Summary
Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para investigar
Abstract
Proteostase, definidos como os processos combinados de proteína de dobragem / biogénese, redobragem / reparação e degradação, é um equilíbrio celular delicada que deve ser mantida para evitar consequências deletérias 1. Fatores externos ou internos que perturbam esse equilíbrio pode levar a agregação de proteínas, toxicidade e morte celular. Nos humanos este é um factor que contribui para os sintomas associados com doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Huntington, doença de Parkinson, e doença de Alzheimer 10. Por conseguinte, é essencial que as proteínas envolvidas na manutenção da Proteostase ser identificados a fim de desenvolver tratamentos para estas doenças debilitantes. Este artigo descreve as técnicas para monitoramento de enovelamento de proteínas vivo na resolução de tempo quase real, utilizando o modelo de proteína firefly luciferase fundida a proteína verde fluorescente (GFP-FFL). FFL-GFP é um modelo de proteína quimérica única como o radical FFL é extremamente sensível ao stress induzido misfolding e agregação, que inactiva a enzima 12. A actividade da luciferase é monitorizada usando um ensaio enzimático, e a porção da GFP fornece um método de visualização FFL solúvel ou agregado usando microscopia automatizado. Estes métodos juntamente incorporar duas abordagens paralelas e tecnicamente independente para analisar tanto refolding e reativação funcional de uma enzima após o estresse. Recuperação da atividade pode ser diretamente correlacionada com a cinética de desagregação e re-solubilização para entender melhor como fatores de controle de qualidade de proteína, como chaperones proteína colaborar para executar essas funções. Além disso, as deleções ou mutações de genes podem ser usadas para testar as contribuições de proteínas específicas ou subunidades proteicas para este processo. Neste artigo, vamos examinar as contribuições da proteína disaggregase Hsp104 13, conhecida com a parceria com o fator de troca Hsp40/70/nucleotide (NEF) redobrando sistema 5, a proteína refolding para validar esta abordagem.
Introduction
Nos seres humanos, incluindo distúrbios neurodegenerativos doença de Alzheimer e de Parkinson, e doença de Huntington tem sido associada ao enrolamento incorrecto e agregação das proteínas 10. Células empregar chaperones moleculares para evitar armadilhas cinética de proteínas celulares em estruturas inativas deformadas 6. As chaperonas participar em redes de interacção intrincados dentro da célula, mas não está completamente compreendido como a soma destas interacções contribui para Proteostase organismos. Uma das principais chaperonas responsáveis pela maioria da dobragem de proteína citosólica é a 70 kD da proteína de choque térmico (Hsp 70) 19 família. Tem sido demonstrado que a perda de levedura de Hsp70 diminui a capacidade de dobrar nascente FFL heterologamente expressos e redobrar a proteína endógena, ornitina transcarbamilase, in vivo, 18, 7. A capacidade de analisar dobrável com resolução de tempo quase real irá facilitar a compreensão de como fatores de celular cont adicionalribute para este processo de Hsp70-dependente. Além disso, dobrando / redobrando reações podem não ser completamente dependente destas proteínas contribuem, de modo ensaios deve ser sensível o suficiente para detectar pequenas e grandes mudanças na cinética e eficiência.
O disaggregase célula de levedura, Hsp104, desempenha um papel vital na reparação de proteínas deformadas agregados. Embora Hsp104 homólogos foram identificados em fungos e plantas, esta família parece estar ausente no metazoários. Tem sido proposto que outras chaperonas como os da família Hsp110 executar algumas das actividades conhecidas Hsp104 em mamíferos 16. Hsp104 é um +, complexo de proteínas hexamérica AAA que funciona em levedura para agregados de proteína remodelar, contribuindo para refolding e reparação 13. Hsp104, juntamente com a levedura de Hsp70, SSA1, ea levedura Hsp40, Ydj1, é necessária para a recuperação de FFL desnaturado em células de levedura 5, 8. A pequena proteína de choque térmico, Hsp26, também tem sido demonstrado ser requivermelho para a desagregação Hsp104 mediada por FFL 2.
FFL é uma proteína de duas domínio que se liga ao substrato luciferina no local activo e sequência de uma alteração conformacional que requer ATP e de oxigénio, o substrato libertando decarboxylates oxiluciferina, o dióxido de carbono (CO 2), monofosfato de adenosina (AMP), e luz 11, 9, 3. O substrato comercialmente disponível FFL, D-luciferina, resulta em emissão de luz entre 550-570 nm, que podem ser detectadas usando um luminómetro 15. FFL é extremamente sensível à desnaturação de tratamentos e agregados rapidamente químicas ou calor em cima de desdobramento. Quando exposto a temperaturas entre 39-45 ° C FFL é reversível desdobrado e inativada 12. Em contraste, a GFP e seus derivados são altamente resistentes à proteína desdobramento tensões 14. Portanto fusão destas duas proteínas permite FFL para funcionar como uma unidade experimentalmente lábil capaz de atingir funcional LPF para depósitos intracelulares que podem ser visualizados por microscopia de fluorescência, tanto a população e os níveis de células individuais. Aplicação do ensaio enzimático num leitor de placas multimodo semi-automatizada juntamente com microscopia automatizada permite a avaliação simultânea sem precedentes de cinética e rendimento de reacções de redobramento. Além disso, a genética molecular fácil do modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto a manipulação precisa da rede de controlo de qualidade de proteínas e a oportunidade para que as abordagens baseadas em descoberta para identificar novos jogadores contribuem para a resposta ao stress celular e Proteostase.
Neste estudo, os de tipo selvagem (WT) e Hsp104 supressão estirpes que expressam FFL-GFP estão sujeitas a desnaturação da proteína de choque térmico. FFL-GFP refolding é monitorado através de um ensaio de enzimática e microscopia como uma leitura proxy para reparação do proteoma expresso ao longo de um curso de tempo de recuperação. Quando comparadas com as células WT, vamos mostrar ºe Hsp104 tensão eliminação é de aproximadamente 60% menos eficiente na redobrando FFL-GFP, apoiando resultados anteriores estabelecer um papel para Hsp104 na reativação da desnaturado FFL 2.
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Protocol
1. Construção de variantes que contêm FFL-GFP plasmídeo
Para este estudo, Saccharomyces cerevisiae BY4741 tensão (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) foi utilizado juntamente com uma cepa de exclusão Hsp104 da coleção nocaute levedura (Abrir Biosystems / Thermo Scientific). A deleção foi confirmado utilizando um anticorpo específico de Hsp104 para análise de Western blot.
FFL-GFP foi expresso a partir de p426MET25-FFL-GFP, construído a partir de uma fonte baseada em plasmídeo LEU2 obtido a partir do laboratório de Glover na Universidade de Toronto, 17 e que se obteria com os autores do pedido. A expressão da proteína GFP-FFL plasmídeo de fusão é controlada pelo promotor MET25 metionina-reprimível. O plasmídeo foi transformado em cada cepa usando um protocolo foi adaptado do Gietz et. al, 1995:
- Centrifugar 25 ml o f as células em fase log em um tubo de 50 ml a 4400 rpm durante 2 min, lava-se com 500 ul de duplo H 2 0 destilada (ddH2O), e descartar sobrenadante.
- Ressuspender as células em 250 ul de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, 0,1 M de acetato de lítio). Incubar a 30 ° C sem mistura durante 20 min.
- Transferir 50 uL de células competentes para um novo tubo, juntamente com 5 mL (50 ug) de ADN transportador e 5 ul (0,1-5 ug) do ADN do plasmídeo. Adicionar 300 uL de PEG / TE / LiAc (o mesmo que TE / LiAc acrescido de 40% de polietilenoglicol) a esta mistura, e as células a incubar a 30 ° C por mais 30 min.
- Adicione 1/10 de volume (v / v) de DMSO (36 mL) a esta mistura e choque térmico a 42 ° C durante 6 min.
- Centrifugar mistura a 6.000 rpm por 30 segundos e remove sobrenadante. Ressuspender as células em 100 ul de ddH 2 0 e células de chapa estéreis em meio sintético completo sem uracilo (SC-ura).
2. Indução de FFL-GFP
nt "> FFL-GFP é induzida uma vez que as células estão na fase de log para a maioria da proteína antes de choque térmico foi recentemente feito para evitar que as proteínas agregadas terminais ao longo do tempo devido a deficiências associadas com o envelhecimento celular.- Dia 1: Incubar as células em 5 ml de SC-ura a 30 ° C rotativa S / N.
- Dia 2: Medida de DO600 e inocular culturas frescas em 5 ml de SC-URA 600 ~ 0,2 OD.
- Incubar as culturas com rotação a 30 ° C até atingirem a fase de log de 0,8-1,0 OD 600 ~.
- Centrifugar as células em tubos cónicos de 15 ml a 4400 rpm, durante 3 min, decanta sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 500 ul de ddH 2 0; solução de transferência para um tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar a 6.000 rpm e descartar sobrenadante.
- Ressuspender as células em 5 ml de SC-URA-MET. As células devem ser incubadas rotativo neste meio durante 1 hora a 30 ° C.
- Células centrífuga e lavagem de repetição em DDH 2 0 e descartar sobrenadante.
- Resuspecélulas ª em 5 ml de mídia SC-Ura contendo 100 mg / ml de cicloheximida para inibir a expressão de proteínas e prosseguir imediatamente para a Etapa 3.
3. Enzimática FFL-GFP Ensaio de recuperação
Este ensaio é um método quantitativo para determinar os níveis de enzima activa numa população.
- Preparação para este ensaio:
- Medir DO600 para cada amostra.
- Preparar a quantidade necessária de D-luciferina necessário, com base no número de amostras e do número de repetições, mais cerca de 1200 ul de tubagem desejado. A concentração final de D-luciferina é de ~ 23 ug por 100 ul de células. Inicialmente, é dissolvido em água a uma concentração de solução de estoque de 7,5 mg / ml e diluído para 455 ug / ml em SC antes da experiência. Na Figura 2, três réplicas para cada amostra foram analisadas resultou num total de 2,4 ml de D-luciferina sendo usado.
- Programa leitor de placa para o flash lumiensaio nescence (adaptado de BioTek Gen5 "luminescência Ensaio do Flash com Injection", para outros instrumentos de seguir as instruções do fabricante)
- Ajustar a temperatura a 30 ° C
- Definir leitor de placas para adicionar D-luciferina, agitar e ler cada poço individualmente.
- Leia luminescência (leitura de endpoint, 5 seg tempo de integração, 180 níveis de sensibilidade)
- Para o ensaio de recuperação entre cada shake de leitura para 5 min, demora 20 min, e agitar um adicional de 5 min.
- Pipetar 50 ul de D-luciferina a partir de um injector.
- Luminescência Pré-aqueça-choque é medido imediatamente após as células são adicionadas ao meio contendo cicloheximida para interromper a síntese de proteínas.
- Transferir 100 uL de células para cada amostra com o número desejado de repetições em uma placa de 96 poços branca sólida.
- Os controlos devem incluir um espaço em branco de água e as células contendo um vetor vazio.
- Inicie a leitura com o SPEcações acima listadas.
- Para desnaturar a porção de FFL FFL-GFP, incubar a 5 ml de cultura num tubo de cultura de vidro a 42 ° C com agitação durante 25 min.
- Recuperação de leituras do ensaio de luminescência começar imediatamente após as células são removidas da incubadora, o que é o ponto de tempo zero. Medida luminescência mesmo como descrito acima para o primeiro ponto de tempo e a cada 30 min durante 90 min.
- Normalizar amostras para pré-aquecer-choque valores de luminescência que foram atualizadas com base na OD 600 (dividir os valores pré-aquecer-choque por OD 600).
4. Microscopia por fluorescência
Este ensaio é um método semi-quantitativo para determinar a solubilização de agregados ao longo do tempo, numa população de células.
- A indução é o mesmo como descrito na secção 2, Passos 1-8 de protocolos.
- Os mesmos pontos de tempo são tomados como descrito acima (secção 3, Passo 4), mas para microscopy recolher 1 ml de células de pré-aquecer-choque e cada ponto de tempo de recuperação e as amostras a incubar em rotação a 30 ° C num tubo de cultura.
- Visualização:
- Centrifugar 1 ml de células a 6.000 rpm por 30 segundos e remove sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em 2 mL de DDH 2 O.
- Misturar 2 pi de células mais 2 mL de 2% de agarose de baixo ponto de fusão sobre a lâmina e adicionar uma lamela de cobertura. De modo a obter um único plano em células pressionar ligeiramente o dedo para baixo no centro da lâmina de cobertura e rodar até que a lâmina de cobertura é difícil de se mover.
- Células são visualizadas usando objectivo óleo 100X em microscópio fluorescente; usam DIC para visualizar as células e o filtro FITC para visualizar fluorescência da GFP.
- Tirar várias fotos para cada estirpe em cada momento para a quantificação. Campos para fotos devem conter ~ 15-30 células para análise pós-experimental quantitativa.
- Para calcular a porcentagem de células que contêm agregados, conte 50Células -100 total e dividir o número de células que contêm agregados.
5. Microscopia de uma única célula
Este método é utilizado para seguir a solubilização de agregados individuais numa única célula ao longo do tempo.
- Induzir a expressão FFL-GFP, conforme descrito na Seção 2, as etapas 1-8.
- Depois de choque térmico, as células de centrífuga de 15 ml em tubo cônico de 4.400 rpm por 2 min.
- Lavar as células com 500 ul de água e ressuspender em 20 ml de ddH 2 O.
- Para cada estirpe, cortar uma secção de uma placa de agar SC-URA 5x5 mm e utilizando a superfície que esteve em contacto com uma placa de Petri, pipeta 4 ul de células e propagação em torno da superfície de agar com pipeta. Deixe repousar por ~ 1 min.
- Use uma pinça para colocar seção cubo agar virado para baixo sobre a ~ 55 milímetros de vidro de fundo prato No. 0 e pressione levemente.
- Visualização:
- Veja i-iii em Sectião 4.
- Definir coordenadas para 2-4 pontos focais para cada cepa, dependendo da densidade da cultura.
- Definir câmera para tirar fotos com um Z-stack com escala apropriada (- / + 15 mm, com uma espessura de corte de 0,5-1,0 mM) a cada 5 min, por um período de 90 min.
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Representative Results
A levedura é dependente da disaggregase, Hsp104 redobrar eficientemente proteínas desnaturadas pelo calor. A atividade de FFL-GFP foi monitorado após um choque de 25 min de calor, através de um ensaio de flash luminescência Figura 1. Os resultados deste ensaio automático mostrado na Figura 2 revelou um aumento progressivo na actividade ao longo de 90 min, que levou a uma recuperação de> 80% em células WT. A tensão hsp104Δ recuperou 19% da atividade original em relação ao mesmo período de tempo. Além disso, a extensão da inactivação inicial era muito maior na estirpe mutante acompanhante (26% de actividade em WT e 11% em hsp104Δ) Hsp104 sugerindo que pode ser um papel de protecção que serve de pré-tensão, ou associa-se rapidamente com a desnaturação FFL-GFP durante o passo de inactivação térmica para reduzir a perda da actividade da enzima.
Microscopia população corroborou o ensaio da atividade enzimática. Quase todas as células do mutante hsp104D stramantida em, pelo menos, um agregado FFL-GFP em comparação com o número de agregados na estirpe WT, que diminuiu em 62% dentro de 90 min após choque térmico (Figura 3). Embora um grande número de agregados formados imediatamente após choque térmico em ambas as estirpes, o número de células contendo agregados de WT diminuiu rapidamente enquanto que as células hsp104Δ falha para limpar os pontos lacrimais observável. Estes dados corroboram o ensaio da atividade, que mostraram uma recuperação de 52% da atividade no WT contra um mínimo de recuperação de 8% em tensão hsp104Δ.
Microscopia automatizado revelou que uma única célula em células WT contra a estirpe hsp104Δ, FFL-GFP foi solubilizado a uma taxa mais elevada (imagens fixas representativos são mostrados na Figura 4, ver filmes suplementares para a série de lapso de tempo de FFL-GFP re-solubilização). Além disso, a dinâmica dos agregados de proteínas eram muito diferentes, em que as células WT agregados tendem a fundir-se tona sendo solubilizado, e isto não foi observado na estirpe hsp104Δ. Este ensaio não só apoia os resultados dos outros dois métodos, mas também revela uma visão de um possível mecanismo de como a proteína agregada é solubilizado e redobrado.
Figura 1. Esquema de FFL-GFP ensaio de recuperação de choque térmico. Expressão FFL-GFP é induzida em fase log em células que foram incubadas em SC-URA. Para induzir as células incubar na SC-URA-TEM para 1 hora. Centrífuga células e ressuspender em SC-ura contendo 100 ug / ml de ciclo-heximida (CHX). Para choque térmico, as células incubar a 42 ° C durante 25 min. Permitir que as células recuperam por incubação a 30 ° C. Coleta de amostras para um curso de tempo de 90 min. Para os ensaios enzimáticos de D-luciferina é adicionado antes de cada leitura.ref = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 2. FFL-GFP amostras enzimáticas refolding / ensaio de recuperação. Dos WT e células hsp104Δ (100 mL) foram coletadas antes do choque térmico e imediatamente após o choque térmico para cada ponto de tempo (0, 30, 60 e 90 min). Três réplicas de cada uma das amostras foram divididas em alíquotas para os poços de uma placa de 96 poços de branco para cada ponto de tempo. Para as leituras, o leitor de placa foi ajustado para medir o luminescência a cada 30 min durante 90 min a 30 ° C.
<Br /> Figura 3. Microscopia redobragem FFL-GFP. De 1 ml de células em cada ponto de tempo (pré-SH, 0, 30, 60 e 90 min) foram recolhidas e centrifugadas. Supernate foi aspirado e as células foram ressuspensas em 2 mL de água. As células foram preparadas por mistura com 2 ml de agarose a baixo ponto de fusão. As células foram visualizadas usando a objectiva de óleo 100X. Imagens representativas de cada ponto de tempo são mostrados. A quantificação foi feita por contagem de células em 4-5 campos e calculando a percentagem de células contendo agregados (n ~ 100).
Figura 4. Única célula redobragem curso de FFL-GFP tempo microscopia. Mensagem de choque térmico de 5 ml de células foram recolhidas, centrifugadas, e ressuspensas em 20 ul de ddH 2 O. 4 ul de células foram colocadas em 2 de 5 mm
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Discussion
Neste artigo, a proteína modelo FFL-GFP foi usado para mostrar que o disaggregase levedura, a proteína Hsp104 contribui para a re-solubilização e reparação. Os ensaios enzimáticos e microscopia diferencialmente interrogado o estado da mesma proteína substrato para determinar a eficiência de redobragem e rendimento. Os resultados dos ensaios enzimáticos sugerem que a recuperação não é só a recuperação máxima na estirpe mutante hsp104D ineficiente, mas o valor inicial da tensão de desdobramento foi maior na estirpe mutante (Figura 2). A análise mostra também que, enquanto as células hsp104D parecia tentar reparação, eles não foram capazes de redobrar a proteína tão rapidamente quanto as células WT. Este método permitiu a análise sensível e quantitativa da actividade de FFL-GFP revelar o papel essencial na reparação de Hsp104 desta proteína.
Microscopia resultados sugerem que a razão para a enzima de reparação ineficiente FFL desnaturado é devido to proteína prendendo dentro de agregados. A análise mostrou que a população de células sem Hsp104, sem células podiam limpar completamente todos os agregados em 90 minutos (Figura 3). Além disso, as análises de células individuais revelou que os agregados de fusível ao longo do tempo, o que sugere que a consolidação de agregados menores nas estruturas maiores podem auxiliar o processo de reparação e redobragem (Figura 4). Embora esse resultado não é óbvio a partir das imagens fixas, filmes de lapso de tempo permitem acompanhar o comportamento dinâmico de agregados independentes. Observação de agregados ao longo do tempo diminuiu descoberto fusão agregado na estirpe hsp104Δ, indicando que estas células não formam estruturas maiores da forma mais eficiente e Hsp104 sugerindo que é necessária para esta faceta de controlo da qualidade da proteína. Um outro Especula-se que as células podem solubilizar a proteína mais rapidamente a partir destes agregados maiores, que podem conter, adicionalmente, a desagregação e reparação machinery. Microscopia de uma única célula, também pode ser usado para determinar se outros co-chaperonas e chaperones estão presentes nos agregados maiores contra menor, e, se este padrão de residência varia no tempo.
Juntos, esses métodos permitem a análise biológica tanto bioquímica e celular de redobramento de proteínas e reparação em células vivas. A integração dos resultados dos três métodos descritos proporciona uma visão multi-dimensional em cinética e eficiência de recuperação celular após proteotoxic de choque de calor. Automatização de alguns ou de todos os passos do protocolo também permite maiores tamanhos de amostras biológicas e repetições numa dada experiência, o aumento da robustez e confiança final no resultado. Além disso, estes métodos podem, teoricamente, ser estendido para usar em células humanas e não só para análises genéticas, mas também para investigar produtos químicos que alteram Proteostase.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIGMS-074696) para KAM e uma Sociedade Americana de Microbiologia Robert D. Watkins Graduate Student Fellowship de Pesquisa de JLA Agradecemos também John Glover, da Universidade de Toronto para a prestação do FFL -GFP plasmídeo fonte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
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