Summary
Denne artikkelen beskriver bruken av et ildflue luciferase-GFP fusjonsprotein for å undersøke
Abstract
Proteostasis, definert som de samlede prosesser av protein folding / biogenesis, er refolding / reparasjon, og fornedrelse, en delikat mobilnettet balanse som må opprettholdes for å unngå skadelige konsekvenser en. Eksterne eller interne faktorer som forstyrrer denne balansen kan føre til protein aggregering, giftighet og celledød. Hos mennesker er dette en viktig medvirkende faktor til symptomer assosiert med nevrodegenerative sykdommer slik som Huntingtons, Parkinsons, og Alzheimers sykdom 10. Det er derfor essensielt at proteinene som er involvert i opprettholdelse av proteostasis bli identifisert for å utvikle behandlinger for disse ødeleggende sykdommer. Denne artikkelen beskriver teknikker for overvåking in vivo protein folding på nær sanntid oppløsning ved hjelp av modellen protein ildflue luciferase smeltet til grønt fluorescerende protein (FFL-GFP). FFL-GFP er en unik modell kimært protein som FFL-delen er ekstremt følsomme for stress-indusert misfolding og aggregering, som inaktiverer enzymet 12. Luciferase aktivitet blir overvåket ved hjelp av en enzymatisk assay, og GFP-delen tilveiebringer en metode for visualisering av løselige eller aggregert ferdig gulv ved hjelp av mikroskopi. Disse koblede metoder innlemme to parallelle og teknisk uavhengige tilnærminger til å analysere både refolding og funksjonell reaktivering av et enzym etter stress. Aktivitet utvinning kan være direkte korrelert med kinetikk disaggregation og re-solubilisering å bedre forstå hvordan protein kvalitetskontroll faktorer som protein anstand samarbeide for å utføre disse funksjonene. I tillegg kan genet delesjoner eller mutasjoner brukes til å teste bidrag av spesifikke proteiner eller protein subenheter være denne prosessen. I denne artikkelen undersøker vi de bidragene av protein disaggregase 13 Hsp104, kjent for å samarbeide med Hsp40/70/nucleotide utveksling faktor (NEF) refolding system 5, til protein refolding å validere denne tilnærmingen.
Introduction
Hos mennesker neurodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdommer har vært knyttet til protein misfolding og aggregering 10.. Celler benytter molekylære anstand for å hindre kinetisk fangst av cellulære proteiner til misfolded inaktive strukturer seks. Anstand delta i intrikate interaksjon nettverk i cellen, men det er ikke helt forstått hvordan summen av disse interaksjonene bidrar til organismebiologi proteostasis. En av de viktigste anstand ansvarlig for flertallet av cytosolprotein folding er 70 kD heat shock protein (Hsp70) familie 19. Det har vist seg at i gjær tap av hsp70 avtar evnen til å kaste begynnende heterologt uttrykt FFL og refold den endogene protein, ornitin transcarbamoylase, i 18 vivo, 7. Evnen til å analysere folding med nær sanntid oppløsning vil lette forståelsen av hvordan ekstra cellulære faktorer fortsribute til denne Hsp70-avhengig prosess. I tillegg kan folding / refolding reaksjonene ikke være helt avhengig av at disse bidrar proteiner, så assay skal være følsom nok til å detektere både store og små endringer i kinetikk og effektivitet.
Gjærcellen disaggregase, Hsp104, spiller en viktig rolle i å reparere aggregerte misfolded proteiner. Selv Hsp104 homologene har blitt identifisert i sopp og planter, synes denne familien til å være fraværende i metazoans. Det har vært foreslått at andre anstand som de av Hsp110 familien utføre noen av de kjente Hsp104 aktiviteter i pattedyr 16. Hsp104 er en AAA +, heksamere protein kompleks som fungerer i gjær til oppussing protein aggregater, som bidrar til refolding og reparasjon 13. Hsp104, sammen med gjær Hsp70, Ssa1, og gjær-Hsp40, Ydj1, er nødvendig for gjenvinning av denaturert OFF i gjærceller 5, 8. Den lille varmesjokkprotein, Hsp26, har også vist seg å være krav som stillesred for Hsp104-mediert disaggregation av FFL to.
OFF er en to-domene protein som binder substratet luciferin i det aktive sete, og etter en konformasjonsendring som krever ATP og oksygen, decarboxylates substratet slippe oxyluciferin, karbondioksyd (CO 2), adenosin-monofosfat (AMP), og lys 11, 9, 3. Den kommersielt tilgjengelige FFL underlaget, D-luciferin, resulterer i lys utslipp mellom 550-570 nm som kan oppdages ved hjelp av en luminometer 15. FFL er utsøkt sensitive til denaturering fra kjemiske eller varme behandlinger og aggregater raskt ved utfoldelse. Når de utsettes for temperaturer mellom 39-45 ° C FFL er reversibelt utfoldet og inaktivert 12. I kontrast, GFP og dets derivater er meget motstandsdyktig mot protein utfolding påkjenninger 14. Derfor fusjon av disse to proteinene gjør FFL å fungere som et eksperimentelt labile delen stand til å sikte funksjonell GFP til intracellulær forekomster som kan visualiseres ved hjelp av fluorescens mikroskopi på både befolkningen og encellede nivåer. Anvendelse av den enzymatiske analyse i en semi-automatisert multimodusfiber plateavleseren kombinert med automatisert enestående mikroskopi tillater simultan evaluering av kinetikk og et utbytte på refolding reaksjoner. I tillegg gir de lettvinte molekylær genetikk av modellen eukaryote Saccharomyces cerevisiae både presis manipulering av protein kvalitetskontroll nettverk og mulighet for oppdagelsen tilnærminger for å identifisere nye spillere som bidrar til mobilnettet stressrespons og proteostasis.
I denne studien, vill type (WT) og HSP104 sletting stammer som uttrykker FFL-GFP er underlagt protein denaturering heat shock. FFL-GFP refolding følges opp gjennom både en enzymatisk analyse og mikroskopi som en proxy avlesning for reparasjon av uttrykte proteomet over en restitusjonstid kurset. Sammenlignet med WT celler, viser vi the Hsp104 sletting belastningen er ~ 60% mindre effektiv ved refolding FFL-GFP, støtter tidligere funn etablere en rolle for Hsp104 i reaktivering av denaturert FFL to.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Bygging av påkjenningen som inneholder FFL-GFP Plasmid
For denne studien, ble Saccharomyces cerevisiae stamme BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) som brukes sammen med en HSP104 sletting belastning fra gjær knockout samling (Åpen Biosystems / Thermo Scientific). Slettingen ble bekreftet ved hjelp av en Hsp104-spesifikt antistoff for Western blot analyse.
FFL-GFP ble uttrykt fra p426MET25-FFL-GFP, konstruert fra en LEU2-basert kilde plasmid hentet fra Glover laboratorium ved University of Toronto 17 og oppnåelig ved forespørsel til forfatterne. Uttrykk for FFL-GFP plasmid fusion protein styres av MET25 metionin-repressible promoter. Plasmidet ble forvandlet til hver stamme ved hjelp av en protokoll ble tilpasset fra Gietz et. al, 1995:
- Sentrifuger 25 ml o f log fase celler i en 50 ml konisk tube på 4400 rpm i 2 min, vask med 500 mL av dobbelt destillert H 2 0 (DDH 2 O), og kast supernatanten.
- Resuspender celler i 250/il TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M litium-acetat). Inkuber ved 30 ° C uten å blandes i 20 min.
- Overfør 50 pl kompetente celler i et nytt rør sammen med 5 ml (50 pg) av bærer-DNA og 5 pl (0,1-5 pg) av plasmid-DNA. Tilsett 300 pl av PEG / TE / LiAc (samme som TE / LiAc pluss 40% polyetylenglykol) til denne blanding, og inkuberes cellene ved 30 ° C i ytterligere 30 min.
- Legg 1/10 volum (v / v) DMSO (36 ul) til denne blanding, og varme sjokk ved 42 ° C i 6 min.
- Sentrifuger blandingen ved 6000 rpm i 30 sek og fjern supernatanten. Resuspender celler i 100 mL av sterile DDH 2 0 og plate celler bort på syntetiske komplett media mangler uracil (SC-URA).
2. Induksjon av FFL-GFP
nt "> FFL-GFP er indusert når cellene er i log fase slik at flertallet av proteinet før varme-sjokk er nylig gjort for å unngå proteiner som har terminalt aggregeres over tid på grunn av aldring-tilknyttede mobilnettet utilstrekkelighet.- Dag 1: Inkuber cellene i 5 ml SC-URA ved 30 ° C roterende O / N.
- Dag 2: Mål OD 600 og vaksinere friske kulturer i 5 ml SC-URA OD 600 ~ 0,2.
- Inkuber kulturer med rotasjon ved 30 ° C før de når log fase OD 600 ~ 0,8-1,0.
- Sentrifuger cellene i 15 ml koniske rør på 4400 rpm i 3 min, dekanter supernatanten og resuspender cellen pellet i 500 mL av DDH 2 0; overføring løsning til en mikrosentrifuge tube.
- Sentrifuger ved 6000 rpm og kast supernatanten.
- Resuspender celler i 5 ml SC-URA-MET. Celler bør inkuberes roterer i dette mediet i 1 time ved 30 ° C.
- Sentrifuger cellene og gjenta vask i DDH 2 0 og kast supernatanten.
- Resuspend celler i 5 ml SC-ura medier som inneholder 100 mikrogram / ml cycloheximide å hemme protein uttrykk, og fortsette umiddelbart til trinn tre.
3. Enzymatisk FFL-GFP Recovery analysen
Denne analysen er en kvantitativ metode for å bestemme nivåene av aktivt enzym i en populasjon.
- Forberedelse for denne analysen:
- Mål OD 600 for hver prøve.
- Forbered nødvendige mengden av D-luciferin nødvendig på grunnlag av antallet av prøver og ønsket antall replikater pluss ca 1.200 mL for slangen. Endelig konsentrasjon av D-luciferin er ~ 23 pg pr 100 ul av celler. I første omgang at det oppløses i vann ved en stamløsning konsentrasjon på 7,5 mg / ml og fortynnet til 455 ug / ml i SC før eksperimentet. I figur 2, tre replikater for hver prøve ble analysert som resulterer i totalt 2,4 ml av D-luciferin som brukes.
- Program plateavleser for flash luminescence analysen (tilpasset fra BioTek Gen5 "Luminescens Flash Assay med Injection", for andre instrumenter følg produsentens anvisninger)
- Sett temperaturen til 30 ° C
- Sett plateavleseren å legge D-luciferin, riste, og lese hver brønn individuelt.
- Les luminescens (endepunkt lesing, 5 sek integrering tid, 180 følsomhet nivå)
- For utvinning analysen mellom hver avlesning shake for 5 min, forsinkelse 20 min, og rist ytterligere 5 min.
- Tilsett 50 pl av D-luciferin fra en injektor.
- Forvarme-sjokk luminescence måles umiddelbart etter celler er lagt til medier som inneholder cycloheximide å stanse proteinsyntesen.
- Overfør 100 ul celler til hver prøve med ønsket antall replikater til en fast hvit plate med 96 brønner.
- Kontroller bør omfatte en vann blank og celler som inneholder en tom vektor.
- Start read med specifications nevnt ovenfor.
- Å denature FFL-delen av FFL-GFP, ruge på 5 ml kultur i et glass kultur rør ved 42 ° C risting i 25 min.
- Recovery assay luminescens opplesninger starte umiddelbart etter celler fjernes fra inkubatoren, som er tidspunktet null. Mål luminescens samme som beskrevet ovenfor for første gang punkt og hvert 30 min i 90 min.
- Normalisere prøver å forvarme-sjokk luminescens verdier som har blitt justert basert på OD 600 (dele forvarme-sjokk verdier ved OD 600).
4. Fluorescensmikroskopi
Denne analysen er en semi-kvantitativ metode for å bestemme oppløsning av aggregatene over tid i en populasjon av celler.
- Induksjon er den samme som beskrevet i kapittel 2, punkt 1-8 av protokoller.
- Samtidig punktene er tatt slik som beskrevet ovenfor (avsnitt 3, trinn 4), men for mikrofonenroscopy samle en ml av celler på forvarme-sjokk og hver utvinning tid punkt, og Inkuber prøver roterende ved 30 ° C i kultur tube.
- Visualisering:
- Sentrifuge med 1 ml av cellene ved 6000 rpm i 30 sekunder og fjerne supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 2 mL av DDH 2 O.
- Bland 2 mL av celler pluss 2 pl 2% lavt smeltepunkt agarose på lysbildet og legge et dekke slip. For å oppnå et enkelt plan av celler trykk lett finger ned i midten av dekkglass, og drei til dekkglass er vanskelig å bevege.
- Celler er visualisert ved hjelp 100X olje mål på fluorescerende mikroskop, bruke DIC å visualisere celler og FITC filter for å visualisere GFP fluorescens.
- Ta flere bilder for hver stamme på hvert tidspunkt for kvantifisering. Felt for bilder bør inneholde ~ 15-30 celler for kvantitativ post-eksperimentell analyse.
- For å beregne prosentandel av celler som inneholder tilslag, teller 50-100 Celler totalt og dele antall celler som inneholder tilslag.
5. Enkelt Cell Mikroskopi
Denne metoden er benyttet for å følge oppløseliggjøring av de enkelte aggregater i en enkelt celle over tid.
- Indusere FFL-GFP uttrykk som beskrevet i kapittel 2, punkt 1-8.
- Etter varme-sjokk, sentrifuger cellene i 15 ml koniske rør ved 4400 rpm i 2 min.
- Vask cellene med 500 mL av vann og resuspender i 20fil DDH 2 O.
- For hver stamme, skjære ut et 5x5 mm seksjon av en SC-URA agarplate og ved hjelp av den overflate som var i kontakt med petriskål, 4 pipette ul celler og spredt rundt overflaten av agaren med pipettespissen. La stå for ~ 1 min.
- Bruk pinsett til å plassere agar kube seksjon med forsiden ned på en ~ 55 mm glassbunn fatet nr 0 og trykk lett ned.
- Visualisering:
- Se i-iii i Section fire.
- Set koordinater for 2-4 knutepunkter for hver stamme avhengig av tetthet av kultur.
- Sett kameraet til å ta bilder med en Z-stack med passende område (- / + 15 mikrometer med 0,5-1,0 mikrometer skivetykkelse) hvert 5 min for en 90 min periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjær er avhengig av disaggregase, til Hsp104 effektivt refold varme-denaturerte proteiner. Aktiviteten av OFF-GFP ble målt etter en 25 min varmesjokk, ved hjelp av en flash-luminescens analyse figur 1. Resultatene av denne analysen automatiserte vist i figur 2 vist en trinnvis økning i aktivitet over 90 min som til slutt førte til en> 80% utvinning i WT-celler. Den hsp104Δ belastningen gjenvinnes 19% av den opprinnelige aktivitet over samme tidsperiode. Dessuten var omfanget av første inaktivering mye høyere i anstand mutant belastningen (26% aktivitet i WT og 11% i hsp104Δ) som tyder på at Hsp104 kan tjene en beskyttende rolle pre-stress, eller raskt forbinder med denaturing FFL-GFP under termisk inaktivering trinn for å redusere tap av enzymaktivitet.
Befolkning mikroskopi bekreftet den enzymatiske aktiviteten analysen. Nesten alle cellene i hsp104D mutant strai opprettholdes minst en ffl-GFP aggregat i forhold til antallet av aggregater i WT-stamme som ble redusert med 62% i løpet av 90 min etter varme-sjokk (figur 3). Selv om et betydelig antall aggregater dannet umiddelbart etter varme-sjokk i begge stammer, redusert antall WT celler inneholdende tilslag raskt mens hsp104Δ celler kan ikke fjerne den observerbare puncta. Disse dataene underbygge aktiviteten analysen, som viste en 52% gjenvinning av aktivitet i WT versus en minimal 8% oppgang i hsp104Δ belastning.
Enkelt celle automatisert mikroskopi avslørte at i WT celler versus hsp104Δ belastningen ble FFL-GFP oppløseliggjøres på en høyere rente (representative stillbilder er vist i figur 4, se supplerende filmer for time-lapse serie av FFL-GFP re-oppløseliggjøringen). I tillegg var dynamikken i protein aggregater svært forskjellige, i WT celler tilslag tendens til å smelte være derfor blir oppløst, og dette ble ikke observert i hsp104Δ belastning. Denne analysen støtter ikke bare resultatene fra de to andre metodene, men avslører også innblikk i en mulig mekanisme for hvordan den samlede protein er oppløst og refolded.
Figur 1. Skjematisk av FFL-GFP varme-sjokk utvinning analysen. FFL-GFP uttrykk er indusert i log fase i celler som har blitt ruges i SC-URA. Å indusere celler inkuberes i SC-URA-MET for 1 hr. Sentrifuger cellene og resuspender i SC-URA inneholder 100 mikrogram / ml cycloheximide (CHX). For varme-sjokk, inkubere cellene ved 42 ° C i 25 min. Tillate cellene å utvinne ved inkubering ved 30 ° C. Samle inn prøver for en 90 min tid selvfølgelig. For enzymatiske analyser D-luciferin legges før hver avlesning.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. OFF-GFP enzymatiske refolding / recovery analysen. Prøver av WT og hsp104Δ celler (100 ul) ble samlet før varmesjokk og umiddelbart etter varme-støt for hvert tidspunkt (0, 30, 60 og 90 min). Tre replikater av hver prøve ble alikvotert inn i brønnene til en 96-brønns hvit plate for hvert tidspunkt. For målingene ble plateavleseren satt til å måle luminescens hvert 30 min i 90 min ved 30 ° C.
<br /> Figur 3. OFF-GFP refolding mikroskopi. 1 ml celler ved hvert tidspunkt (pre-HS, 0, 30, 60 og 90 min) ble samlet og sentrifugert. Supernatanten ble aspirert og cellene ble resuspendert i 2 mL vann. Celler ble fremstilt ved å blande med 2 mL av lavt smeltepunkt agarose. Celler ble visualisert ved hjelp av 100X olje målet. Representative bilder av hvert tidspunkt er vist. Kvantitering ble utført ved å telle cellene i 4-5 felt og beregning av prosent av celler som inneholder aggregater (n ~ 100).
Figur 4. Enkelt celle refolding mikroskopi tiden løpet av FFL-GFP. Post varme-sjokk 5 ml av celler ble samlet, sentrifugert og resuspendert i 20 mL av DDH 2 O. 4 pl av celler ble plassert på en 5 mm 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen modellen protein FFL-GFP ble brukt til å vise at gjær disaggregase, bidrar Hsp104 til protein re-solubilisering og reparasjon. Den enzymatiske assayer og mikroskopi differensielt avlest status for den samme substrat protein for å bestemme effektiviteten av utbyttet refolding. Resultater av de enzymatiske assayer utvinning tyder på at ikke bare er den maksimale bedring i hsp104D mutantstammen ineffektiv, men den opprinnelige størrelsen av den etterfølgende belastning var større i den mutante stamme (figur 2). Analysen viser også at mens hsp104D celler syntes å være forsøk på reparasjon, klarte de ikke å refold protein så raskt som WT celler. Denne metoden tillatt følsom og kvantitativ analyse av FFL-GFP aktivitet avslører den avgjørende rollen Hsp104 i reparasjon av dette proteinet.
Mikroskopi resultater tyder på at årsaken til den ineffektive reparasjon av denaturert FFL enzym skyldes to protein fangst innen tilslag. Befolkningen analyse viste at i cellene mangler Hsp104, kunne ingen celler helt fjerne alle aggregatene i 90 min (figur 3). I tillegg avdekket de encellede analyser som tilslag sikring over tid, noe som tyder på at konsolidering av mindre aggregater i større strukturer kan hjelpe reparasjon og refolding prosess (figur 4). Selv om dette resultatet er ikke opplagt fra stillbildene, time-lapse filmer tillater en å følge den dynamiske oppførselen til uavhengige aggregater. Observasjon av aggregatene over tidsforløp ble avdekket redusert samlet sammensmeltingen på hsp104Δ stammen, noe som indikerer at disse cellene ikke danner de større strukturer som effektivt og som tyder på at Hsp104 er nødvendig for denne fasett av proteinet kvalitetskontroll. En ytterligere spekulasjon er at cellene kan solubilisere proteinet seg raskere fra disse større aggregater, som i tillegg kan inneholde den oppsplitting og reparasjon machinery. Encellet mikroskopi kan også brukes for å bestemme om andre anstand og co-anstand er til stede i de større versus mindre aggregater, og hvis dette bosted mønsteret varierer over tid.
Sammen disse metodene tillate både biokjemiske og celle biologisk analyse av protein refolding og reparasjon i levende celler. Integrering av resultatene fra de tre metodene som er beskrevet gir multi-dimensjonale innsikt i kinetikk og effektivitet av mobilnettet utvinning etter proteotoxic varme-sjokk. Automatisering av noen eller alle trinnene i protokollen åpner også for større utvalgsstørrelser og biologiske replikerer i et gitt eksperiment, øke robustheten og ultimate tillit i utfallet. I tillegg er disse metoder teoretisk kan utvides til bruk i humane celler og ikke bare for genetisk analyse, men også for å undersøke kjemikalier som endrer proteostasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIGMS-074696) til KAM og American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship til JLA Vi takker også John Glover ved University of Toronto for å gi FFL -GFP kilde plasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L.
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
