Summary
Denne artikel beskriver anvendelsen af en ildflue luciferase-GFP-fusionsproteinet til at undersøge
Abstract
Proteostasis, defineret som de kombinerede processer proteinfoldning / biogenese, refoldning / reparation, og nedbrydning, er en delikat cellulære balance, der skal opretholdes for at undgå skadelige konsekvenser 1.. Eksterne eller interne faktorer, der forstyrrer denne balance kan føre til proteinaggregering, toksicitet og celledød. Hos mennesker er dette en væsentlig medvirkende faktor til de symptomer forbundet med neurodegenerative lidelser såsom Huntingtons, Parkinsons og Alzheimers sygdom 10.. Det er derfor vigtigt, at de proteiner involveret i opretholdelsen af proteostasis identificeres med henblik på at udvikle behandlinger for disse invaliderende sygdomme. Denne artikel beskriver teknikker til overvågning in vivo proteinfoldning ved nær-realtid opløsning ved hjælp af modellen protein ildflueluciferase fusioneret til grønt fluorescerende protein (FFL-GFP). FFL-GFP er en unik model kimære protein som FFL delen er yderst følsomt over for stress-induceret misfolding og aggregering, der inaktiverer enzymet 12.. Luciferaseaktivitet overvåges ved hjælp af en enzymatisk assay og GFP-delen tilvejebringer en fremgangsmåde til visualisering af opløselige eller aggregerede FFL hjælp automatiseret mikroskopi. Disse koblede metoder indarbejde to parallelle og teknisk uafhængige tilgange til at analysere både refoldningen og funktionel reaktivering af et enzym efter stress. Aktivitet opsving kan være direkte korreleret med kinetik for opdeling og re-solubilisering til bedre at forstå hvordan protein kvalitetskontrol faktorer såsom protein chaperoner samarbejder om at udføre disse funktioner. Desuden kan gendeletioner eller mutationer bruges til at teste bidrag af specifikke proteiner eller protein-underenheder til denne proces. I denne artikel vil vi gennemgå bidragene af proteinet disaggregase Hsp104 13, kendt for at samarbejde med den Hsp40/70/nucleotide udveksling faktor (NEF) genfoldning system 5 til Proteingenfoldningstrin at validere denne fremgangsmåde.
Introduction
Hos mennesker neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sygdomme har været knyttet til protein misfoldning og aggregering 10.. Celler anvender molekylære chaperoner at forhindre kinetisk indfangning af cellulære proteiner i fejlfoldede inaktive strukturer 6.. Chaperones deltager i indviklede interaktionsnetværk i cellen, men det er ikke helt forstået, hvordan summen af disse interaktioner bidrager til organismal proteostasis. En af de vigtigste chaperoner er ansvarlige for størstedelen af cytosolprotein foldning er den 70 kD heat shock protein (Hsp70) familie 19.. Det har vist sig, at i gær tab af Hsp70 falder evnen til at folde spirende heterologt udtrykt FFL og refolde det endogene protein, ornithin transcarbamoylase in vivo 18, 7. Evnen til at analysere folde med nær-tidstro opløsning vil lette forståelsen hvordan ekstra cellulære faktorer contribute til denne Hsp70-afhængig proces. Desuden kan folde / genfoldning reaktioner ikke være helt afhængige af disse bidrager proteiner, så assays skal være følsom nok til at påvise både store og små ændringer i kinetik og effektivitet.
Gærcellen disaggregase, Hsp104, spiller en afgørende rolle i at reparere aggregerede fejlfoldede proteiner. Selvom Hsp104 homologer er blevet identificeret i svampe og planter, denne familie synes at være fraværende i metazoans. Det er blevet foreslået, at andre chaperoner såsom dem af Hsp110 familien udføre nogle af de kendte Hsp104 aktiviteter i pattedyr 16. Hsp104 er en AAA +, hexamert protein kompleks, der fungerer i gær at omforme protein aggregater, der bidrager til refoldningen og reparation 13. Hsp104, sammen med gær Hsp70, Ssa1 og gær Hsp40, Ydj1, er nødvendig for inddrivelse af denatureret FFL i gærceller 5, 8. Den lille varmechokprotein, Hsp26, har også vist sig at være vandskravenerød for Hsp104-medieret opdele FFL 2..
FFL er et to-domæne protein, der binder substratet luciferin i det aktive site og efter en konformationsændring, som kræver ATP og oxygen, decarboxylates substratet og frigør oxyluciferin, kuldioxid (CO 2), adenosinmonophosphat (AMP) og lys 11. 9, 3. Den kommercielt tilgængelige FFL substrat, D-luciferin, resulterer i lysemission mellem 550-570 nm, der kan registreres ved hjælp af et luminometer 15. FFL er udsøgt følsom over for denaturering fra kemiske eller varme behandlinger og aggregater hurtigt upon udfoldning. Når de udsættes for temperaturer mellem 39-45 ° C FFL er reversibelt udfoldet og inaktiveret 12.. I modsætning hertil er GFP og dets derivater meget modstandsdygtig over for proteinudfoldning spændinger 14. Derfor fusion af disse to proteiner giver FFL at fungere som et eksperimentelt labil del kan målrette funktionel GFP til intracellulær aflejringer, kan visualiseres ved hjælp af fluorescens mikroskopi på både befolkning og encellede niveauer. Anvendelse af den enzymatiske assay i en semi-automatiseret multimode pladeaflæser kombineret med automatiseret mikroskopi tillader fortilfælde samtidig vurdering af kinetik og udbytte af genfoldning reaktioner. Desuden giver de facile molekylære genetik af modellen eukaryote Saccharomyces cerevisiae både præcis manipulation af proteinet kvalitetskontrol netværk og mulighed for opdagelsen tilgange til at identificere hidtil ukendte spillere bidrager til cellulære stress respons og proteostasis.
I denne undersøgelse er vildtype (WT) og HSP104 sletning stammer, der udtrykker FFL-GFP underlagt proteindenaturering varmechok. FFL-GFP refoldningen overvåges gennem både en enzymatisk assay og mikroskopi som en proxy udlæsning til reparation af det udtrykte proteom over en restitutionstid kursus. Sammenlignet med WT celler, viser vi the Hsp104 deletionsstammen er ~ 60% mindre effektive til genfoldning FFL-GFP, støtte tidligere resultater oprettelse en rolle for Hsp104 i reaktivering af denatureret FFL 2..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Konstruktion af stammer, som indeholder FFL-GFP plasmid
For denne undersøgelse blev Saccharomyces cerevisiae stamme BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0), der anvendes sammen med en HSP104 deletionsstammen fra gæren knockout kollektionen (Open Biosystems / Thermo Scientific). Sletningen blev bekræftet ved hjælp af en Hsp104-specifikt antistof til Western blot-analyse.
FFL-GFP blev udtrykt fra p426MET25-FFL-GFP, konstrueret af et LEU2-baseret kilde plasmid opnået fra Glover laboratorium på University of Toronto 17 og fås ved henvendelse til forfatterne. Ekspression af FFL-GFP plasmid fusionsprotein styres af MET25 methionin-repressibel promotor. Plasmidet blev transformeret ind i hver stamme under anvendelse af en protokol blev tilpasset fra Gietz et. al, 1995:
- Centrifuge 25 ml o f logaritmisk fase celler i en 50 ml konisk rør ved 4.400 rpm i 2 minutter, vaskes med 500 pi dobbelt destilleret H 2 0 (ddH2O), og kassér supernatanten.
- Resuspender celler i 250 pi TE / LiAc (Tris-HCI 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M lithiumacetat). Inkuber ved 30 ° C uden omrøring i 20 min.
- Overfør 50 ul kompetente celler til et nyt rør sammen med 5 ml (50 mg) af bærer-DNA og 5 pi (0,1-5 mg) af plasmid-DNA. Tilsæt 300 pi af PEG / TE / LiAc (samme som TE / LiAc plus 40% polyethylenglycol) til denne blanding, og inkuber cellerne ved 30 ° C i yderligere 30 minutter.
- Tilføj 1/10 rumfang (v / v) DMSO (36 ul) til denne blanding og varmechok ved 42 ° C i 6 min.
- Centrifuger blandingen ved 6000 rpm i 30 sek, og fjern supernatanten. Resuspender cellerne i 100 ul sterile Hedeselskabet 2 0 og plade celler på syntetisk komplette medier mangler uracil (SC-URA).
2.. Induktion af FFL-GFP
nt "> FFL-GFP induceres når cellerne er i log-fase, så størstedelen af proteinet forud for varmechok nyligt er lavet for at undgå proteiner, der terminalt aggregeret over tid på grund af aldring-associerede cellulære mangler.- Dag 1: Cellerne inkuberes i 5 ml SC-URA ved 30 ° C roterende O / N.
- Dag 2: Mål OD 600 og inoculate friske kulturer i 5 ml SC-URA OD600 ~ 0,2.
- Inkuber kulturer med rotation ved 30 ° C, indtil de når log fase OD600 ~ 0,8-1,0.
- Centrifuger cellerne i 15 ml koniske rør på 4.400 rpm i 3 minutter, dekanteres supernatanten og resuspender cellepelleten i 500 pi af Hedeselskabet 2 0, overførsel løsning til et mikrocentrifugerør.
- Centrifugeres ved 6.000 rpm og kassér supernatanten.
- Resuspender celler i 5 ml SC-URA-MET. Celler bør inkuberes roterer i dette medie i 1 time ved 30 ° C.
- Centrifuge celler og gentag vask i Hedeselskabet 2 0 og kassér supernatant.
- Resuspend celler i 5 ml SC-URA medier, der indeholder 100 mg / ml cycloheximid at hæmme protein udtryk, og gå straks til Trin 3..
3.. Enzymatisk FFL-GFP Recovery Assay
Dette assay er en kvantitativ fremgangsmåde til at bestemme indholdet af aktivt enzym i en population.
- Forberedelse til denne analyse:
- Mål OD 600 for hver prøve.
- Forbered nødvendige mængde D-luciferin nødvendig baseret på antallet af prøver og ønskede antal gentagelser plus ca 1.200 pi for slangen. Slutkoncentration af D-luciferin er ~ 23 ug pr 100 ul celler. Oprindeligt det er opløst i vand ved en stamopløsning koncentration på 7,5 mg / ml og fortyndet til 455 ug / ml i SC før eksperimentet. I figur 2 replikater tre for hver prøve blev analyseret resulterer i en total på 2,4 ml D-luciferin bliver brugt.
- Program pladelæser for flash luminescence assay (tilpasset fra BioTek Gen5 "Luminescence Flash Assay med Injection" for andre instrumenter følg producentens anvisninger)
- Indstil temperaturen til 30 ° C
- Indstil pladelæser at tilføje D-luciferin, ryst og læse hver godt individuelt.
- Læs luminescens (endpoint læsning, 5 sek integration tid, 180 følsomhed niveau)
- Til nyttiggørelse assay mellem hver aflæsning ryste i 5 min, forsinke 20 minutter og ryste en yderligere 5 min.
- Dispensér 50 pi af D-luciferin fra en injektor.
- Forvarm-shock luminescens måles umiddelbart efter celler tilsættes til medier, der indeholder cycloheximid at standse proteinsyntese.
- Overfør 100 ul celler til hver prøve med ønsket antal gentagelser i en fast hvid plade med 96 brønde.
- Kontrollen bør omfatte en vand tomt, og celler, der indeholder en tom vektor.
- Start læses med spefikationer anført ovenfor.
- At denaturere FFL delen af FFL-GFP, inkuberes 5 ml kultur i et glas kultur rør ved 42 ° C rystning i 25 min.
- Recovery assay luminescens aflæsninger starter umiddelbart efter celler fjernes fra inkubatoren, der er tidspunkt nul. Foranstaltning luminescence samme som beskrevet ovenfor for det første tidspunkt og hver 30 min i 90 min.
- Normalisere prøver at forvarme-chok luminescens værdier, der er blevet justeret på grundlag af OD 600 (opdele forvarme-chok værdier ved OD 600).
4.. Fluorescens mikroskopi
Dette assay er en semikvantitativ metode til at bestemme solubilisering af aggregater over tid i en population af celler.
- Induktion er den samme som beskrevet i afsnit 2, trin 1-8 af protokoller.
- Samtidig punkter er taget som beskrevet ovenfor (afsnit 3, trin 4), men for microscopy indsamle 1 ml celler ved forvarmning-chok og hver recovery tidspunkt, og inkuberes prøver roterende ved 30 ° C i kultur rør.
- Visualisering:
- Centrifuger 1 ml celler ved 6.000 rpm i 30 sek, og fjern supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 2 pi Hedeselskabet 2 O.
- Bland 2 pi celler plus 2 pi 2% lavtsmeltende agarose på diaset og tilføje en tildækningsslip. For at opnå et enkelt plan af celler let tryk finger ned i midten af dækglasset og rotere indtil dækglasset er svært at flytte.
- Celler er visualiseret ved hjælp 100X olie målsætning om fluorescerende mikroskop, bruge DIC at visualisere celler og FITC filter til at visualisere GFP-fluorescens.
- Tage flere billeder for hver stamme på hvert tidspunkt for kvantificering. Felter billeder bør indeholde ~ 15-30 celler til kvantitativ post-eksperimentel analyse.
- For at beregne procentdelen af celler, der indeholder aggregater, tælle 50-100 Celler i alt og dividere antallet af celler indeholdende aggregater.
5.. Single Cell Microscopy
Denne metode anvendes til at følge solubilisering af individuelle aggregater i en enkelt celle over tid.
- Fremkald FFL-GFP udtryk, som beskrevet i afsnit 2, trin 1-8.
- Efter varme-shock, centrifugeres cellerne i 15 ml koniske rør ved 4.400 rpm i 2 min.
- Vask cellerne med 500 ul vand og resuspender i 20 ul Hedeselskabet 2 O.
- For hver stamme, skære en 5x5 mm sektion af en SC-URA agarplade og bruge den overflade, der var i kontakt med petriskålen pipette 4 pi celler og sprede omkring overfladen af agar med pipettespidsen. Lad det stå i ~ 1 min.
- Brug en pincet til at placere agar terning sektion forsiden nedad på en ~ 55 mm glasbund fad nr. 0 og tryk ned let.
- Visualisering:
- Se I-III i Section 4..
- Set koordinater for 2-4 knudepunkter for hver stamme afhængigt tæthed af kulturen.
- Indstil kameraet til at tage billeder med en Z-stack med passende interval (- / + 15 um med 0,5-1,0 um skivetykkelse) hver 5 min i en 90 min periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gær er afhængig af disaggregase, at Hsp104 effektivt genfolde varme-denaturerede proteiner. Aktiviteten af FFL-GFP blev overvåget efter en 25 min varmechok, ved hjælp af en luminescens flash assay Figur 1.. Resultaterne af denne automatiserede assay er vist i figur 2 viste en trinvis stigning i aktivitet i løbet af 90 minutter, der i sidste ende førte til en> 80% genvinding i WT celler. Den hsp104Δ stammen genvundet 19% af den oprindelige aktivitet i den samme tidsramme. Desuden er omfanget af den indledende inaktivering var meget højere i chaperonen mutantstamme (26% aktivitet i WT og 11% i hsp104Δ) antyder, at Hsp104 kan tjene en beskyttende rolle forspænding, eller hurtigt associerede med denaturering FFL-GFP under varmeinaktiveringshastigheden trin at reducere tab af enzymaktivitet.
Befolkning mikroskopi bekræftede den enzymatiske aktivitet assay. Næsten alle celler i hsp104D mutant strai mindst bevares én FFL-GFP aggregat i forhold til antallet af aggregater i WT stamme, der faldt med 62% inden for 90 min efter varmechok (figur 3). Mens et stort antal aggregater dannet umiddelbart efter varmechok i begge stammer, antallet af WT celler indeholdende aggregater faldt hurtigt mens hsp104Δ celler undladt at rydde observerbare puncta. Disse data bekræfter den aktivitet, assay, der viste en 52% genvinding af aktivitet i WT versus en minimal 8% opsving i hsp104Δ stamme.
Enkelt celle automatiseret mikroskopi afslørede, at i WT celler versus hsp104Δ stammen blev FFL-GFP opløst ved en højere sats (repræsentative stillbilleder er vist i figur 4, se supplerende film time-lapse serie af FFL-GFP re-solubilisering). Desuden var dynamikken i proteinaggregater meget forskellige, og i de WT celler aggregater tendens til at smelte være derfor bliver opløst, og dette blev ikke observeret i de hsp104Δ stamme. Denne analyse understøtter ikke kun resultaterne fra de to andre metoder, men afslører også indsigt i en mulig mekanisme for, hvordan den aggregerede protein opløses og genfoldes.
Figur 1. Skematisk af FFL-GFP varmechok-genvinding assay. FFL-GFP-ekspression induceres i logaritmisk fase i celler, der er blevet inkuberet i SC-URA. At inducere cellerne inkuberes i SC-URA-MET i 1 time. Centrifuge celler og resuspender i SC-URA indeholdende 100 mg / ml cycloheximid (CHX). For varmechok, inkuberes cellerne ved 42 ° C i 25 min. Tillad celler til at inddrive ved inkubation ved 30 ° C. Saml prøver til en 90 min tidsforløb. For enzymatiske assays D-luciferin tilsættes før hver aflæsning.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se større figur.
Figur 2. FFL-GFP enzymatiske refoldning / recovery assay. Prøver af WT og hsp104Δ celler (100 ul) blev opsamlet forud for varmechok og umiddelbart efter varmechok for hvert tidspunkt (0, 30, 60, og 90 min). Tre gentagelser af hver prøve blev alikvoteret i brønde i en 96-brønds hvid plade for hvert tidspunkt. For aflæsninger blev pladen læseren indstilles til at måle luminescens hver 30 min i 90 min ved 30 ° C.
<br /> Figur 3.. FFL-GFP genfoldning mikroskopi. 1 ml celler på hvert tidspunkt (præ-HS, 0, 30, 60, og 90 min) blev opsamlet og centrifugeret. Supernatant blev aspireret, og cellerne blev resuspenderet i 2 pi vand. Celler blev fremstillet ved blanding med 2 pi af lavtsmeltende agarose. Celler blev visualiseret ved hjælp af 100X olieobjektiv. Repræsentative billeder af hvert tidspunkt er vist. Kvantificering blev udført ved at tælle celler i 4-5 felter og beregne procent af celler, der indeholder aggregater (n ~ 100).
Figur 4.. Enkelt celle genfoldning mikroskopi tidsforløbet af FFL-GFP. Post varmechok 5 ml celler blev opsamlet, centrifugeret og resuspenderet i 20 ul Hedeselskabet 2 O. 4 pi celler blev anbragt på en 5 mm 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel modelprotein FFL-GFP blev brugt til at vise, at gæren disaggregase, Hsp104 bidrager til protein re-solubilisering og reparation. De enzymatiske assays og mikroskopi differentielt forhørt status samme substratproteinet at bestemme refoldning effektivitet og udbytte. Resultaterne af de enzymatiske opsving assays tyder på, at ikke blot er den maksimale opsving i hsp104D mutantstamme ineffektiv, men den oprindelige størrelse udfoldelsen stress var større i mutantstammen (figur 2). Analysen viser også, at mens hsp104D celler syntes at være at forsøge reparation, de var ude af stand til at genfolde proteinet så hurtigt som WT celler. Denne metode tillod følsom og kvantitativ analyse af FFL-GFP-aktivitet afslører den væsentlige rolle, Hsp104 i reparation af dette protein.
Mikroskopi resultater antyder, at årsagen til den ineffektive reparation af denatureret FFL enzym skyldes to protein fældefangst inden aggregater. Befolkningen analyse viste, at i celler, der mangler Hsp104, kunne ingen celler helt klare alle de aggregater i 90 minutter (Figur 3). Desuden afslørede de encellede analyser, aggregater sikring over tid, hvilket tyder på, at konsolideringen af mindre aggregater i større strukturer kan hjælpe reparation og refoldningen proces (Figur 4). Selv om dette resultat ikke er indlysende fra stillbilleder, time-lapse film tillader en at følge den dynamiske opførsel af uafhængige aggregater. Observation af aggregater i hele tidsforløbet afdækket nedsat samlet fusion i hsp104Δ stamme, hvilket indikerer, at disse celler ikke danne større strukturer så effektivt og tyder på, at Hsp104 er påkrævet for denne facet af protein kvalitetskontrol. En yderligere spekulationer er, at cellerne kan opløse protein hurtigere fra disse større aggregater, som yderligere kan indeholde opdeling og reparation machinery. Encellede mikroskopi kan også bruges til at afgøre, om andre chaperoner og co-chaperoner er til stede i de større versus mindre aggregater, og hvis dette ophold mønster varierer over tid.
Sammen disse metoder give både biokemiske og cellebiologiske analyser af Proteingenfoldningstrin og reparation i levende celler. Integration af resultaterne fra de tre metoder beskrevet giver multi-dimensional indsigt i kinetik og effektivitet af cellulære bedring efter proteotoxic varme-shock. Automatisering af alle eller nogle af trinene i Protokollen giver også mulighed for større stikprøvestørrelser og biologiske replikater i en given eksperiment, øge robustheden og den ultimative tillid til resultatet. Derudover teoretisk disse metoder kan udvides til brug i humane celler og ikke kun for genetiske analyser, men også at undersøge kemikalier, der ændrer proteostasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health (NIGMS-074.696) til KAM og en American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship til JLA Vi takker også John Glover på University of Toronto for at give FFL -GFP kilde plasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L.
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
