Summary
Questo articolo descrive l'uso di una proteina di fusione GFP-luciferasi lucciola per indagare
Abstract
Proteostasis, definiti come i processi combinati di proteine pieghevole / biogenesi, ripiegamento / riparazione, e il degrado, è un delicato equilibrio cellulare che deve essere mantenuta per evitare conseguenze deleterie 1. Fattori esterni o interni che sconvolgono questo equilibrio può portare ad aggregazione proteica, la tossicità e la morte cellulare. Negli esseri umani questo è un fattore importante che contribuisce ai sintomi associati a patologie neurodegenerative come la corea di Huntington, il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer 10. È pertanto essenziale che le proteine coinvolte nel mantenimento di proteostasis essere identificati per sviluppare trattamenti per queste malattie debilitanti. In questo articolo vengono descritte le tecniche per il monitoraggio in ripiegamento delle proteine vivo a risoluzione quasi in tempo reale utilizzando il modello di proteina lucciola luciferasi fusa alla proteina fluorescente verde (GFP-FFL). FFL-GFP è una proteina chimerica modello unico come la frazione FFL è estremamente sensibile allo stress indotto misfolding e aggregazione, che inattiva l'enzima 12. Attività di luciferasi è monitorata utilizzando un saggio enzimatico, e la frazione GFP fornisce un metodo di visualizzazione FFL solubile o aggregate utilizzando la microscopia automatizzata. Questi metodi accoppiati incorporano due approcci paralleli e tecnicamente indipendenti per analizzare sia ripiegamento e riattivazione funzionale di un enzima dopo stress. Attività di recupero può essere direttamente correlata con la cinetica di disaggregazione e ri-solubilizzazione per capire meglio come proteine fattori di controllo di qualità come chaperon proteine collaborano per eseguire queste funzioni. Inoltre, delezioni o mutazioni geniche possono essere usati per testare contributi di proteine specifiche o subunità proteiche a questo processo. In questo articolo esaminiamo i contributi della proteina disaggregase Hsp104 13, nota di collaborare con il fattore di scambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 ripiegamento, di ripiegamento delle proteine per validare questo approccio.
Introduction
Negli esseri umani malattie neurodegenerative tra cui l'Alzheimer, il Parkinson e le malattie di Huntington sono stati collegati a misfolding e aggregazione 10. Le cellule impiegano chaperon molecolari per prevenire intrappolamento cinetica delle proteine cellulari in strutture inattive mal ripiegate 6. Accompagnatori partecipano a reti di interazione complessi all'interno della cellula, ma non è completamente noto come la somma di queste interazioni contribuisce a proteostasis organismal. Uno degli accompagnatori principali responsabili della maggior parte dei citosolica ripiegamento delle proteine è il 70 kD proteina da shock termico (Hsp70) famiglia 19. È stato dimostrato che la perdita di lievito Hsp70 diminuisce la capacità di piegare nascente FFL heterologously espresso e ripiegare la proteina endogena, ornitina transcarbamoylase, in vivo 18, 7. La capacità di analizzare pieghevole con risoluzione tempo quasi reale faciliterà la comprensione di come ulteriore fattori cellulari contribute a questo processo Hsp70-dipendente. Inoltre, piegatura / ripiegamento reazioni potrebbe non essere completamente dipendente da queste proteine che contribuiscono, in modo dosaggi devono essere abbastanza sensibile per rilevare piccole e grandi cambiamenti nella cinetica e di efficienza.
Il disaggregase cellula di lievito, Hsp104, svolge un ruolo fondamentale nella riparazione di proteine mal ripiegate aggregati. Sebbene Hsp104 omologhi sono stati identificati in funghi e piante, questa famiglia sembra essere assente in metazoi. E 'stato proposto che altri chaperon come quelle della famiglia Hsp110 eseguire alcuni dei noti Hsp104 attività nei mammiferi 16. Hsp104 è un +, complesso proteico esamerica AAA che funziona in lievito di aggregati proteici rimodellare, contribuendo a ripiegamento e riparazione 13. Hsp104, insieme con il lievito Hsp70, Ssa1, e il lievito Hsp40, Ydj1, necessario per il ripristino di FFL denaturato in cellule di lievito 5, 8. La piccola proteina da shock termico, Hsp26, ha anche dimostrato di essere requirosso per disaggregazione Hsp104-mediata di FFL 2.
FFL è una proteina due dominio che lega il substrato luciferina nel sito attivo e seguendo un cambiamento conformazionale che richiede ATP e ossigeno, decarbossila il substrato rilasciando oxyluciferin, anidride carbonica (CO 2), adenosina monofosfato (AMP), e la luce 11, 9, 3. Il substrato disponibile in commercio FFL, D-luciferina, provoca emissione di luce tra 550-570 nm che possono essere rilevati usando un luminometro 15. FFL è squisitamente sensibile alla denaturazione da trattamenti chimici o di calore e aggrega rapidamente a dispiegarsi. Se esposto a temperature tra 39-45 ° C FFL è reversibile spiegato ed inattivato 12. In contrasto, GFP e suoi derivati sono altamente resistenti alla proteina dispiegarsi sollecitazioni 14. Pertanto fusione di queste due proteine permette FFL aver operato come frazione sperimentalmente labile in grado di colpire G funzionaleFP a intracellulare depositi che possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza sia la popolazione e livelli di cellule singole. Applicazione del saggio enzimatico in un lettore di piastre multimodale semi-automatico accoppiato con microscopia automatizzata consente la valutazione simultanea senza precedenti di cinetica e di rendimento di ripiegamento reazioni. Inoltre, la genetica molecolare facili del modello eucariote Saccharomyces cerevisiae consente sia precisa manipolazione della rete di controllo della qualità delle proteine e l'opportunità di approcci basati scoperta per identificare nuovi giocatori che contribuiscono alla risposta allo stress cellulare e proteostasis.
In questo studio, i ceppi wild-type (WT) e Hsp104 cancellazione esprimono FFL-GFP sono soggetti a denaturazione delle proteine da shock termico. FFL-GFP ripiegamento viene monitorata attraverso sia un saggio enzimatico e microscopia come visualizzatore proxy per la riparazione del proteoma espresso in un corso di tempo di ripristino. Se paragonato alle cellule WT, mostriamo the Hsp104 ceppo cancellazione è ~ 60% meno efficiente a ripiegamento FFL-GFP, sostenendo risultati precedenti che istituisce un ruolo per Hsp104 nella riattivazione di denaturato FFL 2.
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Protocol
1. Costruzione di ceppi contenenti FFL-GFP plasmide
Per questo studio, Saccharomyces cerevisiae ceppo BY4741 (MAT una, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) è stato usato in concomitanza con una delezione ceppo Hsp104 dalla collezione ko lievito (Open Biosystems / Thermo Scientific). La delezione è stata confermata usando un anticorpo Hsp104-specifico per l'analisi Western blot.
FFL-GFP è stata espressa da p426MET25-FFL-GFP, costruito da una fonte LEU2 basata plasmide ottenuto dal laboratorio Glover presso l'Università di Toronto, 17 e ottenere, su richiesta agli autori. Espressione della proteina di fusione GFP-FFL plasmide è controllata dal promotore MET25 metionina-reprimibile. Il plasmide è stato trasformato in ogni ceppo utilizzando un protocollo è stato adattato da Gietz et. al, 1995:
- Centrifugare 25 ml o f log cellule di fase in una provetta da 50 ml a 4.400 rpm per 2 minuti, lavare con 500 ml di doppia distillata H 2 0 (DDH 2 O), e scartano supernate.
- Risospendere le cellule in 250 microlitri di TE / Liac (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M di acetato di litio). Incubare a 30 ° C senza miscelare per 20 min.
- Trasferire 50 ml di cellule competenti in una nuova provetta con 5 ml (50 microgrammi) di DNA vettore e 5 microlitri (0,1-5 mg) di DNA plasmidico. Aggiungere 300 ml di PEG / TE / Liac (come TE / Liac più il 40% di glicole polietilene) di questa miscela, e le cellule incubare a 30 ° C per altri 30 min.
- Aggiungere 1/10 del volume (v / v) di DMSO (36 mL) a questa miscela e shock termico a 42 ° C per 6 min.
- Centrifugare miscela a 6.000 rpm per 30 sec e rimuovere supernate. Risospendere le cellule in 100 l di sterili DDH 2 0 e cellule piastra su un supporto completi sintetici privi uracile (SC-URA).
2. Induzione di FFL-GFP
nt "> FFL-GFP è indotto volta cellule sono in fase logaritmica quindi la maggior parte della proteina prima heat-shock, di nuova costruzione per evitare le proteine che sono terminalmente aggregate nel tempo a causa inadeguatezze cellulari associate all'invecchiamento.- 1 ° giorno: le cellule incubare 5 ml di SC-URA a 30 ° C di rotazione O / N.
- Giorno 2: Misura OD 600 e colture fresche inoculare in 5 ml di SC-URA OD 600 ~ 0.2.
- Incubare culture con rotazione a 30 ° C fino a raggiungere log fase OD 600 ~ 0.8-1.0.
- Centrifugare le cellule in 15 ml provette coniche a 4.400 rpm per 3 minuti, decantare supernate e risospendere il pellet cellulare in 500 ml di DDH 2 0; soluzione di trasferimento in una provetta.
- Centrifugare a 6.000 rpm e scartare supernate.
- Risospendere le cellule in 5 ml di SC-URA-MET. Le cellule devono essere incubate rotante in questo media per 1 ora a 30 ° C.
- Centrifugare le cellule e lavare ripetere in DDH 2 0 e scartare supernate.
- Resuspecellule nd in 5 ml supporti SC-URA contenenti 100 mg / ml di cicloeximide di inibire l'espressione della proteina, e procedere immediatamente al punto 3.
3. Enzimatica FFL-GFP Recovery Assay
Questo saggio è un metodo quantitativo per determinare i livelli di enzima attivo in una popolazione.
- La preparazione di questo saggio:
- Misurare OD 600 per ogni campione.
- Preparare necessaria quantità di D-luciferina necessario in base al numero di campioni e numero di repliche aggiungono circa 1.200 microlitri per il tubo desiderato. Concentrazione finale di D-luciferina è ~ 23 mg per 100 ml di cellule. Inizialmente si è disciolta in acqua ad una concentrazione della soluzione di 7,5 mg / ml e diluiti a 455 ug / ml in SC prima dell'esperimento. Nella figura 2, tre repliche per ogni campione sono stati analizzati per un totale di 2,4 ml di D-luciferina utilizzato.
- Lettore di piastre di programma per il flash lumisaggio nescence (adattato da Biotek Gen5 "luminescenza Assay Flash con iniezione", per gli altri strumenti seguono le indicazioni del produttore)
- Impostare la temperatura a 30 ° C
- Impostare lettore di piastre per aggiungere D-luciferina, agitare e leggere ogni bene individualmente.
- Leggi luminescenza (lettura finale, 5 sec il tempo di integrazione, 180 livelli di sensibilità)
- Per i test di recupero tra ogni scossa lettura per 5 min, 20 min ritardare, e agitare un ulteriore 5 min.
- Pipettare 50 ml di D-luciferina da un iniettore.
- Preriscaldare-shock luminescenza è misurato immediatamente dopo che le cellule vengono aggiunti supporti contenenti cicloeximide per fermare la sintesi proteica.
- Trasferire 100 microlitri di cellule per ogni campione con numero desiderato di repliche in un solido bianco piastra da 96 pozzetti.
- I controlli devono comprendere un vuoto d'acqua e le cellule che contengono un vettore vuoto.
- Avviare la lettura con la specifich elencati sopra.
- Per denaturare la porzione di FFL FFL-GFP, incubare la coltura 5 ml in una provetta di coltura di vetro a 42 ° C agitando per 25 min.
- Letture luminescenza saggio di recupero iniziano subito dopo le cellule vengono rimosse dal termostato, che è punto zero tempo. Misura di luminescenza come sopra descritto per il primo punto temporale e ogni 30 min per 90 min.
- Normalizzare i campioni di preriscaldare-shock valori di luminescenza che sono state regolate in base al diametro esterno 600 (dividere i valori di preriscaldamento-shock da OD 600).
4. Microscopia a fluorescenza
Questo saggio è un metodo semi-quantitativo per determinare solubilizzazione degli aggregati nel tempo in una popolazione di cellule.
- L'induzione è la stessa descritta nella sezione 2, punti 1-8 di protocolli.
- Gli stessi punti di tempo sono presi come descritto sopra (sezione 3, punto 4), ma per il microfonoroscopy raccogliere 1 ml di cellule a preriscaldare-shock e ogni punto di tempo di recupero, e campioni incubare rotanti a 30 ° C in tubo di cultura.
- Visualizzazione:
- Centrifugare 1 ml di cellule a 6.000 rpm per 30 sec e rimuovere supernate.
- Risospendere il pellet di cellule in 2 ml di DDH 2 O.
- Miscelare 2 ml di cellule più 2 ml di 2% basso punto di fusione agarosio sul vetrino e aggiungere un vetrino. Per ottenere un unico piano di cellule premere leggermente dito nel centro del vetrino e ruotare finché il vetrino è difficile da spostare.
- Le cellule sono visualizzati tramite oggettiva olio 100X sul microscopio a fluorescenza; utilizzare DIC per visualizzare le cellule e il filtro FITC per visualizzare fluorescenza GFP.
- Prendere più immagini per ogni ceppo ad ogni tempo per la quantificazione. I campi per le immagini devono contenere ~ 15-30 cellule per l'analisi post-sperimentale quantitativa.
- Per calcolare la percentuale di cellule che contengono aggregati, contare 50Cellule -100 totale e dividere il numero di celle che contengono aggregati.
5. Singolo Microscopia cellulare
Questo metodo è usato per seguire la solubilizzazione dei singoli aggregati in una singola cella nel tempo.
- Indurre l'espressione FFL-GFP, come descritto nella sezione 2, punti 1-8.
- Dopo heat-shock, le cellule da centrifuga da 15 ml tubo conico a 4.400 rpm per 2 min.
- Lavare le cellule con 500 ml di acqua e risospendere in 20 ml di DDH 2 O.
- Per ogni ceppo, tagliare una sezione di 5x5 mm su una piastra di agar SC-URA e utilizzando la superficie che era in contatto con la piastra di Petri, Pipetta 4 microlitri di cellule e diffuso in tutto superficie di agar con puntale. Lasciate riposare per circa 1 min.
- Utilizzare le pinzette per posizionare sezione cubo agar a faccia in giù su un ~ 55 millimetri di vetro fondo piatto n ° 0 e premere leggermente.
- Visualizzazione:
- Vedere i-iii a Sectione 4.
- Impostare le coordinate di 2-4 punti focali per ogni ceppo a seconda della densità della cultura.
- Impostare fotocamera per scattare foto con una Z-stack con gamma appropriata (- / + 15 micron di spessore fetta 0.5-1.0 micron) ogni 5 min per un periodo di 90 min.
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Representative Results
Lievito dipende dalla disaggregase, Hsp104 per ripiegare efficientemente proteine denaturate termicamente. L'attività di FFL-GFP è stata monitorata dopo uno shock termico 25 min, utilizzando un flash assay luminescenza Figura 1. I risultati di questo test automatizzati illustrato nella figura 2 hanno rivelato un aumento graduale dell'attività durante 90 min ha permesso di ottenere un recupero> 80% in cellule WT. Il ceppo hsp104Δ recuperato il 19% dell'attività originale, nello stesso arco di tempo. Inoltre, la superficie di inattivazione iniziale era molto più alta nel ceppo mutante chaperone (26% di attività in WT e 11% in hsp104Δ) suggerendo che Hsp104 dovesse svolgere un ruolo protettivo pre-stress, o rapidamente associa con denaturante FFL-GFP durante la fase di inattivazione termica per ridurre la perdita di attività enzimatica.
Microscopia popolazione corroborato il saggio di attività enzimatica. Quasi tutte le cellule del hsp104D mutante Stramantenuto in almeno un FFL-GFP aggregato rispetto al numero di aggregati nel ceppo WT, che è diminuito del 62% entro 90 minuti dopo shock termico (Figura 3). Mentre un numero sostanziale di aggregati formano subito dopo shock termico in entrambi i ceppi, il numero di cellule WT contenenti inerti diminuita rapidamente mentre le cellule hsp104Δ riuscito a cancellare il puncta osservabile. Questi dati confermano il saggio di attività, che ha mostrato un recupero del 52% delle attività in WT contro un recupero minimo dell'8% nel ceppo hsp104Δ.
Singola cellula microscopia automatizzata ha rivelato che nelle cellule WT contro il ceppo hsp104Δ, FFL-GFP è stato solubilizzato ad un tasso superiore (rappresentativi immagini fisse sono mostrati in figura 4; vedere film supplementari per la serie di time-lapse di FFL-GFP ri-solubilizzazione). Inoltre, la dinamica degli aggregati proteici erano molto differenti; nelle cellule WT aggregati tendevano a fondere essere pertanto essere solubilizzata, e questo non è stato osservato nel ceppo hsp104Δ. Questo test non solo supporta i risultati dagli altri due metodi, ma rivela anche spaccato un possibile meccanismo per come la proteina aggregato viene solubilizzato e ripiegata.
Figura 1. Schema di FFL-GFP saggio recupero di calore-shock. Espressione FFL-GFP è indotta in fase di log in cellule che sono state incubate in SC-URA. Per indurre le cellule incubare in SC-URA-MET per 1 ora. Centrifugare le cellule e risospendere in SC-URA contenente 100 mcg / ml cicloesimide (CHX). Per heat-shock, incubare le cellule a 42 ° C per 25 min. Consentono alle cellule di recuperare incubando a 30 ° C. Raccogliere campioni per un corso a tempo 90 min. Per i saggi enzimatici è aggiunto D-luciferina prima di ogni lettura.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. FFL-GFP enzimatiche ripiegamento / dosaggio recupero. Campioni di cellule WT e hsp104Δ (100 pl) sono stati raccolti prima della scarica calore ed immediatamente dopo shock termico per ciascun punto di tempo (0, 30, 60, e 90 min). Tre repliche di ciascun campione sono stati suddivisi in aliquote in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti bianco per ogni punto temporale. Per le letture, il lettore di piastre è stato impostato per misurare la luminescenza ogni 30 min per 90 min a 30 ° C.
<br /> Figura 3. FFL-GFP ripiegamento microscopia. 1 ml di cellule ad ogni tempo (pre-HS, 0, 30, 60, e 90 min) sono stati raccolti e centrifugati. Sovranatante è stato aspirato e le cellule sono state risospese in 2 ml di acqua. Le cellule sono state preparate mescolando con 2 ml di agarosio a bassa fusione. Le cellule sono state visualizzate con l'obiettivo di olio 100X. Immagini rappresentative di ogni punto ora vengono visualizzate. Quantificazione è stato fatto da conteggio nel 4-5 campi e il calcolo della percentuale di cellule contenenti inerti (n ~ 100).
Figura 4. Singola cella ripiegatura corso temporale di microscopia FFL-GFP. Post shock termico 5 ml di cellule sono state raccolte, centrifugate e risospese in 20 ml di DDH 2 O. 4 microlitri di cellule sono stati collocati su un 5 mm 2
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Discussion
In questo articolo l'proteina modello FFL-GFP è stato usato per dimostrare che il disaggregase lievito, Hsp104 contribuisce alla proteina re-solubilizzazione e riparazione. I saggi enzimatici e microscopia differenzialmente interrogato lo stato della stessa proteina substrato per determinare ripiegamento efficienza e la resa. Risultati dei saggi enzimatici recupero suggeriscono che non solo è il massimo recupero nel hsp104D ceppo mutante inefficiente, ma la grandezza iniziale della sollecitazione dispiegarsi era maggiore nel ceppo mutante (Figura 2). L'analisi mostra anche che mentre le cellule hsp104D sembravano essere il tentativo di riparazione, non erano in grado di ripiegare la proteina più rapidamente le cellule WT. Questo metodo ha permesso analisi sensibile e quantitativa dell'attività FFL-GFP rivelando il ruolo essenziale della Hsp104 nella riparazione di questa proteina.
I risultati microscopici suggeriscono che la ragione per la riparazione inefficiente di denaturato enzima FFL è dovuto to proteine intrappolando all'interno degli aggregati. L'analisi ha mostrato che nella popolazione cellule mancanti Hsp104, non le cellule potevano completamente cancellare tutti gli aggregati in 90 min (Figura 3). Inoltre, le analisi di cellule singole rivelato che aggrega fusibile nel tempo, suggerendo che il consolidamento di aggregati più piccoli in strutture più grandi possono aiutare il processo di riparazione e ripiegamento (Figura 4). Anche se questo risultato non è evidente dalle immagini fisse, filmati time-lapse permettono di seguire il comportamento dinamico di aggregati indipendenti. Osservazione di aggregati nel corso tempo scoperti diminuita fusione aggregato nel ceppo hsp104Δ, indicando che queste cellule non si formano le strutture più grandi nel modo più efficiente e suggerendo che Hsp104 è richiesto per questo aspetto del controllo di qualità delle proteine. Un'altra ipotesi è che le cellule possono solubilizzare le proteine più rapidamente da questi aggregati più grandi, che possono contenere inoltre la disaggregazione e riparazione macchine. Microscopia singola cellula può anche essere usato per determinare se sono presenti negli aggregati più grandi rispetto altri piccoli chaperon e co-accompagnatori, e se questo pattern residenza varia nel tempo.
Insieme questi metodi permettono analisi biologica sia biochimici e cellule di ripiegamento proteico e riparazione in cellule viventi. Integrazione dei risultati dei tre metodi descritti permette visione multidimensionale nelle cinetiche e l'efficienza del recupero cellulare dopo proteotoxic heat-shock. Automazione di alcune o tutte le fasi del protocollo consente anche per campioni di dimensioni maggiori e biologiche replicati in un dato esperimento, aumentando la robustezza e ultima fiducia nel risultato. Inoltre, questi metodi teoricamente possono essere estesi ad utilizzare in cellule umane e non solo per le analisi genetiche, ma anche investigare sostanze chimiche che alterano proteostasis.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health (NIGMS-074.696) per KAM e un American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship alla JLA Ringraziamo anche John Glover presso l'Università di Toronto per la fornitura del FFL -GFP plasmide sorgente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
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