Summary
蛍光センサーは、生命科学の強力なツールです。ここでは、生細胞およびin vivoでのpHを測定するために、デンドリマー系蛍光センサーを合成し、使用する方法を記載している。樹状足場が改善検知特性につながる共役蛍光色素の特性を高める。
Abstract
蛍光指示薬の開発は、生命科学のための革命を表していた。遺伝的にコードされたと検知能力を持つ合成フルオロフォアは、高い空間分解能と時間分解能との生物学的に関連の種の可視化を可能にした。合成染料は、その高い同調性と測定可能な分析物の広い範囲に特に関心のおかげである。しかし、これらの分子は、低分子の挙動（溶解度が低い、ターゲット設定の難しさ、許可された多くの場合、無レシオイメージング）に関連するいくつかの制限を受ける。本研究では、デンドリマーベースのセンサの開発を紹介し、生細胞及びin vivoで、in vitroで pH測定のための手順を提示する。我々はそれらのいくつかの生物医学機器に広く使用される足場た彼らの多くの望ましい特性（単分散性、波長可変特性、多価性）のために私たちのセンサーのための理想的なプラットフォームとしてデンドリマーを選択します。蛍光のpHの抱合デンドリマー骨格にインジケータが彼らのセンシング性能の向上につながった。特に、デンドリマーの展示は、セルの漏れを低減し、細胞内ターゲティングを改善し、レシオメトリック測定が可能です。これらの新規なセンサは正常マウス脳におけるHeLa細胞を生体内及び生体内の pHを測定するために使用した。
Introduction
特定の生体関連分子を標識するための蛍光分子の使用は完全に我々は生物学的システムを研究方法を変更しました。広視野と共焦点顕微鏡は、生物学的プロセスをリアルタイムで高解像度の可視化のために許可されたと、最近の細胞およびin vivoでのin vitroでの生物学的事象を研究するための最も人気のあるテクニックの一つです。1関連の改善は、蛍光指標の開発で表したその蛍光の特定の分子実体の濃度に依存する、 すなわち染料。 pHとカルシウムの指標は特に起因する生物学において、H +およびCa 2 +イオンの膨大な関連性に細胞生理学の研究に大きな影響を与えた。2,3
細胞内のtargetiにおけるI）難しさ：ただし、本センシング染料のほとんどいくつかの固有の制限は、次のような彼らの低分子行動に関連NGと、ii）水への溶解度が低い、その結果、貧困層、生体適合性、およびiii）細胞漏れ、したがって長期タイムラプスイメージング能力の欠如4はさらに、多くのプローブの信号は色素濃度への依存のために補正することができない（非。レシオメトリックイメージング）、したがって、細胞またはin vivoで絶対的な測定は不可能である。
我々は最近、デンドリマー骨格上の感知色素のコンジュゲーションに基づき、これらの制限を克服するための簡単で効果的な方法論を説明した図5デンドリマーは、生物学的用途のための非常に魅力的な特性を有する単分散ハイパーブランチポリマーであり、特に6は、複数の樹状アーキテクチャが開発され、使用されている薬剤7および遺伝子送達のために。8ごく最近になっていくつかのグループは、センシングデバイス用の足場として、これらの分子の可能性を探求し始めた。9,10,11
私たちは、以前にNHS-活性化エステルに基づく異なるポリアミドアミンの官能化に向けて容易に合成経路（PAMAM）足場を説明したコンジュゲート12のみを精製などの透析により単一工程で得ることができる。興味深いことに、このアプローチは容易に樹枝状またはポリマー足場、種々に適用することができる。13,14
i）のpH指示薬（ すなわち、フルオレセイン）およびii）pH依存性蛍光部分（ すなわち、ローダミン）：レシオメトリックイメージングデンドリマーを達成するために二重標識色素の2セットであった。これは、フルオレセインおよびローダミンとの比はpHにし、これ以上のプローブの濃度にのみ依存しているように我々に正確なpHの撮影を行うことができました。寿命は、その測定値が、レシオメトリック補正を必要としないプローブ濃度に依存しないように、この問題へのもう一つの興味深いアプローチは寿命ベースのプローブを使用する。15で表されます。しかし、LIFetimeの測定は、より複雑な楽器のセットアップを必要とし、それらの時間分解能は、従って、それらの潜在的用途を限定する、高速な生理的プロセスのために準最適である。
細胞内イメージングを行うために、プローブは、サイトゾルに原形質膜を横切って配信する必要がある。デンドリマーは、それらの大きさおよび親水性のために、膜透過されないように、細胞内送達は、エレクトロポレーションを介して達成することができる。この技術により、トランスフェクションのために広く使用される生物学において、標識された巨大分子を効果的に高品質のイメージングを行うために細胞内に送達することができる。巨大分子が直接細胞質に送達されるようにまた、エレクトロポレーションによりデンドリマーエンドサイトーシスに関連した合併症を回避することができる。興味深いことにエレクトロポ異なるデンドリマーの後でもシーケンスを対象とした全ての特定の非存在下では細胞内の個別のローカライズを示しています。5このPASSIVEのみによりデンドリマーの物理化学的特性のために、ターゲットに、オルガネラ特異なpHイメージングを実現するために悪用される可能性があります。
レシオメトリックイメージング、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。共有結合した樹状足場に結合させ、フルオレセインおよびローダミンは、別々に画像化したと画素ごとの比マップが作成されました。イオノフォアを用いて生細胞における細胞内pHを制御するために、いくつかの手順が報告された。イオノフォアは、原形質膜を横切ってイオンを輸送することができる小さな疎水性分子であり、H +イオンに対するイオノフォア、例えば、ナイジェリシンとして、入手可能であり、デンドリマーベースのセンサを較正するために使用することができる16これらの測定値を観察したものに同様にpHに線形応答を明らかにした。 in vitroで 。較正細胞内のpHに基づいて正確に測定することができる。これらの測定は、デンドリマーベースのセンサーは、研究H + homeost貴重なツールになり得ることを示し生きた細胞およびpH調整の誤動作を伴う病理学的プロセスにおいてASIS。
我々は最近、デンドリマーベースのpHセンサーは、麻酔したマウスの脳におけるpHの撮影を行う、 生体内でも適用することができることを実証した。17により生体組織の複雑な環境へのインビボ検出の高い品質が技術的に困難である。ここでは、脳内の正確なpHイメージングを実行するために取り組むべき重要な課題の重点を置いて、生体内のpHイメージングのための実験手順の詳細な説明を表示。二光子顕微鏡法は、2つの主な理由のために使用されている：i）の赤外光の使用は、標準的な共焦点顕微鏡の組織浸透性の欠如を克服することを可能にすること、ii）フルオレセインおよびローダミンの広い二光子吸収は、それらの同時励起を回避することを可能励起用2波長の使用に関連する合併症。マウス脳におけるpH測定であった正常に実行、センサーが容易に脳細胞外空間中のpHの変化を誘導する低酸素状態に応答します。これらの測定は、デンドリマーベースのインディケータが正常動物モデルにおけるin vivoでのpHの生理学的および病理学的変化を強調するために使用できることを実証している。
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Protocol
1。センサーの合成
- 次のセクションでは、PAMAMデンドリマーにpH指示薬の結合のための手順を提供する。同一のプロトコルは、代替のアミン含有デンドリマーに最少の改変を適用することができる。5,17,13,14、市販のデンドリマーおよび染料をさらに精製することなく使用することができる。
- 無水DMSO（50μM最終濃度）にデンドリマーを溶かす。無水DMSOフルオレセインNHSおよびテトラメチルローダミン-NHS（TMR）の10mMのストック溶液を準備します。
- デンドリマー溶液にフルオレセインとTMRの所望の量を追加します。混合物中のモル比は、デンドリマー上にロード染料の量を反映する。通常、マイクロチューブ内のG4 PAMAMデンドリマー溶液1mlは、フルオレセインとTMRの8 EQ（40μL）の8 EQ（40μL）と反応させる。 12時間室温で溶液を撹拌した。
- 脱イオン水で1:10に希釈し、反応を読み込む透析バッグ（MWCO = 10kDaの）中の混合物。リザーバ内に頻繁に水を交換し、脱イオン水に対して24時間透析。
- 24時間バイアル凍結乾燥の解決策を転送します。紫色の粉末が得られるはずである。重量が得られた固体および10μMの最終濃度でミリQ水に溶かす。 -20℃でのソリューションや店舗を分取
2 インビトロ pH測定
- in vitroでのキャリブレーションのために石英キュベット中のPBS中デンドリマーの溶液500nMの（2 mMリン）を準備します。滴定中のpHの急激な変化を避けるために、非常に希薄PBS緩衝液（2mMの）の使用を推奨します。
- フルオレセインの発光スペクトル（488nmで販売）及びTMR（大口550 nm）を測定し、良好な信号対雑音比を達成するために、蛍光光度計の光学設定を最適化する。
- すべての添加がキュベットを振った後、NaOHを0.1 N及びHCl 0.1 Nの小さなボリュームを追加することにより、pH滴定を行う混合するため、平衡化のために1分待ってからpHの微小電極を用いてpHを測定します。フルオレセインおよびTMRの発光スペクトルは、光の設定を変更せずにステップごとに記録されるべきである。
- 滴定のためのpH対蛍光強度をプロットします。ローダミン信号は、pH（<10％）による影響を受けなければなりません。フルオレセイン信号はS字状曲線でなければならず、主キー= 6.4のシングル結合モデルを装備する必要があります。
3。細胞培養およびエレクトロポレーション
- 10％ウシ胎児血清および100 U / mlのペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を養う。加湿した5％CO 2雰囲気中37℃で細胞培養を維持する。
- デンドリマーエレクトロポレーションのために、細胞がコンフルエントされている場合、メディアを取り出し、DPBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）を用いて細胞を洗浄します。 DPBSを削除し、トリプシン-EDTAを追加します。トリップを中和血清を含む培地ではなく、抗生物質を添加することによって罪。室温で2分間900-1,200 rpmで遠心分離する。メディアを取り外し、DPBSを使用してペレットをすすぐ。
- 細胞をカウントし、4 * 10 6個の細胞を取る。室温で2分間1,200-1,500 rpmで遠心分離する。
- （microporatorの製造元から提供されている）マイクロポ緩衝液200μl中で細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mlのマイクロチューブに細胞を移す。
- 再懸濁細胞へのデンドリマーの水溶液を加える。サンプルごとに必要なデンドリマーの量は、PAMAMタイプ（カチオンと中性デンドリマーのために2μMのため、通常250 nM）を依存しています。
- マイクロポチューブに（microporatorの製造元から提供されている）エレクトロポレーション緩衝液を追加します。 100μl容量サイズのエレクトロチップで細胞やデンドリマーの混合物をピペット。ピペットステーションにmicroporatorピペットを挿入します。パルス電圧= 1005 V、パルスWID：マイクロポのためのパルス条件を設定する目= 35ミリ秒、パルス数= 2。
- 1,200 rpmで5分間の1.5mlマイクロ遠心チューブに細胞を遠心パルス伝達細胞は、培地中の過剰なデンドリマーを除去した後。新鮮な培地でプレート35ミリメートルのガラスボトムディッシュ上にエレクトロポレーションした細胞を10μl（WillCo皿GWSt-3522）W / O抗生物質。
4。リビングHeLa細胞内のpHセンシング
- エレクトロポレーション後、共焦点顕微鏡を12時間と画像セル。
- フルオレセインおよびローダミンのための標準的なフィルタセットを使用することができる。チューナブルフィルタが使用可能な場合は500から緑のチャネルを設定する - 550 nmおよび650 nmの580 nmのから赤チャンネル。ローダミンはどちら543nmのか561レーザーラインで画像化することができますが488での励起は、フルオレセインに最適です。
- 試料に焦点を当て、信号対雑音比を最大にするレーザパワーと検出器の利得を調整する。エレクトロポレーションが成功した場合、細胞は、両方のチャネルで明るく蛍光である必要があります。ザ·ローカライズが使用デンドリマーの大きさおよび電荷に依存します。多くの場合、いくつかのリソソーム局在性（小核周囲小胞）が原因エンドサイトーシスまたは区画に存在している。リソソーム局在化が支配的である場合、 すなわち 、蛍光の大部分がベシクル内部に不良信号局在化される細胞質ゾルにおいて観察され、これは、毒性および測定が廃棄されるべきである意味する。取得複数の画像を必要に応じて、順次、2つのチャネルを取得し、画像品質を向上させるために画像を平均化する。
- 異なるpHでイオノフォアを有する緩衝液を用いて較正クランプセルのためのpHは、上記のようにpHをあたり少なくとも20細胞を獲得する。手順の詳細な説明およびバッファーの成分のためBizzarriや同僚を参照してください。16私たちは、pH = 5.5のpH = 7.5、少なくとも5点を測定することをお勧めします。 6未満のpHは、細胞に対して毒性ではなく、短い時間のために許容され、我々は可能な限り迅速に画像を取得することを示唆している。もし細胞アポトーシスの兆候を示さ、セルを廃棄し、再起動してください。
- データ分析のためのImageJまたは類似のソフトウェアを使用してください。緑と赤のチャンネルの画像をインポートし、バックグラウンドを減算し、ツールの「画像電卓」の画素比イメージングによってピクセルを作成します。
- 所望のセルを選択する関心領域（ROI）を描画し、細胞内の緑から赤色の比率を測定します。取得したすべての画像を分析し、次にpHに対する比率をプロットします。 5.5から7.5の範囲での傾向は直線的である必要があります。得られた点の線形フィットは、pHに緑色〜赤色の比率を変換するために使用される較正曲線を与える。
- さらに対照として、いくつかの未処理細胞（NOイオノフォア）を取得し、得られた検量線を用いてpHを計算してみてください。 7.2と7.4の間の値を取得する必要があります。
5。 インビボサンプル調製
- 実験は、出生後のDとのC57BL/6J（雄と雌）を実施したAY 28と70。ウレタンの腹腔内注射（ すなわちエチルカーバメート）（20％生理食塩水中のW / V、20 mg / kgのウレタン）でマウスを麻酔し。動物は、同じ麻酔薬の心臓内注射したウレタンの過剰摂取を用いた実験後に屠殺した。
- 手術中に皮質ストレス反応および脳浮腫を減少させるためにリン酸デキサメタゾンナトリウム（2 mg / kg体重）の筋肉内注射を行う。
- 動物の頭を剃ると頭皮に2.5％リドカインゲルを適用します。
- 両半球の頭蓋骨をカバーする皮膚のフラップをカットするはさみを使用して、
- 生理食塩水を用いて露光骨を洗い、軽くピンセットを用いて骨膜を削除します。これは、接着剤とを接着するための歯科用セメントのためのより良い基盤を提供します。
- 中央イメージング室とカスタムメイドのスチールヘッドポストを適用し、平面上にシアノアクリレートとそれを接着し、約私の皮質領域の上の頭蓋骨に平行なnterestと白の歯科用セメント（Paladur）で所定の位置に固定します。
- 関心のある領域にわたって掘削直径2〜mmで開頭を実行するために、マウスの頭部を固定します。
- 手術、硬膜涙、または出血の際に皮質の加熱を最小限に抑えるようにしてください。
- 無菌ACSF（126のNaCl、3のKCl、1.2mMのKH 2 PO 4、1.3のMgSO 4、26 mMの炭酸水素ナトリウム、2.4のCaCl 2、15 mMグルコース、蒸留H 2 O中1.2のHEPESで灌流皮質を保つ液、pH = 7.4）。
6。マウス脳におけるpHイメージング
- O 2富化空気を提供する実験援助動物呼吸の間。酸素は80％まで濃縮される。 O 2分圧および流量は、しばしば、適切な呼吸補助を得るために調整される。フィードバック制御された加熱ブランケットを37℃の体温を一定に保つ。
- 2 - 写真の目的の下に鋼製のポストを通して動物を修正しました。n個のイメージングセットアップ。
- 大脳皮質にセンサーを注入するためにデンドリマー溶液（1μM）とAgCl電極（先端径4ミリメートル）を含むガラスピペットをロードします。電極は細胞外電場電位を記録することができるようになります。
- マイクロインジェクションのセットアップを150μm程度の深さで皮質にピペットを挿入します。 0.5 psiの圧力で1〜2分間注入する。
- イメージング用の光学セットアップを最適化します。レーザー出力は光退色と光損傷を最小化するように調整する必要があります。典型的に用いられるレーザパワーが以前の校正がこの電圧は、最良のS / N比が得られることが示されたのでミリワットおよびPMTゲインは667 Vで一定に保った約20である。
- イメージングのために820 nmでセンサーを励起し、標準FITC及びTRITCフィルターを通して、フルオレセインおよびローダミンの蛍光を同時に検出。
- 時間分解測定は、2 Hzで、タイムラプスシリーズを獲得。
- バックグラウンド補正のためにLASEとダークフレームを取得するRシャッターは通常、電子回路によって追加された光電子増倍管と台座に発生する平均熱ノイズを測定するために閉鎖。
- データ解析のために第4章で報告されたのと同じ手順に従ってください。
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Representative Results
図1は、異なる樹状足場に染料を感知するのコンジュゲーションの概略図を示す。得られた指標は、市販品から1つの合成工程で容易に得ることができる。アミン含有デンドリマーはDMSO中のNHS-活性化色素と反応させ、透析によって精製される。この一般的な手順は、すでに成功して、いくつかのデンドリマーの標識に使用されました。I）PAMAMデンドリマー世代2、4、6、12、ペグ化PAMAMデンドリマー17及びPEG-樹状雑種18。としての明確なデンドリマーは、樹枝状構造の選択が強く、目的のアプリケーションに、目的の試料に関連している細胞や組織（ローカリゼーション、毒性、浸透性、拡散）との異なる相互作用を示している。
ⅰ）pH指示薬と内部標準として働くII）pH非感受性部分：センサーは、蛍光色素の2セットを備える。 ALTH指標と参照の多種多様ウワーッ利用できる、最良の結果は、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンで得られている。つの色素の比は、反応において異なるモル当量を使用して簡単に調整することができる。 図2 pHセンサの典型的なインビトロでの滴定を示す。フルオレセインおよびローダミンは、別々に二つのチャンネル間の最小のクロストークを可能にする、それぞれ、488および550nmの励起にすることができる。明瞭に分かるように、ローダミン（ 図2A）信号は、生理学的pH範囲で大きく変化しないが、フルオレセイン（ 図2A）は、pH依存挙動を示す。したがって、これら2つの信号の比は、センサー濃度にのみpHに依存しない。細胞内プローブの濃度を制御することができないように、この濃度の独立性は、生物学的な測定のために非常に重要であろう。
生細胞測定用のINTR樹状センサの無細胞デリバリーは、エレクトロポレーションを介して達成される。この技術は、広くDNAトランスフェクションのための生物学で使用され、製造業者のプロトコルに最小限の変動にも適用することができる。エレクトロポレーションを介して、巨大分子がエンドサイトーシスの小胞システムに関連する合併症を回避し、細胞質に直接送達することができる。 図3aは、デンドリマーセンサでエレクトロポレーションしたHeLa細胞の共焦点画像を示す。強いフルオレセイン（緑、左）の両方の信号およびローダミン（赤、真ん中）が観察される。 2つの信号は完全にセンサ構造の完全性を実証する共局在。レシオメトリックマップは、2つの画像を画素毎に分割することによって再構成さ疑似カラースケール（ 図3a、右）で表される。 pHをクランプイオノフォアでは、細胞内のセンサ応答を較正するために、実施した。イオノフォアとのキャリブレーションが十分に確立されたプロトコルで、セベですRALプロトコルが広く記載されており、改変せずに使用することができる。インジケータ19は、容易に、図3bに示すように、緑色から赤色比の変化を用いてpHに応答する。これは、私たちは、正確なpH測定のための検量線（ 図3c）を得ることができました。キャリブレーション中の線形傾向は、細胞環境からの摂動なしでのpHに反応するセンサーの能力を実証している。較正曲線は、それぞれ、細胞質およびリソソーム7.4〜4.8であることがHeLa細胞を生体のpH値を決定するために使用されている。これらの結果は、文献とよく一致している。
最後に、我々は、デンドリマーベースのセンサは、 インビボイメージングのために使用することができる方法を示した。デンドリマーは、広く使用されているカルシウム指示薬に非常に類似した手順を用いて組織を介して容易に注入することができる。20いったん組織における、指標はallowin、非常にゆっくりと拡散完全な組織の排水前にG長期的なイメージング。典型的な結果を図4に示す。フルオレセイン（緑）およびローダミン（赤）信号を同時にセル測定を生きて同様の820 nm励起および比率マップは画素毎に構築された、得られた。注目すべきは、指標は、細胞外の空間に局在;画像中の非蛍光性の領域は、細胞体や小血管を識別します。 pHに対するセンサ応答を検証するために、我々は、高炭酸ガスの使用を提案した。実際に、二酸化炭素は組織の酸性化をもたらす、血液および組織中の炭酸塩緩衝液の平衡を変化させることが知られている。21 図4bに示すように、30％CO 2の吸入は、強い応答を誘発するのに十分であるマウスの再換気に完全に可逆的であるセンサー。これらの結果は、生理学的な強調表示するデンドリマーベースのセンサの可能性を実証し、PA生細胞およびin vivoでのpHの変化thological。
図1。デンドリマーベースのセンサの合成デンドリマーベースのpHセンサーの模式図。と同様にして事実上すべてのアミン含有デンドリマー（左）に適用することができる。製品は、透析し、単一の複合化反応を介して取得した。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
デンドリマーに基づくセンサーについては、図2。 インビトロ pH滴定。 A）pH指示薬フルオレセインの応答とB）Internal参照、ローダミン、生理的pH範囲にわたって変化を示さない。
図3。 HeLa細胞を生体内のpHイメージングの代表的な結果。 A）フルオレセインチャンネル（左）、ローダミンチャンネル（中央）およびpHレシオメトリック·マップ（右）。イオノフォアとB）のpH校正の共焦点イメージングC）細胞の代表的なレシオメトリックマップは、異なるpHでクランプ。 ら Albertazzi L、BRONDI M、パヴァーヌGM、佐藤、SSから再生（2011）デンドリマー系蛍光指標：in vitro及びin vivoのアプリケーションではPLoSの一つは、6（12）、e28450。 DOI：10.1371/journal.pone.0028450
図4。のpHイメージング麻酔をかけたマウスの脳。 A）緑と赤のチャンネル（820 nmで同時に励起）およびpHのレシオメトリック·マップ。B）高炭酸ガスに対するセンサの典型的な応答（30％CO 2）。 ら Albertazzi L、BRONDI M、パヴァーヌGM、佐藤、SSから再生（2011）デンドリマー系蛍光指標：in vitroおよびin vivo用途でのPLoSのONE 6（12）、e28450。から適応。 DOI：10.1371/journal.pone.0028450 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
デンドリマーベースのセンサとの正常なpHイメージングのための重要なステップは次のとおりです。I）正しい樹状足場の選択と、それに結合させ指標の数や細胞内や生体内でのセンサ配信プロトコルのII）は、最適化。
合成手順は非常に簡単であり、すべてのアミン持つハイパーブランチポリマーに仮想的に適用することができます。センサは、単一のステップにおいて市販のデンドリマーおよびNHS-活性化染料から得ることができる。我々は、このモジュール式で簡単な手順では、生物学のさまざまな問題のためにそのようなセンサの更なるアプリケーションのために有益であると考えています。精製は、効果的にコンジュゲートしていない色素を除去するために透析することによって達成することができる。樹状足場の選択は非常に重要であり、所望の特定のアプリケーションに依存します。異なるデンドリマーは、sとの特異的相互作用に起因し、細胞内の特有の局在を有することが示されているubcellular構造。 （PAMAM G4のアセチル化など）ニュートラルデンドリマーは、細胞内の任意の相互作用を示し、びまん性局在を示していない。こうして彼らは、全細胞イメージングのための良い選択を表しています。逆に負に特定の細胞局在化、その結果、生体分子（ すなわち 、RNA）を入れて（G2からG6まで）表示の静電相互作用を異なる世代のデンドリマーは無料。カチオン性デンドリマーは、このようにオルガネラ特異イメージングに最適です。
センシング染料の選択は重要である。異なる色の発光とH +の親和性（PK）を有するいくつかのpH指示薬とpH非感受性色素は、ご利用いただけます。我々は多くの異なった染料の組み合わせを試してみましたが、最良の結果は、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンで得られた。このペアは、生理的範囲（PK = 6.4）のpHに対する良好な応答を提供し、一般的に使用される顕微鏡フィルタのセットアップと互換性があります。測定のようなさまざまな要件については、異なるpH範囲での、いくつかの最適化が必要とされ得る。注目すべきは、すべての指標は、デンドリマー結合体上にそれらのプロパティ（明るさ、PK）を保持して5この動作は、両方の色素とデンドリマー構造に依存しているが、我々は指標の光物理的特性が大幅に影響されないいくつかの指標を報告することができました。 17この場合、我々は、デンドリマー-色素相互作用を最小限にするために、リンカーを介して色素をコンジュゲートを示唆している。いくつかの反応性染料は、22または代替のPEGリンカーで用いることができるアルキルスペーサーで市販されている。また、足場のインジケータの数と比率指標への参照染料が重要です。理想的な比率が使用顕微鏡のセットアップの分光感度にし、関心5,17の生物標本に依存します。いくつかのトラブルシューティングが必要な場合がありますが、非常に簡単かつ迅速に合成手順が大幅にプロセスを容易にします。最終的にデンドリマーの官能化の程度は、色素にコンジュゲートされたデンドリマーの末端基の割合、すなわち 、インジケーターの性能に影響を与える可能性がある。任意の溶解性の問題を回避するために、我々は、デンドリマーの末端基の約10％〜20％の官能化を示唆している。溶解度へのPEGの寄与に起因しかしながら、ペグ化デンドリマーの場合、完全な官能化を達成することができる。これはまた、FRETおよび共役染料のうち、他の消光現象の望ましくない存在を制限することができます。
デンドリマーは、細胞透過性ではないが、細胞内送達は、エレクトロポレーションによって達成することができる。我々はさらに変更を加えることなく、目的の細胞株について、DNAトランスフェクションメーカープロトコルを採用。重要なパラメータには、エレクトロポレーション緩衝液中のデンドリマーの濃度であり;特に乏しい輝度又はデンドリマーと指標の場合には高濃度で細胞に対して毒性であり得ること。低conce高濃度の毒性を引き起こし、細胞死を誘発するが、デンドリマーのntrationsは、細胞内の劣悪な信号をもたらす。理想的な濃度は、デンドリマー/インジケータペアにだけでなく、利用可能な画像の設定に依存し、いくつかの最適化が必要な場合があります。エレクトロは実験室で使用できない場合は、マイクロインジェクションは、有効な代替手段を表すことができます。しかしながら、これは、単一セル技術であり、撮像された細胞の有意な数の取得がより面倒になります。
センサの撮像手順は、非常に柔軟であり、容易にいくつかの顕微鏡のセットアップに適応させることができる。我々は以前チューナブルacusto光フィルタ5,17が、標準のFITC / TRITCフィルターセットと共焦点システムの下でセンサを使用することも使用することができると報告した。最適な細胞内濃度が得られた場合、pHのイメージングは簡単である。我々は、レーザー強度を最適化するピンホール検出器は、センサ内の広い範囲にわたって利得をお勧めイオノフォアでpH校正を実行する前に濃度。同じ顕微鏡のセットアップが同じ条件で使用した場合、キャリブレーションは、すべての実験のために使用することができる。ここでは、センサの濃度依存性およびアーチファクトを回避するために、レシオメトリックイメージングを提案する。それを達成するためのもう一つの興味深い方法論は、次のようにエレガントにビノグラードフで示し、15を同僚寿命ベースのプローブで表され、両方のオプションには長所と短所が表示されます。彼らは本質的に濃度に依存しないとキャリブレーションの手順は、多くの場合、簡単に、より安定しているように、寿命の測定は、任意の補正を必要としません。また、単一の色は合併症および緑色から赤色レシオメトリックイメージングによって誘導可能な収差を回避するために使用される。強度ベースのプローブの大規模な配列は、商業的にアクセス可能であるがしかし、わずか数実効寿命プローブが用意されています。レシオメトリックイメージングに必要な機器は、シンプルでなどで利用できる可能性が高いtandard顕微鏡施設。また寿命測定は、本質的に低速であり、高速の生物学的プロセスに従うように適用することができない。したがって、これらの二つの技術の間の選択を強く利用可能な機器に関心のある特定の生物学的プロセスに依存します。
概念的に類似するが、 インビボイメージングは、細胞培養におけるよりも困難である。信号対雑音比は、散乱により減少し、組織との相互作用は、センサの応答に影響を与えることができる。また、組織を通って拡散し、関心領域からの指標の、リークは、培養中の細胞内の測定のために存在しない追加的な問題を表している。これらの理由から、標識の選択は重要である。細胞内の測定にデンドリマーのほとんどが（G4、G4-Acは、G6、PAMAM-PEGハイブリッド）を良好に動作しながら、in vivoでの検出のために私たちは、ペグ化デンドリマーの使用をお勧めします。17インドこのアーキテクチャは、いくつかの理由で、この目的のために特に有効であるEEDは、i）PEG、デンドリマーのサイズを増加し、組織からの漏れを減少させるステップと、ii）PEGリンカーは、色素 - 色素および色素デンドリマーの相互作用から生じる消光を最小限に抑え、 ⅲ）PEGは、多くの場合、センサの組織の注射後に観察機能の喪失を回避すること、組織から染料を保護します。 pH検知の品質は強く、組織内のデンドリマーの十分な量の正常な注入に依存します。これが達成されると、撮像手順及びデータ分析は、すでに細胞培養について報告されたものと同様である。これは、 インビボでのセンサの有効性の明確な実証であり、任意の測定の前にインジケータ活性の内部対照として用いることができる。
私たちは一緒にこの仕事で報告された詳細な手順と、これらの結果は、デンドリマーベースのセンサのアプリケーションが物理を強調できるようになると信じている生きた細胞およびin vivoでのpHのiologicalと病理学的変化。
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Disclosures
デフォルト：著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
IsjaデFeijterとマット·ベイカーとの有益な議論は感謝して承諾されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescein NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 |
References
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