Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

التوليف، تسليم الخلوية و Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 2
1Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 2NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, 3NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 4IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

أجهزة الاستشعار مضان هي أدوات قوية في علوم الحياة. نحن هنا وصف منهجية لتجميع واستخدام أجهزة الاستشعار الفلورسنت القائم لقياس درجة الحموضة dendrimer في الخلايا الحية والحية. السقالة شجيري يعزز خصائص الأصباغ الفلورية مترافق مما يؤدي إلى تحسين خصائص الاستشعار عن بعد.

Abstract

وضع مؤشرات الفلورسنت يمثل ثورة لعلوم الحياة. المرمزة وراثيا وfluorophores الاصطناعية مع قدرات الاستشعار يسمح التصور من الأنواع ذات الصلة من الناحية البيولوجية مع القرار المكانية والزمانية عالية. الأصباغ الاصطناعية هي من سيما بفضل اهتمام tunability عالية ومجموعة واسعة من analytes قابلة للقياس. ومع ذلك، هذه الجزيئات تعاني العديد من القيود المتعلقة السلوك جزيء صغير (الفقراء الذوبان، صعوبات في الاستهداف، في كثير من الأحيان لا يسمح التصوير ratiometric). في هذا العمل ونحن نقدم تطوير أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer وتقديم إجراء لقياس درجة الحموضة في المختبر، في الخلايا الحية والحية. نختار dendrimers كمنصة مثالية لأجهزة الاستشعار لدينا لخصائصها العديد من المرغوب فيه (monodispersity، خصائص الانضباطي، multivalency) التي جعلتهم سقالة تستخدم على نطاق واسع لعدة أجهزة الطبية الحيوية. والاقتران من درجة الحموضة الفلورسنتقاد مؤشرات لالسقالة dendrimer إلى تعزيز أداء الاستشعار الخاصة بهم. على وجه الخصوص dendrimers المعرض تقليل تسرب الخلايا، وتحسين استهداف الخلايا وتسمح قياسات ratiometric. تم توظيف هذه المجسات رواية بنجاح لقياس درجة الحموضة في الخلايا الحية في الجسم الحي وهيلا في مخ الفأر.

Introduction

استخدام جزيئات الفلورسنت لتسمية جزيئات محددة بيولوجيا ذات الصلة قد تغير تماما طريقة ندرس النظم البيولوجية. Widefield ومتحد البؤر المجهري يسمح لفي الوقت الحقيقي عالية الدقة التصور من العمليات البيولوجية وهذه الأيام هي من بين التقنيات الأكثر شعبية لدراسة الأحداث البيولوجية في المختبر، في الخلايا في الجسم الحي و. ومثلت 1 تحسن ذات الصلة من خلال تطوير مؤشرات مضان ، أي الأصباغ التي مضان يعتمد على تركيز كيان الجزيئي محددة. وكان الرقم الهيدروجيني المؤشرات والكالسيوم على وجه الخصوص لها تأثير كبير على دراسة علم وظائف الأعضاء الخلية نظرا لأهمية هائلة من H + وأيونات الكالسيوم 2 + في علم الأحياء. 2،3

ومع ذلك، فإن معظم الأصباغ الاستشعار الحالية العديد من القيود الجوهرية المتعلقة سلوكهم صغيرة جزيء مثل: ط) صعوبات في targeti التحت خلويةنانوغرام؛ ب) القابلية للذوبان الفقراء في مجال المياه وبالتالي سوء توافق مع الحياة؛ والثالث) تسرب الخلايا وبالتالي عدم وجود طويل الوقت الفاصل بين قدرة التصوير 4 وعلاوة على ذلك، في إشارة للعديد من تحقيقات لا يمكن تصحيحها عن الاعتماد على تركيز صبغة (غير التصوير ratiometric)، وبالتالي، على قياس المطلق في الخلايا في الجسم الحي أو غير ممكن.

وصفنا مؤخرا منهجية بسيطة وفعالة للتغلب على هذه القيود، على أساس اقتران من الأصباغ الاستشعار على السقالة dendrimer. 5 Dendrimers والبوليمرات hyperbranched monodisperse مع خصائص جذابة جدا للتطبيقات البيولوجية. 6 على وجه الخصوص وقد وضعت عدة أبنية شجيري واستخدامها لمكافحة المخدرات و7 وتوصيل الجينات. 8 فقط بدأت العديد من المجموعات قريب جدا لاستكشاف إمكانات هذه الجزيئات كما سقالة لأجهزة الاستشعار عن بعد. 9،10،11

نحن سابقاوصف طريقا سهلا نحو الاصطناعية functionalization من polyamidoamine مختلفة (PAMAM) السقالات على أساس استرات NHS تفعيلها. يمكن الحصول على 12 يصرف في خطوة واحدة عن طريق غسيل الكلى كما تنقية فقط. ومن المثير للاهتمام هذا النهج يمكن بسهولة أن تطبق على مجموعة متنوعة من السقالات شجيري أو البوليمر. 13،14

لتحقيق dendrimers التصوير ratiometric كانت المزدوج المسمى مع مجموعتين من الأصباغ: ط) مؤشر الرقم الهيدروجيني (أي فلوريسئين) والثاني) شاردة الفلورسنت درجة الحموضة مستقلة (أي رودامين). يسمح هذا لنا لأداء دقيقة التصوير ودرجة الحموضة والنسبة بين فلوريسئين ورودامين يعتمد فقط على درجة الحموضة وليس أكثر على تركيز التحقيق. ويمثل نهج أخرى مثيرة للاهتمام لهذه المشكلة عن طريق استخدام المجسات القائمة على عمر 15. وعمر لا يعتمد على تركيز التحقيق هذه القياسات لا تحتاج إلى تصحيح ratiometric. ومع ذلك، ليفقياسات etime تتطلب الإعداد فعال أكثر تعقيدا وحلها الزمني هو دون المستوى الأمثل للعمليات الفسيولوجية السريعة، مما يحد من تطبيقاتها المحتملة.

من أجل أداء التصوير داخل الخلايا، يحتاج التحقيق ليتم تسليمها عبر غشاء البلازما في العصارة الخلوية. كما dendrimers لا نفاذية غشاء نظرا لحجمها وhydrophilicity، يمكن أن يتحقق من خلال التسليم داخل الخلايا التثقيب الكهربائي. عن طريق هذا الأسلوب، وتستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء لترنسفكأيشن، وصفت الجزيئات يمكن تسليمها على نحو فعال في الخلايا لأداء التصوير عالية الجودة. علاوة على ذلك، مع التثقيب الكهربائي المضاعفات المتصلة dendrimer الإلتقام يمكن تجنبها كما يتم تسليم الجزيئات مباشرة إلى السيتوبلازم. ومن المثير للاهتمام بعد التثقيب الكهربائي dendrimers مختلفة يبين تعريب متميزة داخل الخلايا حتى في غياب أي تسلسل استهداف محددة. 5 هذا passivه الاستهداف، فقط بسبب الخصائص الفيزيائية والكيميائية للdendrimer، يمكن استغلالها لتحقيق عضية محددة التصوير الحموضة.

التصوير Ratiometric يمكن تنفيذها باستخدام متحد البؤر المجهري. فلوريسئين ورودامين، مترافق تساهميا إلى السقالة شجيري، تم تصويرها بشكل منفصل وأنشئت بكسل حسب بكسل نسبة الخريطة. تم الإبلاغ عن عدة إجراءات للسيطرة على الخلايا ودرجة الحموضة في الخلايا الحية عن طريق ionophores. Ionophores هي عبارة عن جزيئات صغيرة مسعور قادرة على نقل أيونات عبر غشاء البلازما؛ ionophores لH + أيون، مثل nigericin، تتوفر، ويمكن استخدامها لمعايرة أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer كشفت هذه القياسات 16 استجابة خطية لدرجة الحموضة على غرار ما لوحظ. في المختبر. على أساس درجة الحموضة المعايرة داخل الخلايا يمكن قياسها بدقة. أظهرت هذه القياسات أن أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer يمكن أن يكون أداة قيمة في دراسة H + homeostأسيس في الخلايا الحية والعمليات المرضية التي تنطوي على درجة الحموضة الأعطال التنظيم.

أثبتنا مؤخرا أن أجهزة الاستشعار درجة الحموضة القائم على dendrimer يمكن أن تطبق أيضا في الجسم الحي، وأداء التصوير الحموضة في دماغ الفئران تخدير 17 نظرا لبيئة معقدة من الأنسجة الحية ذات جودة عالية في الجسم الحي الاستشعار يمثل تحديا تقنيا. نحن هنا تظهر وصف مفصل للإجراءات التجريبية لدرجة الحموضة في الجسم الحي التصوير مع التركيز في القضايا المصيرية التي ينبغي معالجتها لإجراء التصوير الحموضة دقيقة في الدماغ. واستخدمت اثنين من الفوتون المجهري لسببين رئيسيين: ط) استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء يسمح للتغلب على النقص في اختراق الأنسجة من معيار متحد البؤر المجهري؛ ب) على نطاق واسع امتصاص اثنين من الفوتون من فلوريسئين ورودامين تسمح الإثارة في نفس الوقت تجنب المضاعفات المتصلة باستخدام اثنين من موجات الإثارة ل. كانت قياسات درجة الحموضة في مخ الفأرنفذت بنجاح؛ أجهزة الاستشعار تستجيب بسهولة لنقص الأكسجة لحث على تغيير درجة الحموضة في الفضاء خارج الخلية في الدماغ. تثبت هذه القياسات أن المؤشرات القائمة على dendrimer يمكن استخدامها بنجاح لتسليط الضوء على التغيير الفسيولوجية والمرضية من درجة الحموضة في الجسم الحي في نموذج حيواني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تجميع للمجسات

  1. في المقطع التالي نقدم الداخلي للاقتران من مؤشرات الرقم الهيدروجيني إلى dendrimers PAMAM. البروتوكول نفسه يمكن تطبيقه مع الحد الأدنى من التعديل لdendrimers أمين الحاملة البديلة. 5،17،13،14 dendrimers والأصباغ المتاحة تجاريا يمكن استخدامها دون مزيد من التنقيات.
  2. حل dendrimer في DMSO اللامائية (50 ميكرومتر تركيز النهائي). إعداد الحلول الأسهم 10MM من فلوريسئين-NHS وميثيل-رودامين-NHS (TMR) في DMSO اللامائية.
  3. إضافة إلى حل dendrimer المبلغ المطلوب من فلوريسئين وTMR. فإن نسبة المولي في الخليط تعكس كمية من الأصباغ تحميلها على dendrimer. عادة 1 مل من G4 PAMAM حل dendrimer في أنبوب microcentrifuge يتفاعل مع 8 مكافئ (40 ميكرولتر) من فلوريسئين و 8 مكافئ (40 ميكرولتر) من TMR. تحريك الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
  4. تمييع 01:10 بالماء منزوع الأيونات وتحميل رد فعلالخليط في كيس غسيل الكلى (MWCO = 10 كيلو دالتون). Dialyze لمدة 24 ساعة ضد الماء منزوع الأيونات استبدال كثير من الأحيان الماء في الخزان.
  5. نقل الحل إلى قارورة وتجميد الجافة لمدة 24 ساعة. وينبغي الحصول على مسحوق الأرجواني. وزن الحصول الصلبة وتذوب في الماء milliQ في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. قسامة الحل وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. في المختبر درجة الحموضة القياسات

  1. لفي المختبر المعايرة إعداد 500nM حل dendrimer في برنامج تلفزيوني (2 ملي الفوسفات) في كفيت الكوارتز. فمن المستحسن استخدام تمييع جدا PBS العازلة (2 ملم) لتجنب التغيرات المفاجئة لدرجة الحموضة خلال المعايرة.
  2. قياس أطياف انبعاث فلوريسئين (غير شامل 488 نانومتر) وTMR (غير شامل 550 نانومتر) وتحسين إعدادات البصري للمقياس التألق لتحقيق نسبة جيدة إشارة إلى الضوضاء.
  3. إجراء المعايرة درجة الحموضة بإضافة كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N وحمض الهيدروكلوريك 0.1 N. بعد كل إضافة يهز كفيتلخلط، انتظر 1 دقيقة للموازنة وقياس درجة الحموضة عن طريق مسرى مكروي درجة الحموضة. يجب تسجيل الانبعاثات أطياف فلوريسئين وTMR لكل خطوة من دون أي تغيير في إعدادات البصرية.
  4. رسم كثافة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني للمعايرة. ينبغي أن تتأثر إشارة رودامين بواسطة الرقم الهيدروجيني (<10٪). وينبغي أن يكون إشارة فلوريسئين منحنى السيني ويجب أن تكون مزودة نموذج واحد ملزم مع PK = 6.4.

3. الثقافة الخلية و Electroporation

  1. زراعة خلايا هيلا في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 100 U / مل البنسلين، و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (إينفيتروجن). تبقي زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  2. لdendrimer التثقيب الكهربائي، وعندما يتم متموجة الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا باستخدام DPBS (Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة). إزالة DPBS وإضافة التربسين EDTA-. تحييد تريبالخطيئة من خلال إضافة مصل ولكن ليس المضادات الحيوية. أجهزة الطرد المركزي في 900-1،200 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة وسائل الإعلام وشطف الكريات باستخدام DPBS.
  3. عد الخلايا ويستغرق 4 * 10 6 خلايا. أجهزة الطرد المركزي في 1،200-1،500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. resuspend الكرية الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة microporation (توفرها الشركة المصنعة microporator) ونقل الخلايا إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  5. إضافة محلول مائي dendrimer إلى خلايا معلق. كمية dendrimer المطلوبة لكل عينة يعتمد على نوع PAMAM (عادة 250 نانومتر لالموجبة و2 ميكرومتر لdendrimers محايدة).
  6. إضافة العازلة التثقيب الكهربائي (توفرها الشركة المصنعة microporator) في أنبوب microporation. ماصة الخلايا وdendrimers مخاليط مع التثقيب الكهربائي غيض من 100 ميكرولتر حجم الحجم. إدراج ماصة microporator في محطة ماصة. تعيين حالة النبض لmicroporation: نبض الجهد = 1،005 V؛ دور المرأة في التنمية النبضال = 35 مللي ثانية؛ نبض عدد = 2.
  7. بعد نقل خلايا النبض إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 1،200 دورة في الدقيقة لإزالة الزائدة من dendrimer في المتوسط. لوحة 10 ميكرولتر من الخلايا electroporated على أطباق الزجاج السفلي 35 مم (WillCo طبق GWSt-3522) مع المتوسطة الطازجة ث / س المضادات الحيوية.

4. استشعار درجة الحموضة في الخلايا الحية هيلا

  1. الخلايا صورة مع متحد البؤر المجهر 12 ساعة بعد التثقيب الكهربائي.
  2. مجموعة التصفية القياسية لفلوريسئين ورودامين يمكن استخدامها. إذا المرشحات الانضباطي هي مجموعة متاحة قناة الأخضر 500-550 نانومتر وقناة الحمراء من 580 نانومتر إلى 650 نانومتر. الإثارة في 488nm هو الأمثل لفلوريسئين بينما يمكن تصويرها رودامين إما مع 543nm أو خط ليزر 561.
  3. التركيز على عينة وضبط الليزر للكشف عن السلطة وكسب لتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء. إذا كان التثقيب الكهربائي خلايا الناجح يجب أن يكون الفلورسنت الزاهية في كل القنوات. التوطين يعتمد على حجم والمسؤول عن dendrimer المستخدمة. في كثير من الأحيان بعض توطين الليزوزومية (حويصلات محيط بالنواة الصغيرة) موجود بسبب الإلتقام أو التقسيم. يجب التخلص من إذا توطين الليزوزومية هو السائد، أي أكثر من مضان المترجمة داخل الحويصلات ويلاحظ الفقراء إشارة في العصارة الخلوية، وهذا يدل على سمية والقياس. الحصول على القناتين بشكل متتالي، إذا لزم الأمر اكتساب العديد من الصور ومتوسط ​​صور لتحسين جودة الصورة.
  4. للمعايرة المشبك خلية الرقم الهيدروجيني باستخدام مخازن مع ionophores في درجة الحموضة المختلفة والحصول على ما لا يقل عن 20 خلايا لكل درجة الحموضة كما هو موضح أعلاه. للحصول على وصف مفصل للإجراءات وتكوين مخازن يرجى الرجوع إلى بتساري وزملاء العمل. 16 نقترح لقياس لا يقل عن 5 نقاط من درجة الحموضة = 5.5 إلى 7.5 درجة الحموضة =. الرقم الهيدروجيني أقل من 6 سامة للخلايا ولكن السكوت لفترة قصيرة من الوقت، فإننا نقترح على اكتساب الصور في أسرع وقت ممكن. إذا الخلاياتظهر علامات موت الخلايا المبرمج، وتجاهل الخلايا وإعادة تشغيل.
  5. استخدام يماغيج أو برامج مماثلة لتحليل البيانات. استيراد الصور من قناة خضراء وحمراء، طرح الخلفية وخلق بكسل بكسل نسبة التصوير مع أداة "صورة آلة حاسبة".
  6. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) تحديد الخلية المطلوبة وقياس نسبة الأخضر إلى الأحمر داخل الخلايا. تحليل جميع الصور المكتسبة ومن ثم رسم مقابل نسبة الرقم الهيدروجيني. في نطاق 5،5-7،5 يجب أن يكون الاتجاه الخطي. سوف تناسب خطية من النقاط التي تم الحصول عليها إعطاء منحنى المعايرة التي سيتم استخدامها لتحويل نسبة الأخضر إلى الأحمر لدرجة الحموضة.
  7. كما مزيد من السيطرة اكتساب العديد من الخلايا غير المعالجة (أي ionophores) ومحاولة لحساب الرقم الهيدروجيني مع منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها. وينبغي الحصول على قيمة بين 7.2 و 7.4.

5. في فيفو إعداد نموذج

  1. وقد أجريت تجارب على C57BL/6J (ذكور وإناث) بين د بعد الولادةالمنعم يوسف 28 و 70. تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من يوريسين (أي إيثيل كاربامات) (20٪ ث / ت في المياه المالحة الفسيولوجية، 20 ملغ / كلغ يوريثان). تم التضحية الحيوانات بعد التجربة مع جرعة زائدة من يوريتان تليها حقنة داخل القلب من نفس المخدر.
  2. إجراء الحقن العضلي من الفوسفات ديكساميثازون صوديوم (2 ملغم / كغم من وزن الجسم) للحد من الاجهاد استجابة القشرية وذمة دماغية خلال الجراحة.
  3. يحلق رأس الحيوان وتطبيق هلام يدوكائين 2.5٪ إلى فروة الرأس.
  4. استخدام مقص لقطع رفرف من الجلد تغطي الجمجمة من نصفي الكرة الأرضية
  5. غسل العظام يتعرض مع المياه المالحة وبلطف إزالة السمحاق باستخدام ملقط. هذا وسوف توفر قاعدة أفضل للالغراء والاسمنت الأسنان على الالتزام بها.
  6. تطبيق الرأس الصلب آخر حسب الطلب مع غرفة التصوير المركزية والغراء مع فورية الغراء في طائرة موازية تقريبا مع الجمجمة على المنطقة القشرية من طnterest وإصلاحه في مكان مع الاسمنت الأسنان البيضاء (Paladur).
  7. إصلاح رأس الماوس من أجل إجراء حج القحف من 2-3 مم في القطر حفر على المنطقة من الفائدة.
  8. في محاولة للحد من القشرة التدفئة أثناء الجراحة، والدموع الجافية، أو النزيف.
  9. الحفاظ على القشرة superfused مع ACSF العقيمة (126 ملي مول كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 1.2 ملي KH 2 PO 4، 1.3 ملي MgSO 4، 26 مم 3 NaHCO، 2.4 مم CaCl 2، 15 ملي الجلوكوز، 1.2 ملي HEPES في المقطر H 2 O ، ودرجة الحموضة = 7.4).

6. التصوير الحموضة في الدماغ ماوس

  1. أثناء التنفس الحيوان المساعدات التجربة توفير O 2 الهواء المخصب. غير المخصب الأكسجين تصل إلى 80٪. يتم ضبط O 2 الضغط الجزئي وتدفق كثير من الأحيان للحصول على مساعدات التنفس السليم. الحفاظ على الجسم درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية مع ردود فعل تسيطر التدفئة بطانية.
  2. إصلاح الحيوان من خلال هذا المنصب الصلب في إطار الهدف من على بعد الصورة اثنينالإعداد ن التصوير.
  3. من أجل حقن أجهزة الاستشعار في القشرة الدماغية تحميل ماصة الزجاج الذي يحتوي على القطب أجكل (قطر غيض 4 ملم) مع الحل dendrimer (1 ميكرومتر). سوف القطب تسمح لتسجيل امكانات الحقل خارج الخلية.
  4. مع الإعداد حقن مكروي إدراج ماصة في القشرة في حوالي 150 عمق ميكرومتر. حقن لمدة 1-2 دقيقة عند ضغط 0.5 رطل.
  5. تحسين الإعداد للتصوير الضوئي. ينبغي تعديل قوة الليزر لتقليل photobleaching من وphotodamage. عادة قوة الليزر المستخدمة هي حوالي 20 ميغاواط وكان يحتفظ PMT مكاسب ثابتة عند 667 V منذ المعايرة السابقة أظهرت أن هذا الجهد يعطي أفضل نسبة S / N.
  6. للتصوير تثير الاستشعار في 820 نانومتر، وكشف في وقت واحد فلوريسئين ورودامين مضان من خلال مرشحات FITC وTRITC القياسية.
  7. للمرة القياسات حل اكتساب الوقت الفاصل بين سلسلة في 2 هرتز.
  8. لتصحيح الخلفية الحصول على الإطار الظلام مع عالج بالليزرإغلاق مصراع r لقياس الضوضاء الحرارية متوسط ​​الناشئة في هذه الفرق ورمى أضاف عادة من قبل الالكترونيات.
  9. لتحليل البيانات اتبع نفس الإجراء ورد في القسم 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 تمثيل تخطيطي للاقتران من الأصباغ الاستشعار لالسقالات شجيري مختلفة. يمكن الحصول على مؤشرات الناتج في الخطوة الاصطناعية سهلة واحد من المنتجات المتاحة تجاريا. وكان رد فعل dendrimers تحمل أمين مع الأصباغ NHS تفعيلها في DMSO وتنقيته بواسطة غسيل الكلى. وقد تم بالفعل استخدام هذا الإجراء لوصفها العام بنجاح العديد من dendrimers: ط) الجيل PAMAM dendrimer 2 و 4 و 6 و 12 dendrimers PAMAM مضاد للفيروسات 17 و الهجينة PEG-شجيري 18. كما تظهر dendrimers متميزة تفاعلات مختلفة مع الخلايا والأنسجة (توطين، سمية، النفاذية، نشر) اختيار هيكل شجيري يرتبط بقوة إلى التطبيق المطلوب وعينة من الفائدة.

تشمل أجهزة استشعار مجموعتين من الأصباغ الفلورية: ط) مؤشرات الرقم الهيدروجيني والثاني) الأنصاف درجة الحموضة حساسة تعمل المراجع الداخلي و. AlthOUGH مجموعة كبيرة ومتنوعة من المؤشرات والمراجع المتاحة، وقد تم الحصول على أفضل النتائج مع فلوريسئين وtetramethylrhodamine. نسبة الأصباغ اثنين يمكن ضبطها ببساطة باستخدام المعادل المولي مختلفة في رد الفعل. الشكل 2 يظهر المعايرة النموذجية في المختبر جهاز استشعار درجة الحموضة. فلوريسئين ورودامين يمكن متحمس بشكل منفصل في 488nm 550nm و، على التوالي، مما يسمح الحد الأدنى عبر الحديث بين القناتين. كما يمكن أن ينظر إليه بشكل واضح، فلوريسئين (الشكل 2A) يظهر السلوك التي تعتمد على درجة الحموضة في حين لا يغير رودامين (الشكل 2A) إشارة إلى حد كبير في نطاق درجة الحموضة الفسيولوجية. وبالتالي، فإن نسبة من هذه الإشارات اثنين لا يعتمد على تركيز استشعار ولكن فقط على الرقم الهيدروجيني. وسوف يكون تركيز هذا الاستقلال من أهمية كبيرة للقياسات البيولوجية لا يمكن السيطرة عليها تركيز التحقيق داخل الخلايا.

لقياسات الخلايا الحية في INTRويتحقق تسليم ديكي من أجهزة الاستشعار شجيري عبر التثقيب الكهربائي. ويستخدم هذا الأسلوب على نطاق واسع في علم الأحياء لترنسفكأيشن الحمض النووي ويمكن تطبيقها مع وجود اختلافات طفيفة على بروتوكول الشركة المصنعة. من خلال التثقيب الكهربائي، يمكن أن يتم تسليم الجزيئات مباشرة إلى السيتوبلازم، وتجنب أي مضاعفات تتعلق بنظام حويصلي من الإلتقام. يبين الشكل 3A الصور متحد البؤر من خلايا هيلا electroporated مع أجهزة الاستشعار dendrimer. ويلاحظ وجود إشارة قوية في كل من فلوريسئين (الأخضر ويسار) ورودامين (الأحمر والمتوسط). إشارات اثنين colocalize تماما مما يدل على سلامة بنية الاستشعار. يتم بناؤها خريطة ratiometric بقسمة الصورتين بكسل حسب بكسل ومثلت مع مقياس pseudocolor (3A الشكل، والحق). وقد أجريت مع ionophores-لقط الرقم الهيدروجيني، من أجل معايرة استجابة استشعار داخل الخلايا. معايرة مع ionophores هي راسخة البروتوكول، سفوقد وصفت البروتوكولات راؤول على نطاق واسع، ويمكن استخدامها بدون تعديلات. 19 مؤشرات الاستجابة بسهولة لدرجة الحموضة مع تغيير نسبة الأخضر إلى الأحمر كما هو مبين في الشكل 3B. يسمح هذا لنا للحصول على منحنى المعايرة (الشكل 3C) لقياس درجة الحموضة دقيقة. الاتجاه الخطي في معايرة يدل على قدرة استشعار للرد على درجة الحموضة دون أي اضطراب من البيئة الخلوية. وقد استخدم منحنى المعايرة لتحديد قيمة الرقم الهيدروجيني من الخلايا الحية هيلا أن تكون 7.4 و 4.8 لالسيتوبلازم والجسيمات الحالة، على التوالي. هذه النتائج هي في اتفاق جيد مع الأدب.

أخيرا، وأظهرت لنا كيف يمكن استخدام أجهزة الاستشعار على أساس dendrimer لفي الجسم الحي التصوير. Dendrimers يمكن حقنه بسهولة من خلال الأنسجة مع إجراء مماثل جدا لمؤشرات الكالسيوم المستخدمة على نطاق واسع 20 مرة واحدة في الأنسجة، المؤشرات منتشر ببطء شديد، allowinز التصوير على المدى الطويل قبل الصرف الأنسجة كاملة. وتظهر نتائج نموذجية في الشكل 4. فلوريسئين (الخضراء) ورودامين الإشارات (الحمراء) قد تم الحصول عليها في وقت واحد مع 820 نانومتر الإثارة وبنيت الخريطة النسبة على أساس بكسل حسب بكسل، مماثلة للعيش قياسات الخلايا. ومن الجدير بالذكر أن مؤشرات توطين في الفضاء خارج الخلية، والمناطق غير الفلورسنت في الصورة تحديد الهيئات الخلوية أو الأوعية الدموية الصغيرة. من أجل التحقق من استجابة جهاز استشعار لدرجة الحموضة، واقترحنا استخدام hypercapnia. في الواقع، هو معروف ثاني أكسيد الكربون لتغيير التوازنات في مخازن كربونات في الدم والأنسجة، مما أدى إلى تحمض من الأنسجة. 21 كما هو مبين في الشكل 4B، استنشاق 30٪ CO 2 يكفي للحث على استجابة قوية من أجهزة الاستشعار التي هو عكسها تماما عند إعادة التهوية من الفأرة. هذه النتائج تظهر إمكانات وأجهزة الاستشعار القائم على dendrimer لتسليط الضوء الفسيولوجية والسلطة الفلسطينيةالتغييرات thological من درجة الحموضة في الخلايا الحية والحية.

الشكل 1
الشكل 1. تركيب أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer التمثيل التخطيطي القائم على dendrimer استشعار درجة الحموضة، ويمكن تطبيق نفس الإجراء لتقريبا كل dendrimer أمين الحاملة (يسار). تم الحصول على المنتج من خلال رد فعل الاقتران واحدة تليها غسيل الكلى. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الرقم 2. في المختبر درجة الحموضة المعايرة لأجهزة الاستشعار القائم على dendrimer. أ) الاستجابة للمؤشر فلوريسئين درجة الحموضة وب) طإشارة nternal، رودامين، والتي تبين أي تغيير على نطاق درجة الحموضة الفسيولوجية.

الرقم 3
الرقم 3. نتائج ممثل التصوير الحموضة في الخلايا الحية هيلا. أ) التصوير متحد البؤر من قناة فلوريسئين (يسار)، قناة رودامين (وسط) ودرجة الحموضة خريطة ratiometric (يمين). ب) معايرة درجة الحموضة مع ionophores. ج) ممثل خرائط ratiometric الخلايا فرضت في درجة الحموضة مختلفة. مؤشرات نيون Dendrimer المستندة مستنسخة من Albertazzi L، M Brondi، بافان جنرال موتورز، ساتو SS، وآخرون (2011):. في المختبر وفي فيفو تطبيقات بلوس وان 6 (12)، e28450. دوى: 10.1371/journal.pone.0028450

الرقم 4
الشكل 4. التصوير في درجة الحموضةدماغ الفأر تخدير. أ) قناة الأخضر والأحمر (متحمس في وقت واحد في 820 نانومتر) ودرجة الحموضة خريطة ratiometric. ب) استجابة نموذجية من أجهزة الاستشعار لhypercapnia (30٪ CO 2). مقتبس من:. مستنسخة من Albertazzi L، M Brondi، بافان جنرال موتورز، ساتو SS، وآخرون (2011) مؤشرات نيون Dendrimer القائم:. في المختبر وفي فيفو تطبيقات بلوس وان 6 (12)، e28450. دوى: 10.1371/journal.pone.0028450 انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة لنجاح التصوير الحموضة مع أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer هي: ط) اختيار السقالة شجيري الصحيح وعدد من المؤشرات مترافق إليها وب) الاستفادة المثلى من بروتوكول تسليم الاستشعار في الخلايا أو في الجسم الحي.

الإجراء الاصطناعية من السهل إلى حد ما ويمكن تطبيقها عمليا على كل البوليمر hyperbranched الحاملة للأمين. ويمكن الحصول على أجهزة الاستشعار من dendrimers المتاحة تجاريا والأصباغ NHS تفعيلها في خطوة واحدة واحدة. ونحن نعتقد أن هذا الإجراء وحدات واضحة سيكون مفيدا لتطبيق المزيد من هذه المجسات لمجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية. تنقية يمكن تحقيقها بفعالية عن طريق غسيل الكلى لإزالة الأصباغ لا مقترن. اختيار السقالة شجيري أمر بالغ الأهمية ويعتمد على تطبيق معين المطلوب. وقد تبين أن dendrimers مختلفة لديك تعريب غريبة داخل الخلايا بسبب تفاعلات معينة مع لياليهياكل ubcellular. dendrimers محايد (على سبيل المثال الأسيتيل PAMAM G4) لا تظهر أي تفاعل داخل الخلايا وتظهر التعريب منتشر. وبالتالي فإنها تمثل خيارا جيدا لتصوير خلية كاملة. على العكس من ذلك موجبة الشحنة dendrimers من أجيال مختلفة (من G2 إلى G6) التفاعلات مع العرض كهرباء سالبة الشحنة الجزيئات الحيوية (أي RNA) مما أدى إلى توطين الخلوية محددة. dendrimers الموجبة بالتالي فهي مثالية للتصوير عضية محددة.

اختيار الأصباغ الاستشعار عن أمر بالغ الأهمية. تتوفر عدة مؤشرات الرقم الهيدروجيني ودرجة الحموضة حساسة الأصباغ مع الانبعاثات لون مختلف وH + تقارب (PK). حاولنا العديد من تركيبات صبغ مختلفة وتم الحصول على أفضل النتائج مع فلوريسئين وtetramethylrhodamine. هذا الزوج توفير استجابة جيدة لدرجة الحموضة في نطاق الفسيولوجية (PK = 6.4) ومتوافق مع الاجهزة استخداما مرشح المجهري. لمتطلبات مختلفة، مثل قياس، قد تكون هناك حاجة بعض التحسين و في نطاق درجة الحموضة مختلفة. والجدير بالذكر أن ليس كل المؤشرات تحتفظ ممتلكاتهم (السطوع، PK) عند اقتران dendrimer 5 يعتمد هذا السلوك على كل من الصبغة وهياكل dendrimer؛ ومع ذلك، كنا قادرين على تقرير العديد من المؤشرات التي لا تتأثر بشكل كبير من خصائص photophysical من المؤشرات. 17 إذا كان هذا هو الحال فإننا نقترح التصريف الأصباغ من خلال رابط من أجل تقليل التفاعلات dendrimer صباغة. تتوفر تجاريا مع الفواصل ألكيل 22 أو في أدوات الربط، PEG بديلة يمكن استخدامها عدة الأصباغ على رد الفعل. أيضا عدد من المؤشرات والمؤشرات نسبة إلى المرجع الأصباغ على منصة الاعدام هو المهم. نسبة مثالية يعتمد على حساسية الطيفية من الإعداد المجهر المستخدمة وعلى عينة بيولوجية من الفائدة 5،17. على الرغم من أن بعض المشاكل قد تكون هناك حاجة، فإن الإجراء الاصطناعية من السهل جدا وسريعة تسهل إلى حد كبير عملية. أخيرادرجة functionalization من dendrimer، أي النسبة المئوية للنهاية مجموعات من dendrimer التي مترافق إلى الأصباغ، يمكن أن تؤثر على أداء المؤشرات. لتجنب أي مشكلة الذوبان نقترح functionalizing حوالي 10٪ -20٪ من الجماعات نهاية dendrimer. في حالة dendrimers مضاد للفيروسات ولكن نظرا لمساهمة PEG إلى الذوبان، ويمكن تحقيق functionalization كاملة. وهذا يمكن أن يحد أيضا من وجود غير مرغوب فيه من الحنق والظواهر التبريد الأخرى بين الأصباغ مترافق.

Dendrimers ليست خلايا قابلة للاختراق، ولكن لا يمكن أن يتحقق من خلال التسليم داخل الخلايا التثقيب الكهربائي. استخدمناها الحمض النووي ترنسفكأيشن بروتوكول الشركة المصنعة للخط الخلوي من الفائدة دون مزيد من التعديلات. معلمة الحاسم هو تركيز dendrimer في المخزن المؤقت التثقيب الكهربائي، وبصفة خاصة في حالة المؤشرات مع الفقراء السطوع أو dendrimers أنه في تركيزات عالية يمكن أن تكون سامة للخلايا. منخفض بغية دراسته واقرارهسوف ntrations من dendrimer يؤدي ذلك إلى ضعف إشارة داخل الخلايا بينما تركيزات عالية سوف يسبب سمية واستحثاث موت الخلية. تركيز المثالي يعتمد على الزوج dendrimer / مؤشر وكذلك على الإعداد والتصوير المتاحة قد تحتاج الى بعض التحسين. إذا كان electroporator لا يتوفر في المختبر، ويمكن حقن مكروي تمثل بديلا صالحا. ومع ذلك، وهذا هو أسلوب وحيدة الخلية وسوف تجعل الحصول على عدد كبير من الخلايا المصورة أكثر شاقة.

الإجراء أجهزة استشعار التصوير مرنة جدا ويمكن أن تتكيف بسهولة مع العديد من الاجهزة المجهري. أبلغنا سابقا استخدام أجهزة الاستشعار في ظل نظام متحد البؤر مع الانضباطي-acusto البصرية مرشحات 5،17 لكن معيار مجموعات مرشح FITC / TRITC يمكن أن تستخدم أيضا. عندما يتم الحصول على التركيز داخل الخلايا الأمثل، والتصوير ودرجة الحموضة واضح ومباشر. نقترح تحسين كثافة الليزر، وأجهزة الكشف عن الثقب الحصول على مجموعة واسعة من أجهزة الاستشعار داخل الخلاياتركيزات قبل تشغيل معايرة درجة الحموضة مع ionophores. إذا تم استخدام نفس الإعداد المجهر في ظل نفس الظروف ويمكن استخدام معايرة لجميع التجارب. ونحن هنا نقترح التصوير ratiometric لتجنب استشعار تركيز التبعية والتحف. ويمثل منهجية أخرى مثيرة للاهتمام لتحقيق ذلك من خلال تحقيقات على أساس العمر كما أظهرت بأناقة بواسطة فينوجرادوف وزملاء العمل 15 وحد سواء مزايا وعيوب خيارات العرض. قياسات مدى الحياة لا تتطلب أي تصحيح لأنها غالبا ما تكون إجراءات تركيز مستقلة ومعايرة جوهريا أسهل وأكثر استقرارا. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام لون واحد وتجنب المضاعفات وانحراف ممكن الناجمة عن التصوير ratiometric الخضراء إلى الحمراء. ومع ذلك لا تتوفر إلا عدد قليل من تحقيقات فعالة مدى الحياة في حين أن مجموعة كبيرة من تحقيقات القائم على كثافة متاحة تجاريا. المعدات اللازمة للتصوير ratiometric هو أبسط ومتوفرة في أكثر احتمالا كمامرفق tandard المجهري. القياسات وعلاوة على ذلك مدى الحياة بطيئة في جوهرها ولا يمكن تطبيقها لمتابعة العمليات البيولوجية بسرعة. وبالتالي فإن الاختيار بين هاتين التقنيتين تعتمد بقوة على الأجهزة المتاحة، وعلى عملية بيولوجية محددة من الفائدة.

على الرغم من مشابهة من الناحية النظرية، في الجسم الحي التصوير هو أكثر تحديا مما كانت عليه في خلية ثقافة. يتم تقليل إشارة إلى نسبة الضوضاء عن طريق نثر ويمكن للتفاعلات مع الأنسجة تؤثر على استجابة من أجهزة الاستشعار. علاوة على ذلك، من خلال نشر الأنسجة وبالتالي تسرب المؤشر من منطقة الفائدة تمثل مشكلة إضافية غير موجودة لقياسات داخل الخلايا في الثقافة. لهذه الأسباب، واختيار المؤشر أمر بالغ الأهمية. أما بالنسبة للقياسات داخل الخلايا معظم dendrimers تعمل بشكل ممتاز (G4، G4-AC، G6، الهجينة PAMAM-PEG)، لفي الجسم الحي الاستشعار نوصي استخدام مضاد للفيروسات dendrimers 17 إندياناعيد هذه العمارة غير فعالة بشكل خاص لهذا الغرض لعدة أسباب: ط) PEG زيادة حجم dendrimer ويقلل من تسرب لها من الأنسجة؛ ب) يقلل من رابط PEG والتبريد الناتجة عن الصبغة صبغة والتفاعلات dendrimer صبغ و ج) وPEG الدروع الأصباغ من الأنسجة تجنب فقدان وظيفة غالبا ما لوحظ بعد حقن الأنسجة من أجهزة الاستشعار. نوعية الاستشعار عن درجة الحموضة يعتمد بشدة على حقن الناجح لكمية كافية من dendrimer في الأنسجة. عندما يتحقق هذا الإجراء التصوير وتحليل البيانات على غرار ما ورد بالفعل للثقافة الخلية. هذا هو دليل واضح على فعالية أجهزة الاستشعار في الجسم الحي، ويمكن استخدامها باعتبارها الرقابة الداخلية من قبل أي مؤشر النشاط القياس.

ونحن نعتقد أن هذه النتائج جنبا إلى جنب مع الإجراءات التفصيلية التي أعلن عنها في هذا العمل سيسمح التطبيق من أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer لتسليط الضوء على فيزالتغييرات iological والمرضية من درجة الحموضة في الخلايا الحية والحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الافتراضي: المؤلف ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

واعترف مناقشات مفيدة مع Isja دي Feijter ومات بيكر بامتنان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).

Tags

الكيمياء، العدد 79، تقنيات التحقيق والكيمياء والمواد (عام)، dendrimer، مضان، وأجهزة الاستشعار، ودرجة الحموضة، والتسليم، متحد البؤر
التوليف، تسليم الخلوية و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تطبيق مجسات درجة الحموضة مقرها Dendrimer-
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi,… More

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter