEF）的合作伙伴，蛋白质折叠，来验证这种方法。
Introduction
在人类神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏症，帕金森氏病和亨廷顿病已与蛋白质错误折叠和聚合10。细胞采用分子伴侣防止动能捕获细胞的蛋白质错误折叠的无效结构6。分子伴侣参与细胞内的复杂的相互作用网络，但它是不完全的理解这些相互作用的总和是如何有助于有机体proteostasis。负责为广大胞浆蛋白折叠的主要伴侣之一是70 kD的热休克蛋白（HSP70）家族19。它已经表明，在酵母中的Hsp70减少损失新生的异源表达的平板荧光灯能够折叠和重折叠，鸟氨酸transcarbamoylase，内源性蛋白7 在体内 18。能够分析近实时分辨率折叠方便了解更多的细胞因子续ribute这HSP70依赖的过程。此外，可能不完全依赖于这些蛋白质有助于折叠/折叠反应，所以实验必须敏感，可以探测动力学和效率的大，小的变化。
酵母细胞disaggregase，HSP104，在修复聚合错误折叠的蛋白质中起着至关重要的作用。 Hsp104同源物已确定在真菌和植物，这个家庭似乎是在后生动物缺席。已经提出了其他分子伴侣，如HSP110家族的一些已知的Hsp104在哺乳动物中的活动16执行。 HSP104为AAA +，六聚体蛋白复合物的功能在改造蛋白质聚集酵母，折叠和维修13。 HSP104，沿与Hsp70的酵母，SSA1，和酵母HSP40，Ydj1为，是必需的恢复变性平板荧光灯在酵母细胞中5星，8。小的热休克蛋白，HSP26，也被证明是地磁红的Hsp104介导分解FFL 2。
FFL是一个双结构域的蛋白结合的活性位点的构象变化，需要ATP和氧，脱羧后的衬底荧光素释放氧化萤光素，二氧化碳（CO 2），腺苷一磷酸（AMP），和光11，在基板9，3。市售FFL基板，D-荧光素，使用光度计15，可以检测到550-570纳米之间的光发射的结果。 FFL是极其敏感变性化学或热处理和聚合后迅速展开。当暴露在温度39-45°C之间的，FFL可逆展开和灭活12。相比之下，GFP及其衍生物具有很高的耐应力14蛋白质变性。因此，这两种蛋白质的融合使得FFL充当实验能够瞄准功能ĝ的不稳定部分FP细胞内的存款，可以用荧光显微镜可视化人口和单细胞水平。酶法测定半自动化加上自动显微镜的多模板读数器中的应用允许前所未有的复性反应的动力学和产量的同时评估。此外，轻便的分子遗传学模型真核生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）允许的蛋白质的质量控制网络的机会，发现为基础的方法，以确定新的播放器，促进细胞的应激反应和proteostasis两个精确操纵。
在这项研究中，野生型（WT）和的HSP104缺失株FFL-GFP表达热休克蛋白变性。 FFL-GFP复性进行监测，通过酶法测定和代理读数显微镜维修表达蛋白质组过一个恢复时间当然。当野生型细胞相比，我们表明êHSP104折叠FFL-GFP突变株〜60％的效率较低，支持以前的研究结果，建立HSP104的激活变性FFL 2的一个角色。
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Protocol
1。含FFL-GFP质粒菌株建设
在这项研究中， 酿酒酵母菌株BY4741（MAT 一个 his3Δ1，leu2Δ0，met15Δ0，ura3Δ0）一起使用从酵母基因敲除集合（打开生物系统/ Thermo Scientific的）一个的HSP104缺失菌株。删除Hsp104特异性抗体免疫印迹分析证实。
FFL-GFP表达p426MET25 FFL-GFP，构建一个基于LEU2源质粒格洛弗实验室获得多伦多大学17索取请求提交后。 MET25甲硫氨酸阻遏的启动子控制的FFL-GFP质粒的融合蛋白的表达。质粒转化到每一株被改编从Gietz 等使用的协议。人 ，1995年：
- 离心25毫升Ø f日志期细胞50毫升锥形管2分钟，在4,400 rpm的转速下，用500微升的双蒸H 2 0（DDH 2 O），弃上清。
- 将细胞重新悬浮在250μl的TE /醋酸锂（的Tris-HCl的10mM，pH值= 7.5，1mM EDTA的溶液，0.1M乙酸锂）。搅拌20分钟，在30°C孵育没有。
- 50μl的感受态细胞转移到新的试管，以及载体DNA，用5毫升（50微克）和5μl（0.1-5微克）质粒DNA。添加300μl的PEG / TE /醋酸锂（相同的TE /醋酸锂加40％的聚乙二醇），此混合物中加入另外的30分钟，在30℃下孵育。
- 1/10体积（体积/体积）的DMSO（36微升）加入到该混合物中，并在42℃下热休克6分钟。
- 混合物以6,000 rpm离心30秒，除去上清液。细胞重悬在100μl的无菌DDH 2 O和板细胞在缺乏尿嘧啶（SC-URA）的合成完整的媒体。
2。 FFL-GFP诱导
NT“> FFL-GFP诱导，一旦细胞对数生长期，所以大部分的蛋白质，热休克前新，以避免随着时间的推移，由于衰老相关的细胞不足蛋白质，身患汇总。- 第1天：孵育细胞在5毫升SC-市建局在30°C旋转O / N。
- 第2天：测量外径600和5 SC-URA外径600〜0.2毫升接种新鲜文化。
- 培养与旋转30°C，直到他们达到数生长期外径600〜0.8-1.0。
- 3分钟后，倾去上清液，重悬细胞沉淀在15毫升锥形管，在4,400 rpm转速离心细胞DDH 2 0 500微升;离心管中的传输解决方案。
- 在6000转离心，弃上清。
- 重悬细胞SC-URA-MET在5毫升。细胞应在30℃下孵育1小时，在这样的介质旋转
- 离心机细胞和重复洗的DDH 2 0丢弃上清。
- Resuspe第二细胞在5毫升SC-市建局媒体含有100微克/毫升，放线菌酮抑制蛋白的表达，并立即进行步骤3。
3。酶法FFL-GFP恢复含量
此法是一种定量的方法来确定在一个群体中的活性酶的水平。
- 这个实验的准备工作：
- 测量每个样品外径600。
- 准备所需的必要量的D-荧光素的基础上的样本数量和所需数量的复加油管约1200微升。 D-荧光素的终浓度为〜23微克每100μl的细胞。最初，它是溶解在水中的储备液浓度为7.5毫克/毫升，实验前稀释至455微克/毫升在SC。在图2中，重复三次，对每个样品进行了分析，得到的共2.4毫升D-荧光素被使用。
- 程序酶标仪的闪光LUMI释光测定（BioTek的GEN5“发光闪光含量与注射”改编自其他工具按照制造商的说明）
- 至30℃的设定温度
- 设置钢板读者添加D-荧光素，摇匀，并读取每个单独。
- 阅读发光（端点读取积分时间，5秒，180灵敏度电平）
- 恢复检测每个读数之间摇5分钟，延时20分钟，摇5分钟。
- 免除50微升的D-荧光素从一个喷油器。
- 后立即测量的细胞中添加介质中放线菌酮，阻止蛋白质的合成预热休克发光的。
- 每个样品100微升细胞转移成固体白色96孔板中所需的重复数。
- 应包括控制水的空白，并含有空载体的细胞。
- 开始读与SPE上面列出的cifications。
- 变性，的平板荧光灯-GFP FFL部分，在一个玻璃培养管中孵育5毫升培养在42℃下摇动25分钟。
- 恢复化验发光读数立即启动细胞去除后，从孵化器，这是时间点零。测量发光上述相同的第一时间点和每30分钟90分钟。
- 将正常化样品预热休克发光值已作调整的基础上外径600（外径600划分的预热冲击值）。
4。荧光显微镜
此法是一种半定量的方法来确定随着时间的推移在一个群体中的细胞聚集体溶解。
- 感应第2节中所描述的相同，步骤1-8的协议。
- 同一时间点作为上述（ 第3项，第4步 ），但对于麦克风roscopy收集1毫升预热休克细胞，每个恢复的时间点，并孵育样品，于30℃培养管旋转。
- 可视化：
- 1毫升的细胞以6,000 rpm离心30秒，除去上清液。
- 重悬细胞沉淀中加入2μl双蒸2 O。
- 混合2微升的细胞加2微升2％的低熔融琼脂糖幻灯片上，加盖玻片。为了获得一个单一的平面的细胞轻轻地按压手指在盖玻片的中心和旋转，直到盖玻片难以移动。
- 细胞可视化使用100X油目标的荧光显微镜使用DIC可视化细胞和FITC过滤的可视化绿色荧光。
- 每个菌株在各时间点的定量，以多张图片。图片字段应该包含〜15-30细胞实验后定量分析。
- 要包含聚集的细胞百分比计算，算上50-100细胞总数除以包含聚集的细胞。
5。单细胞显微镜
使用这种方法时，按照随着时间的推移在单个细胞中的单个聚集体的增溶。
- 诱导FFL-GFP的表达， 第2节中所描述的步骤1-8。
- 热休克后，离心细胞15毫升锥形管，在4,400 rpm的转速为2分钟。
- 洗涤细胞用500μl的水重悬在20微升双蒸2 O。
- 对于每个应变，切出部分的SC-市建局的琼脂平板和一个5x5毫米使用表面接触培养皿，吸管4μL枪头，琼脂表面的细胞和周围蔓延。让我们站在〜1分钟。
- 使用镊子，将琼脂立方体正面朝下放在一个〜55毫米的玻璃底菜0号，轻轻按下。
- 可视化：
- 教I-III离子4。
- 设置2-4重点每一株取决于密度的文化坐标。
- 设置适当的范围（ - / +与0.5-1.0微米的切片厚度15微米）90分钟内每5分钟一个Z堆栈相机拍照。
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Representative Results
酵母是依赖于disaggregase，HSP104高效地热变性的蛋白质复性。 FFL-GFP的活动进行了监测热休克25分钟后，使用发光闪光检测图1。这个自动化的测定如图2所示的结果揭示了超过90分钟，最终导致了一个野生型细胞> 80％恢复的活动逐步增加。该hsp104Δ应变恢复原有活性的19％，在同一时间帧。此外，初始失活程度远远高于伴侣突变株（26％活动在WT和11％hsp104Δ），暗示HSP104一定的保护作用预应力服务，或迅速联营变性FFL-GFP在热灭活步骤，以降低酶的活性丧失。
人口显微镜证实了酶的活性测定。几乎所有的细胞在的hsp104D突变STRA在保持至少一个FFL-GFP总聚集在WT品系热休克后在90分钟内（ 图3），减少了62％的数量相比。虽然相当数量的聚集形成两个菌株热休克后，立即迅速下降，而野生型细胞的数量包含集合失败hsp104Δ细胞清除观察泪点。这些数据证实了活性测定WT的活性回收率52％，这表明相对于最小的8％的回收率在hsp104Δ应变。
单细胞自动化显微镜观察发现，在WT的细胞与hsp104Δ应变，FFL-GFP溶解率较高（代表性静止图像， 如图4所示;见补充FFL-GFP重新溶时间推移一系列电影）。此外，的蛋白质聚集体的动力学是非常不同的，在野生型细胞中的聚集体融合的趋势前被溶解的，这是不遵守在hsp104Δ应变。此法不仅支持其他两种方法的结果，同时也揭示洞察如何聚合蛋白的溶解和复性的可能机制。
图1。 FFL-GFP热休克复苏实验示意图。FFL-GFP的表达诱导细胞已培养SC-市建局对数生长期。为了诱导细胞孵育SC-URA-MET 1小时。离心机细胞重悬在含有SC-市建局的100微克/毫升酮（CHX）。热休克，25分钟，在42°C培养细胞。让细胞恢复在30°C孵育收集样本进行了90分钟的时间过程。 D-荧光素酶检测每个读数前增加。文献=的“https://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg”目标=“_blank”>点击这里查看大图。
图2。 FFL-GFP酶折叠/恢复检测。的的WT和hsp104Δ细胞（100微升）的样品前收集到热休克后立即热休克每个时间点（0，30，60和90分钟）。等分到三个重复，每个样品的96孔白色板的孔中，每个时间点。读数，板读数器被设置为测量发光每30分钟在30℃下90分钟
<BR /> 图3。 FFL-GFP重折叠显微镜 1毫升的在每个时间点的细胞（预-HS，0，30，60和90分钟），收集并离心。上清液吸出，细胞重新悬浮于2微升水。低熔融琼脂糖与2μl混合，制备细胞。细胞可视化使用100X油目标。每个时间点的代表图像显示。定量是通过4-5字段计数细胞并计算包含聚集体的细胞的百分比（〜100）。
图4。折叠显微镜FFL-GFP的时间过程的单细胞收集张贴热休克5 ml细胞，离心，再悬浮在20μl双蒸2 O 4微升的细胞被放置在一个5毫米2
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Discussion
在这篇文章中的模型蛋白FFL-GFP是用来显示该的酵母disaggregase，HSP104有助于蛋白质重新溶解和维修。的酶活分析和显微镜差异讯问的相同的底物蛋白的状态来确定的复性效率和产量。酶的恢复检测的结果表明，不仅是在的突变株hsp104D效率低下的最大恢复，但在突变株（ 图2）展开应力的初始幅度更大。分析还显示，虽然出现hsp104D细胞试图修复，他们无法重新折叠蛋白尽快野生型细胞。这种方法允许FFL-GFP活动的敏感和定量分析，揭示HSP104的重要作用，这种蛋白质的修复。
显微镜观察结果表明，低效的维修FFL酶变性的原因是由于吨Ø蛋白捕获内聚集。总体分析表明，，在缺乏HSP104细胞，无细胞可完全清除所有聚集在90分钟（ 图3）。此外，单细胞的分析表明，聚集体保险丝随着时间的推移，这表明合并成较大的结构更小的聚集体可能有助于修复和再折叠过程中（ 图4）。虽然这一结果并不明显，从静止图像，时间推移电影允许人们按照独立总量的动态行为。总量指标的时间过程观察露天减少总的融合在hsp104Δ菌株，表明这些细胞不形成较大的结构，有效地表明HSP104所需的蛋白质的质量控制的这一方面。进一步的猜测是，细胞溶解蛋白质更快地从这些总量较大，可能还含有分解和维修米achinery。单细胞显微镜也可以被使用，以确定是否其他分子伴侣和伴侣中的较大与较小的聚集体存在，并，，如果此居留柄的随时间变化。
连同这些方法允许在活细胞蛋白质的折叠和维修生物化学和细胞生物学分析。所述的三种方法的结果，得到集成多维洞察细胞恢复后proteotoxic的热休克的动力学和效率。在协议中的部分或全部步骤的自动化也允许更大的样本量和生物复制在一个给定的实验中，增加的鲁棒性和最终结果的信心。此外，这些方法在理论上可以扩展到在人类细胞中，而不是只对遗传分析中使用，而且还调查化学物质，改变proteostasis的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由授予来自美国国立卫生研究院（NIGMS-074696）锦和美国社会的微生物罗伯特D.沃特金斯研究生研究奖学金JLA我们也感谢在多伦多大学的约翰·格洛弗提供的FFL ，GFP源质粒。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
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