Summary
מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור
Abstract
Proteostasis, שהוגדר כתהליכים המשולבים של קיפול חלבונים / biogenesis, refolding / תיקון, והשפלה, הוא איזון עדין סלולרי שחייבים להישמר, כדי למנוע השלכות מזיקות 1. גורמים חיצוניים או פנימיים המשבשים את האיזון הזה יכולים להוביל להצטברות חלבון, רעיל ומוות של תאים. אצל בני אדם זה הוא גורם מרכזי תורם לסימפטומים הקשורים בהפרעות ניווניות כגון הנטינגטון 10, פרקינסון, והמחלות אלצהיימר. לכן זה חיוני שהחלבונים המעורבים בתחזוקה של proteostasis להיות מזוהים על מנת לפתח טיפולים למחלות המתישות האלה. מאמר זה מתאר שיטות לניטור בקיפול חלבוני vivo ברזולוציה זמן כמעט אמיתית באמצעות לוציפראז גחלילית חלבון המודל התמזג חלבון פלואורסצנטי ירוק (FFL-GFP). FFL-GFP הוא חלבון chimeric מודל ייחודי כמחצית FFL היא רגישה מאוד ללחץ-Induced מ 'isfolding וצבירה, אשר מנטרלת את האנזים 12. פעילות לוציפראז היא פיקוח באמצעות assay אנזימטי, ומחצית GFP מספקת שיטה של הדמיה FFL המסיס או מצטבר באמצעות מיקרוסקופ האוטומטי. שיטות אלה בשילוב לשלב את שתי מקבילות ועצמאיים מבחינה טכנית גישות לניתוח והן refolding מחדש תפקודי של אנזים אחרי מתח. התאוששות פעילות יכולה להיות בקורלציה ישירה עם קינטיקה של disaggregation מחדש solubilization כדי להבין טוב יותר כיצד גורמי בקרת איכות חלבון כגון מלווים חלבון לשתף פעולה כדי לבצע פעולות אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בו מחיקות או מוטציות גנטיות כדי לבדוק את תרומתם של חלבונים ספציפיים או יחידות משנת חלבון לתהליך זה. במאמר זה אנו בוחנים את תרומתם של חלבון disaggregase 13 Hsp104, ידוע לשותף עם גורם חילופי Hsp40/70/nucleotide (NEF) refolding מערכת 5, לrefolding חלבון כדי לאמת את הגישה הזאת.
Introduction
אצל בני אדם הפרעות ניווניות לרבות המחלות של הנטינגטון אלצהיימר, פרקינסון, ונקשרו לחלבון misfolding וצבירה 10. תאים להעסיק מלווים מולקולריים כדי למנוע השמנה הקינטית של חלבונים תאיים לתוך מבני 6 misfolded לא פעילים. מלווים להשתתף ברשתות אינטראקציה מורכבות בתוך התא, אך הוא לא הבין לגמרי איך הסכום של אינטראקציות אלה תורם לproteostasis האורגניזם. אחד מהמלווים העיקריים האחראים למרבית קיפול חלבוני cytosolic הוא חלבון 70 KD חום ההלם (Hsp70) המשפחה 19. הוכח כי באובדן שמרים של ירידות HSP70 היכולת לקפל FFL heterologously הביע המתהווה וכדי לקפל את חלבון אנדוגני, ornithine transcarbamoylase, ב18 vivo, 7. היכולת לנתח מתקפל עם רזולוציה קרובה זמן אמת יקל להבין כיצד גורמים נוספים המשך הסלולריribute לתהליך Hsp70 תלוי זה. בנוסף, קיפול / refolding תגובות לא יכול להיות תלוי לחלוטין בחלבונים התורמים אלה, ולכן מבחני חייבים להיות רגישים מספיק כדי לזהות את שני שינויים גדולים וקטנים בקינטיקה ויעילות.
Disaggregase תא השמרים, Hsp104, ממלא תפקיד חיוני בתיקון חלבוני misfolded מצטברים. למרות Hsp104 homologs זוהה בפטריות וצמחים, משפחה זו מופיעה להיעדר בmetazoans. זה הוצע כי מלווים אחרים, כגון אלו של משפחת Hsp110 לבצע חלק מפעילויות Hsp104 הידועות ביונקים 16. Hsp104 הוא +, חלבון מורכב hexameric AAA שמתפקד בשמרים לאגרגטים חלבון לשפץ, שתרם לrefolding ותיקון 13. Hsp104, יחד עם שמרי Hsp70, Ssa1, ושמרי Hsp40, Ydj1, נדרש להתאוששות של FFL מפוגל בשמרי תאים 5, 8. החלבון הקטן חום ההלם, Hsp26, גם הוכח להיות requiאדום לdisaggregation Hsp104 בתיווך של FFL 2.
FFL הוא חלבון שני תחום שנקשר luciferin המצע באתר הפעיל ובעקבות שינוי קונפורמציה שדורש ATP וחמצן, decarboxylates מצע שחרור oxyluciferin, פחמן דו חמצני (CO 2), monophosphate אדנוזין (AMP), ו -11 קלות, 9, 3. המצע זמין מסחרי FFL, D-luciferin, התוצאות בפליטת אור בין 550-570 ננומטר שניתן לאתר באמצעות luminometer 15. FFL הוא רגיש להפליא denaturation מטיפולים כימיים או חום ואגרגטים במהירות על התגלגלות. בעת חשיפה לטמפרטורות שבין 39-45 מעלות צלזיוס FFL הוא פרש הפיך ו12 מומתים. לעומת זאת, ה-GFP ונגזרותיו הם עמידים מאוד לחלבון התגלגלות לחצים 14. לכן שילוב של שני החלבונים האלה מאפשר FFL לתפקד כמחצית ניסוי יציבה מסוגלת מיקוד G הפונקציונליFP לתאי פיקדונות שניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהוא על האוכלוסייה ורמות תא בודדות. יישום של assay אנזימטי בקורא צלחת multimode חצי אוטומטית בשילוב עם מיקרוסקופ האוטומטי מאפשר הערכה בו זמנית חסרת תקדים של קינטיקה תשואה של refolding תגובות. בנוסף, הגנטיקה המולקולרית הקלילה של cerevisiae Saccharomyces eukaryote המודל מאפשרת גם מניפולציה מדויקת של רשת בקרת איכות החלבון ואת ההזדמנות לגילוי המבוססים על גישות חדשניים כדי לזהות שחקנים שתרמו לתגובת לחץ התאי וproteostasis.
במחקר זה, זני הבר מסוג (WT) וHSP104 מחיקה להביע FFL-GFP כפופים להלם חום denaturing חלבון. refolding FFL-GFP הוא פיקוח באמצעות שניהם assay אנזימטי ומיקרוסקופיה כreadout proxy עבור תיקון של proteome בא לידי ביטוי לאורך כמובן זמן התאוששות. בהשוואה לתאי WT, אנו מראים הזן מחיקת Hsp104 דואר הוא ~ 60% פחות יעיל בrefolding FFL-GFP, התומכים בממצאים קודמים הקמת תפקיד לHsp104 בהפעלה מחדש של מפוגל FFL 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בנייה של זנים המכילים FFL-GFP פלסמיד
במחקר זה, זן Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) שימש יחד עם מתח מחיקת HSP104 מאוסף נוקאאוט שמרים (הפתוח Biosystems / Thermo Scientific). המחיקה אושרה באמצעות נוגדן ספציפי לHsp104 ניתוח כתם מערבי.
FFL-GFP בא לידי ביטוי מp426MET25-FFL-GFP, שנבנה ממקור פלסמיד מבוסס LEU2 התקבל מהמעבדה גלובר באוניברסיטת טורונטו 17 והשגה, על פי בקשה למחברים. הביטוי של חלבון היתוך פלסמיד FFL-GFP נשלט על ידי אמרגן מתיונין-repressible MET25. פלסמיד הפך לכל זן באמצעות פרוטוקול הותאם מGietz et. אל, 1995:
- צנטריפוגה 25 מ"ל O f תאי שלב יומן בצינור חרוטי 50 מ"ל ב 4,400 סל"ד במשך 2 דקות, לשטוף עם 500 μl של מזוקק H הכפול 2 0 (DDH 2 O), וזורקים supernate.
- תאי Resuspend ב 250 μl של TE / LiAc (טריס-HCl 10 מ"מ, pH = 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 אצטט ליתיום מ '). לדגור על 30 מעלות צלזיוס, ללא ערבוב במשך 20 דקות.
- העבר את 50 μl של תאים מוסמכים לצינור חדש יחד עם 5 מ"ל (50 מיקרוגרם) של ה-DNA ומנשא 5 μl (0.1-5 מיקרוגרם) של ה-DNA פלסמיד. הוסף 300 μl של PEG / TE / LiAc (אותו הדבר כמו פוליאתילן גליקול% TE / LiAc בתוספת 40) לתערובת זו, ותאים לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספת.
- הוסף נפח 1/10 (V / V) DMSO (36 μl) לתערובת זו והלם חום על 42 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות.
- צנטריפוגה תערובת על 6,000 סל"ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate. Resuspend תאים ב100 μl של 2 0 תאים בצלחת DDH סטריליות על גבי מדיה שלמה סינטטי חסרות אורציל (SC-אורה).
2. אינדוקציה של FFL-GFP
NT "> FFL-GFP הוא מושרה ברגע תאים נמצאים בשלב יומן כך שרוב החלבון לפני חום ההלם הוא עשה זה עתה, כדי למנוע חלבונים שהסתכמו סופני לאורך זמן עקב ליקויים הקשורים להזדקנות הסלולר.- יום 1: תאי דגירה ב5 מ"ל של SC-URA ב 30 מעלות צלזיוס מסתובב O / נ
- יום 2: מדוד OD 600 ותרבויות טריות בלחסן 5 מ"ל של SC-URA OD 600 ~ 0.2.
- דגירה תרבויות עם סיבוב על 30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים יומן השלב OD 600 ~ 0.8-1.0.
- צנטריפוגה תאים ב15 צינורות חרוטי מ"ל ב 4,400 סל"ד במשך 3 דקות, למזוג supernate ו resuspend תא גלולה ב 500 μl של DDH 2 0; פתרון טרנספר לצינור microcentrifuge.
- צנטריפוגה ב -6,000 סל"ד וזורקים supernate.
- Resuspend תאי 5 מ"ל של SC-URA-נפגש. תאים צריכים להיות מודגרות מסתובב באת המדיה עבור שעת 1 ב 30 ° C.
- תאי צנטריפוגות וחזור על לשטוף בDDH 2 0 וזורקים supernate.
- Resuspeתאי nd ב5 מ"ל תקשורת SC-URA המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל של cycloheximide לעכב ביטוי חלבון, ופנה מייד לשלב 3.
3. Assay שחזור FFL-GFP האנזימטית
assay זה הוא גישה כמותית כדי לקבוע את רמות האנזים פעיל באוכלוסייה.
- הכנה לassay זה:
- מדוד OD 600 עבור כל דגימה.
- הכן את הסכום דרוש של D-luciferin צורך בהתבסס על מספר הדגימות ומספר החזרות בתוספת כ -1,200 μl לצינורות רצוי. ריכוז סופי של D-luciferin הוא ~ 23 מיקרוגרם לכל 100 μl של תאים. תחילה הוא מומס במים בריכוז פתרון מניות של 7.5 מ"ג / מ"ל ובדילול ל455 מיקרוגרם / מ"ל בSC לפני הניסוי. באיור 2, שלוש משכפל עבור כל דגימה נבדקו וכתוצאה מכך הסכום כולל של 2.4 מ"ל של D-luciferin בשימוש.
- תכנית צלחת קורא לבזק לומיassay nescence (עיבוד "Assay הארת פלאש עם הזרקה" BioTek Gen5; למכשירים אחרים פעלו בהתאם להוראות יצרן)
- הגדר טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס
- הגדר קורא צלחת להוסיף D-luciferin, לנער, ולקרוא היטב כל אחד בנפרד.
- קרא את הארה (נקודת סיום קריאה, 5 שניות זמן אינטגרציה, רמת רגישות 180)
- עבור assay ההתאוששות בין כל קריאה לנער במשך 5 דקות, 20 דקות עיכוב, ולנער את 5 דקות נוספות.
- לוותר על 50 μl של D-luciferin ממזרק.
- הארה מחממים ההלם נמדדה מייד לאחר הוספת תאים לתקשורת המכיל cycloheximide לעצור סינתזת חלבון.
- העברת 100 μl של תאים עבור כל דגימה עם מספר רצוי של משכפל לתוך צלחת 96 היטב מוצקה לבנה.
- בקרה צריכה לכלול ריק מים ותאים המכילים וקטור ריק.
- התחל לקרוא עם SPEcifications מפורט לעיל.
- כדי לפגל מחצית FFL של FFL-GFP, דגירה תרבות 5 מ"ל בצינור זכוכית תרבות על 42 מעלות צלזיוס רעד במשך 25 דקות.
- קריאות הארה assay שחזור להתחיל מייד לאחר תאים יוסרו מן החממה, שהוא אפס נקודת זמן. מידת הארה זהה למתואר לעיל לנקודת הזמן הראשונה וכל 30 דקות במשך 90 דקות.
- לנרמל את הדגימות לערכי הארה-הלם מחממים שהותאמו על בסיס OD 600 (לחלק את הערכים מחממים-הלם על ידי OD 600).
4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
assay זה הוא שיטה חצי כמותית כדי לקבוע solubilization של אגרגטים לאורך הזמן באוכלוסייה של תאים.
- אינדוקציה היא אותו כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8 של פרוטוקולים.
- אותן נקודות הזמן נלקחות כמתואר לעיל (סעיף 3, שלב 4), אבל למיקרופוןroscopy לאסוף 1 מ"ל של תאים במחממים בהלם וכל נקודת זמן החלמה, ודגימות דגירה מסתובבות ב 30 מעלות צלזיוס בצינור התרבות.
- ויזואליזציה:
- צנטריפוגה 1 מ"ל של תאים ב 6000 סל"ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate.
- Resuspend תא גלולה ב2 μl של DDH 2 O.
- מערבבים 2 μl של תאים בתוספת 2 μl של 2% הנמוך להמיס agarose בשקופית ולהוסיף להחליק את המכסה. על מנת לקבל מישור אחד של תאים לחצו קל את האצבע כלפי מטה במרכז להחליק את המכסה ולסובב עד להחליק את המכסה קשה לזוז.
- תאים הם דמיינו באמצעות אובייקטיבי שמן 100X במיקרוסקופ פלואורסצנטי; להשתמש דסק"ש לדמיין תאים ומסנן FITC לדמיין הקרינה ה-GFP.
- קח את התמונות מרובות עבור כל זן בכל נקודת זמן כדי לכמת. שדות עבור תמונות צריכים להכיל 15-30 ~ תאים לניתוח שלאחר הניסוי כמותי.
- כדי לחשב את אחוז התאים המכילים אגרגטים, לספור 50תאי -100 הכוללים ולחלק את מספר התאים המכילים אגרגטים.
5. מיקרוסקופית תא בודד
שיטה זו משמשת למעקב solubilization של אגרגטים בודדים בתא בודד לאורך זמן.
- לגרום ביטוי FFL-GFP כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8.
- לאחר הלם חום, תאי צנטריפוגות בצינור חרוטי 15 מ"ל ב 4,400 סל"ד במשך 2 דקות.
- שטוף תאים עם 500 μl מים וresuspend ב 20 μl של DDH 2 O.
- לכל זן, לחתוך את קטע של 5x5 מ"מ צלחת אגר SC-URA ושימוש במשטח שהיה במגע עם צלחת פטרי, פיפטה μl 4 תאים והתפשטו ברחבי פני השטח של אגר עם קצה פיפטה. לתת לעמוד במשך דקות ~ 1.
- להשתמש בפינצטה למקום סעיף קובייה אגר עם פנים כלפי מטה על ~ 0 צלחת תחתית זכוכית 55 מ"מ מס ולחץ כלפי מטה בקלילות.
- ויזואליזציה:
- ראה I-III בכתיון 4.
- להגדיר קואורדינטות עבור 2-4 מוקדים לכל זן בהתאם לצפיפות של התרבות.
- הגדר את המצלמה כדי לצלם תמונות עם Z-מחסנית עם הטווח מתאים (- / + 15 מיקרומטר עם עובי פרוס מיקרומטר 0.5-1.0) כל 5 דקות לתקופה 90 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השמרים תלויים בdisaggregase, Hsp104 לקפל חלבוני חום מפוגלים ביעילות. הפעילות של FFL-GFP הייתה פיקוח אחרי 25 דקות הלם חום, באמצעות assay הבזק הארה איור 1. את התוצאות של assay האוטומטי זו שמוצגת באיור 2 נחשפו עלייה הדרגתית בפעילות מעל 90 דקות שסופו של דבר הובילו להתאוששות> 80% בתאי WT. זן hsp104Δ התאושש 19% מהפעילות המקורית על אותה מסגרת הזמן. יתר על כן, במידה של איון הראשוני הייתה גבוהה הרבה יותר בזן מוטנטי המלווה (26% פעילות בWT ו -11% בhsp104Δ) המצביע על כך Hsp104 ניתן משרת תפקיד מגן טרום מתח, או במהירות עם מקורבי denaturing FFL-GFP במהלך צעד איון תרמית כדי לצמצם את אובדן פעילות אנזים.
מיקרוסקופיה האוכלוסייה אימתה assay הפעילות האנזימטית. כמעט כל התאים בhsp104D המוטציה Straבנשמר המצרפי FFL-GFP אחד לפחות בהשוואה למספר של אגרגטים בזן WT, שירד ב 62% תוך 90 דקות לאחר הלם חום (איור 3). בעוד מספר לא מבוטל של אגרגטים שנוצרו מייד לאחר הלם חום בשני הזנים, מספר התאים המכילים אגרגטים WT ירד במהירות תוך תאי hsp104Δ לא הצליחו לנקות את puncta הנצפה. נתונים אלו מחזקים את assay הפעילות, אשר הראה התאוששות 52% מפעילות בWT לעומת 8% התאוששות מינימאלית במתח hsp104Δ.
מיקרוסקופיה אוטומטי תא הבודד גילתה כי בתאי WT לעומת זן hsp104Δ, FFL-GFP היה solubilized בשיעור גבוה יותר (נציג תמונות סטילס מוצגות באיור 4; לראות סרטים נוספים לסדרת זמן לשגות של FFL-GFP מחדש solubilization). בנוסף, על הדינמיקה של אגרגטים החלבון היו שונות מאוד; בתאי WT אגרגטים נטו להיות הפתיל לפני שsolubilized, וזו לא נצפתה במתח hsp104Δ. assay זו תומך לא רק את התוצאות משתי השיטות האחרות, אבל גם מגלה תובנה מנגנון אפשרי לאופן שבו החלבון מצטבר הוא solubilized וקפל.
איור 1. סכמטי של assay התאוששות חום הלם FFL-GFP. ביטוי FFL-GFP הוא מושרה בשלב יומן בתאים שכבר מודגרות בSC-URA. כדי לגרום לתאי דגירה בSC-URA-MET במשך שעה 1. תאי צנטריפוגות ו resuspend ב SC-URA המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide (CHX). לחום הלם, דגירה תאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות. לאפשר לתאים להתאושש על ידי דוגרים על 30 ° C. לאסוף דגימות לקורס זמן 90 דקות. עבור מבחני אנזימטיות D-luciferin הוא הוסיף לפני כל קריאה.ref = היעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. דוגמאות אנזימטיות refolding / assay ההתאוששות. FFL-GFP של WT ותאי hsp104Δ (100 μl) נאספו לפני הלם חום ומייד לאחר הלם חום עבור כל נקודת זמן (0, 30, 60, ו -90 דקות). שלוש משכפל של כל דגימה היה aliquoted לתוך בארות של צלחת 96 גם לבנה עבור כל נקודת זמן. לקריאה, קורא הצלחת הוקם כדי למדוד הארה כל 30 דקות עבור 90 דקות ב 30 ° C.
<br /> איור 3. מיקרוסקופיה refolding FFL-GFP. 1 מ"ל של תאים בכל נקודת זמן (טרום HS, 0, 30, 60, ו -90 דקות) נאסף וcentrifuged. Supernate היה aspirated ותאים היו resuspended ב2 μl של מים. תאים הוכנו על ידי ערבוב עם 2 μl של נמוך להמיס agarose. תאים היו דמיינו באמצעות אובייקטיבי שמן 100X. נציג תמונות של כל נקודת זמן מוצגות. Quantitation נעשה על ידי ספירת תאים בשדות וחישוב 4-5 אחוזים ממצבורים המכילים תאים (n ~ 100).
איור 4. תא בודד refolding כמובן זמן מיקרוסקופית של FFL-GFP. הודעה הלם חום 5 מ"ל של תאים נאספו, centrifuged, וresuspended ב20 μl של DDH 2 O. 4 μl של תאים הונחו על 5 מ"מ 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה מודל חלבון FFL-GFP שימש כדי להראות שdisaggregase השמרים, Hsp104 תורם לחלבון מחדש solubilization ותיקון. את מבחני וכן במיקרוסקופ אנזימטיות נחקרו באופן דיפרנציאלי את המצב של אותו חלבון המצע כדי לקבוע את היעילות ותשואת refolding. תוצאות של מבחני ההתאוששות אנזימטית עולה כי לא רק שההתאוששות המקסימלי בזן מוטנטי hsp104D לא יעיל, אבל בסדר הגודל הראשוני של לחץ התגלגלות היה גדול יותר בזן המוטציה (איור 2). הניתוח גם מראה כי בעוד שתאי hsp104D נראה היה שניסו לתקן, הם לא היו מסוגלים לקפל את החלבון במהירות תאי WT. שיטה זו אפשרה ניתוח רגיש וכמותי של פעילות FFL-GFP חושף את התפקיד החיוני של Hsp104 בתיקון של חלבון זה.
תוצאות מיקרוסקופיה מציעות כי הסיבה לתיקון לא יעיל של אנזים FFL מפוגל בשל tחלבון o לכידה בתוך אגרגטים. הניתוח הראה כי באוכלוסיית התאים חסרי Hsp104, תאים לא יכולים לנקות את כל המצרפים לחלוטין ב -90 דקות (איור 3). בנוסף, ניתוחי התא בודדים גילו כי אגרגטים פתיל לאורך זמן, דבר המצביעים איחוד זה של אגרגטים קטנים יותר למבנים גדולים יותר עשויים לסייע לתהליך התיקון וrefolding (איור 4). אמנם תוצאה זו אינה מובנת מאליה מתמונות סטילס, סרטי זמן לשגות נאפשר אחד ללכת בעקבות ההתנהגות הדינמית של אגרגטים עצמאיים. תצפית של אגרגטים במהלך הזמן נחשף ירד היתוך המצרפי בזן hsp104Δ, מצביע על כך שתאים אלה אינם מהווים את המבנים הגדולים יותר בצורה יעילה וטוענים כי Hsp104 נדרש להיבט זה של שליטת חלבון איכותית. ספקולציות נוספות היא שתאים עשויים solubilize חלבון במהירות רבה יותר מאגרגטים גדולים אלה, אשר עשויים להכיל בנוסף disaggregation ותיקון מ 'achinery. מיקרוסקופיה מהתא בודד יכולה לשמש גם כדי לקבוע אם מלווים אחרים ועמיתים למלווים נמצאים במצרפים הגדולים לעומת קטנים, ואם דפוס התושבות זה משתנה לאורך זמן.
יחד שיטות אלה יאפשרו ניתוח ביולוגי והן ביוכימי תא של refolding חלבון ותיקון בתאים חיים. שילוב של התוצאות משלוש השיטות שתוארו מקנה תובנות רב ממדיות לקינטיקה והיעילות של התאוששות סלולרית לאחר חום הלם proteotoxic. אוטומציה של חלק או את כל השלבים בפרוטוקול מאפשרת גם לגודל מדגם גדול יותר וביולוגי משכפל בניסוי נתון, להגביר את החוסן והביטחון אולטימטיבי בתוצאה. בנוסף, שיטות אלה באופן תיאורטי ניתן להרחיב את השימוש בתאים אנושיים ולא רק לניתוח גנטי, אלא גם לחקור את הכימיקלים שמשנים proteostasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (074,696 NIGMS-) לKAM וחברה אמריקנית למיקרוביולוגיה מלגת רוברט ד 'ווטקינס סטודנט לתואר מחקר לJLA אנו מודים גם ג'ון גלובר באוניברסיטת טורונטו למתן FFL מקור-GFP פלסמיד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L.
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
