Synthesis, Cellular Leverans och Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lorenzo Albertazzi¹, Barbara Storti², Marco Brondi², Sebastian Sulis Sato², Gian Michele Ratto³, Giovanni Signore⁴, Fabio Beltram²

¹Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, ²NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, ³NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, ⁴IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

Fluorescens sensorer är kraftfulla verktyg inom life science. Här beskriver vi en metod för att syntetisera och använda dendrimer-baserade fluorescerande sensorer för att mäta pH-värdet i levande celler och in vivo. Den dendritiska byggnadsställning förbättrar egenskaperna hos konjugerade fluorescerande färger som leder till förbättrade avkänning egenskaper.

Abstract

Utvecklingen av fluorescerande indikatorer representerade en revolution för biovetenskap. Genetiskt kodade och syntetiska fluoroforer med avkänning förmågor tillät visualisering av biologiskt relevanta arter med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Syntetiska färgämnen är av särskilt intresse tack vare sin höga avstämbarhet och det stora utbudet av mätbara analyter. Dessa molekyler drabbas flera begränsningar i samband med små molekyler beteende (dålig löslighet, svårigheter inriktning, ofta ingen ratiometrisk avbildning tillåts). I detta arbete presenterar vi utvecklingen av dendrimer-baserade sensorer och presentera ett förfarande för pH-mätning in vitro, i levande celler och in vivo. Vi väljer dendrimers som idealisk plattform för våra sensorer för deras många önskvärda egenskaper (monodispersitet, avstämbara egenskaper, multivalens) som gjorde dem en allmänt använd byggnadsställning för flera biomedicinska enheter. Konjugering av fluorescerande pHindikatorer till dendrimeren schavotten ledde till en förbättring av deras avkänning föreställningar. Särskilt dendrimerer uppvisar minskad cellläckage, ökad intracellulär målinriktning och tillåta ratiometrisk mätningar. Dessa nya sensorer med framgång använts för att mäta pH i levande HeLa-celler och in vivo i mushjärna.

Introduction

Användningen av fluorescerande molekyler för att märka specifika biologiskt relevanta molekyler har helt förändrat vårt sätt att studera biologiska system. Widefield och konfokalmikroskopi tillåtet för en realtids högupplösta visualisering av biologiska processer och numera är bland de mest populära teknikerna för att studera biologiska händelser in vitro i celler och in vivo. ¹ En relevant förbättring representerades av utvecklingen av fluorescensindikatorer , dvs färgämnen vars fluorescens är beroende av koncentrationen av en specifik molekylär enhet. pH och kalcium indikatorer i synnerhet hade en dramatisk inverkan på studier av cellfysiologi på grund av den enorma betydelsen av H ⁺ och Ca ^{2 +-joner} i biologi. ^2,3

Men de flesta av de avkännande Färger som ingår flera inneboende begränsningar relaterade till deras liten molekyl beteende såsom: i) svårigheter att subcellulär targeting, ii) dålig löslighet i vatten och därmed dålig biokompatibilitet,. och iii) cell läckage och därmed brist på långa tidsförlopp imaging förmåga ⁴ dessutom signalen för många givare kan inte korrigeras för beroendet av färgämneskoncentrationen (icke- ratiometrisk imaging) och därför går det inte att en absolut mätning i celler eller in vivo.

Vi beskrev nyligen en enkel och effektiv metod för att övervinna dessa begränsningar, på grundval av konjugering av sensor färgämnen på en dendrimer byggnadsställning. ⁵ Dendrimer är monodisperse hyperförgrenade polymerer med mycket tilltalande egenskaper för biologiska tillämpningar. ⁶ Särskilt flera dendritiska arkitekturer har utvecklats och använts för läkemedel ⁷ och gen leverans. ⁸ Först helt nyligen flera grupper börjat utforska potentialen av dessa molekyler som klätterställning för avkänningsanordningar. ^9,10,11

Vi har tidigarebeskrivs en enkel syntesväg till den funktionalisering av olika polyamidoamin (PAMAM)-stöd baserat på NHS-aktiverade estrar. ¹² Konjugat kan erhållas i ett enda steg med hjälp av dialys som endast rening. Intressant kan lätt tillämpas denna inställning till en rad olika dendritiska eller polymera ställningar. ^13,14

För att uppnå ratiometrisk avbildnings dendrimers var dubbelmärkta med två uppsättningar av färgämnen: i) en pH-indikator (dvs. fluorescein) och ii) en pH-oberoende fluorescerande del (dvs. rodamin). Detta tillät oss att utföra noggrann pH-avbildning som förhållandet mellan fluorescein och rodamin är endast beroende av pH-värdet och inte mer på koncentrationen av sonden. En annan intressant inställning till denna fråga representeras av användningen av livstids-baserade prober. ¹⁵ Eftersom livet inte är beroende av sondkoncentrationen dessa mått måste inte en ratiometrisk korrigering. Emellertid LIFEtime mätningar kräver ett mer komplicerat instrument-setup och deras temporala upplösning är optimal för snabba fysiologiska processer, vilket begränsar deras potentiella tillämpningar.

För att kunna utföra den intracellulära avbildning, behöver sonden som skall levereras över plasmamembranet in i cytosolen. Eftersom dendrimerer inte är membran permeabla på grund av deras storlek och hydrofilicitet kunde intracellulär avgivning uppnås genom elektroporation. Med hjälp av denna teknik i stor utsträckning används i biologi för transfektion, kan märkta makromolekyler effektivt levereras in i celler för att utföra hög bildkvalitet. Dessutom med elektroporation de komplikationer i samband med dendrimer endocytos kan undvikas eftersom de makromolekyler direkt levereras till cytoplasman. Intressant efter elektroporation olika dendrimererna visar distinkta lokaliseringar inuti cellerna, även i avsaknad av en specifik inriktning sekvens. ⁵ Denna passive inriktning, endast på grund av de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos dendrimeren, kan utnyttjas för att uppnå organell-specifika pH-avbildning.

Propportionell avbildning kan utföras med användning av konfokalmikroskopi. Fluorescein och rodamin, kovalent konjugerad till den dendritiska scaffold, ades separat avbildas och en pixel-för-pixel ratio kartan har skapats. Flera rutiner för kontroll av intracellulära pH i levande celler med hjälp av jonoforer rapporterades. Jonoforer är små hydrofoba molekyler med förmåga att transportera joner över plasmamembranet; jonoforer för H ^{^-jon,} såsom nigericin, är tillgängliga och kan användas för att kalibrera dendrimer baserade sensorer ¹⁶ Dessa mätningar visade en linjär respons på pH-värdet på liknande sätt som det som observerats. in vitro. På grundval av kalibrerings intracellulära pH kan mätas exakt. Dessa mätningar visade att dendrimer-baserad sensor kan vara ett värdefullt verktyg i studie H ⁺ homeostAsis i levande celler och patologiska processer som involverar reglering fel pH.

Vi visade nyligen att dendrimer baserade pH-sensorer även kan appliceras in vivo, utför pH-avbildning i hjärnan av sövda möss. ¹⁷ På grund av den komplexa miljö av levande vävnader med hög kvalitet in vivo avkänning är tekniskt utmanande. Här visar vi en detaljerad beskrivning av den experimentella proceduren för in vivo-pH-avbildning med betoning av de avgörande frågor som måste lösas för att utföra en korrekt pH-avbildning i hjärnan. Två-foton mikroskopi har varit anställd av två skäl: i) användning av infrarött ljus gör det möjligt att övervinna bristen på vävnadspenetration av standard konfokalmikroskopi, ii) den breda två-foton-absorption av fluorescein och rodamin låta sina samtidig excitation undvika komplikationer i samband med användning av två våglängder för excitering. pH-mätningar i mushjärna varframgångsrikt genomförts, sensorer lätt svara på hypoxi framkalla förändring av pH-värdet i hjärnan extracellulära rummet. Dessa mätningar visar att dendrimer baserade indikatorer kan med framgång användas för att belysa fysiologiska och patologiska förändring av pH-värdet in vivo i en djurmodell.

Protocol

1. Syntes av sensorerna

1. I följande avsnitt ger vi ett förfarande för konjugering av pH-indikatorer för PAMAM dendrimers. Samma protokoll kan användas med minimal modifiering till alternativa aminbärande dendrimerer. ^5,17,13,14 Kommersiellt tillgängliga dendrimerer och färgämnen kan användas utan ytterligare rening.
2. Lös dendrimeren i vattenfri DMSO (50 | iM slutlig koncentration). Förbered 10 mM stamlösningar av fluorescein-NHS-och tetrametyl-rodamin-NHS (TMR) i vattenfri DMSO.
3. Lägg till dendrimeren lösningen önskad mängd fluorescein och TMR. Det molära förhållandet i blandningen kommer att återspegla mängden färgämnen som lastas på dendrimeren. Normalt 1 ml G4 PAMAM dendrimer lösning i ett mikrocentrifugrör reageras med 8 ekvivalenter (40 l) av fluorescein och 8 eq (40 l) av TMR. Rör om lösningen vid rumstemperatur under 12 timmar.
4. Späd 1:10 med avjoniserat vatten och ladda reaktionsblandning i en dialyspåse (MWCO = 10 kDa). Dialysera under 24 timmar mot avjoniserat vatten ersätter ofta vatten i reservoaren.
5. Överför lösningen till en ampull och frystorka under 24 timmar. En lila pulver bör erhållas. Vikt av den erhållna fasta substansen och lös den i milliQ vatten vid en slutkoncentration av 10 pM. Alikvotera lösningen och förvara vid -20 ° C.

2. In vitro pH-mätningar

1. För in vitro-kalibrering förbereda en lösning 500 nM av dendrimer i PBS (2 mM fosfat) i en kvartskyvett. Användningen av en mycket utspädd PBS-buffert (2 mM) för att undvika abrupta förändringar av pH-värdet under titreringen rekommenderas.
2. Mät emissionsspektra för fluorescein (exc 488 nm) och TMR (exc 550 nm) och optimera de optiska inställningar i fluorimetern för att uppnå en bra signal-till-brusförhållande.
3. Utför en pH-titrering genom tillsats av små mängder NaOH 0,1 N och HCI 0,1 N. Efter varje tillsats skaka kyvettenför blandning, vänta 1 min för ekvilibrering och mäta pH-värdet med hjälp av en pH-mikroelektrod. Emissionsspektra för fluorescein och TMR bör registreras för varje steg utan att någon förändring i de optiska inställningar.
4. Rita fluorescensintensiteten mot pH för titreringen. Den rodamin signalen bör vara opåverkad av pH (<10%). Den fluorescein signal bör vara en sigmoidal kurva och bör förses med ett enda bindande mallen med pK = 6,4.

3. Cell Culture och elektroporation

1. Odla HeLa-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin (Invitrogen). Håll cellodling vid 37 ° C i en fuktig 5% CO ₂ atmosfär.
2. För dendrimer elektroporation, när celler sammanflytande, ta bort media och tvätta cellerna med hjälp av DPBS (Dulbeccos fosfat-saltlösning). Ta bort DPBS och till trypsin-EDTA. Neutralisera trypsynd genom att tillsätta medium innehållande serum men inte antibiotika. Centrifugera vid 900-1,200 rpm under 2 min vid rumstemperatur. Ta bort materialet och skölj pellets med hjälp av DPBS.
3. Räkna celler och ta 4 * 10 ⁶ celler. Centrifugera vid 1,200-1,500 rpm under 2 min vid rumstemperatur.
4. Resuspendera cellpelleten i 200 | il av mikroporation buffert (tillhandahållen av mikroporator tillverkaren) och överföra cellerna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
5. Lägg dendrimer vattenlösning till resuspenderade celler. Den mängd dendrimer krävs per prov är beroende av den typ PAMAM (typiskt 250 nM för katjoniska och 2 pM för neutrala dendrimerer).
6. Lägg elektroporation buffert (tillhandahålls av mikroporator tillverkaren) i en mikroporation rör. Pipettera cellerna och dendrimererna blandningar med elektroporation spets 100 l volymstor. Sätt i mikroporator pipetten i pipetten stationen. Ställ in puls villkor för mikroporation: pulsspänning = 1,005 V; puls widT = 35 ms, pulsnummer = 2.
7. Efter pulsöverförings celler till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera cellerna under 5 min vid 1200 rpm för att avlägsna överskottet av dendrimeren i mediet. Plate 10 pl elektroporerade celler på 35 mm glasbottnade rätter (Willco-fat GWSt-3522) med färskt medium med / utan antibiotika.

4. pH Sensing i Living HeLa-celler

1. Image-celler med ett konfokalmikroskop 12 h efter elektroporering.
2. Standard filteruppsättning för fluorescein och rodamin kan användas. Om avstämbara filter finns set en grön kanal 500-550 nm och en röd kanal från 580 nm till 650 nm. Excitation vid 488 nm är optimal för fluorescein medan rodamin kunde avbildas antingen med 543nm eller 561 laserlinjen.
3. Fokus på provet och justera lasrar makt och detektorer vinna för att maximera signal-till-brus-förhållande. Om elektroporation var framgångsrika celler bör vara ljust fluorescerande i båda kanalerna. Denlokalisering beror på storleken och laddningen av dendrimer används. Ofta några lysosomala lokalisering (små perinukleära vesikler) är närvarande på grund av endocytos eller uppdelning. Om lysosomala lokalisering är dominerande, det vill säga de flesta av fluorescens är lokaliserad inne blåsor och dålig signal observeras i cytosolen, betyder detta toxicitet och mätning ska kasseras. Förvärva sekventiellt de två kanalerna, vid behov förvärva flera bilder och genomsnitt bilderna för att förbättra bildkvaliteten.
4. För kalibrering klämma cell pH med hjälp av buffertar med jonoforer vid olika pH och skaffa minst 20 celler per pH som beskrivs ovan. För en detaljerad beskrivning av förfarandet och sammansättningen av buffert se Bizzarri och Medarbetare. ¹⁶ Vi föreslår att mäta minst 5 poäng från pH 5,5 till pH 7,5. pH under 6 är giftiga för celler men tolereras för kort tid, föreslår vi att få bilderna så snabbt som möjligt. Om cellervisa tecken på apoptos, kassera cellerna och startar om.
5. Använd ImageJ eller motsvarande programvara för dataanalys. Importera bilder av den gröna och röda kanalen, subtrahera bakgrunden och skapa en pixel för pixel ratio avbildning med funktionen "Bild kalkylator".
6. Rita en region av intresse (ROI) att selektera den önskade cellen och mäta den intracellulära grön-till-röd-förhållande. Analysera alla bilder som förvärvats och sedan rita förhållandet kontra pH. I intervallet 5,5-7,5 trenden sker linjärt. Den linjär anpassning av de punkter som erhålls kommer att ge den kalibreringskurva som kommer att användas för att konvertera grön-till-röd-förhållande till pH.
7. Som ytterligare kontroll förvärva flera obehandlade celler (inga jonoforer) och försöka beräkna pH med den erhållna kalibreringskurvan. Ett värde mellan 7,2 och 7,4 bör erhållas.

5. In vivo Provberedning

1. Experiment utfördes på C57BL/6J (män och kvinnor) mellan postnatal day 28 och 70. Bedövades musen med en intraperitoneal injektion av uretan (dvs. etylkarbamat) (20% vikt / volym i fysiologisk saltlösning, 20 mg / kg uretan). Djuren avlivades efter experiment med en överdos av uretan följt av en intrakardiell injektion av samma bedövningsmedel.
2. Utför en intramuskulär injektion av dexametason-natriumfosfat (2 mg / kg kroppsvikt) för att minska den kortikala stressvar och cerebralt ödem under operationen.
3. Raka djurets huvud och applicera 2,5% lidokain gel till hårbotten.
4. Använd en sax för att klippa den flik av hud som täcker skallen av båda hjärnhalvorna
5. Tvätta exponerade benet med koksaltlösning och försiktigt bort benhinnan med pincett. Detta kommer att ge en bättre grund för lim och tandcement att följa med.
6. Applicera en skräddarsydd stålhuvud inlägg med en central avbildning kammare och limma den med cyanoakrylat i ett plan som är ungefär parallellt med skallen över den kortikala regionen interest och fixa det på plats med vitt dentalcement (Paladur).
7. Fäst huvudet av musen för att utföra en kraniotomi på 2-3 mm som borrats över det intressanta området.
8. Försök att minimera uppvärmning av hjärnbarken under operation, dural tårar, eller blödning.
9. Håll cortex superfuseras med sterilt ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,3 mM MgSO _4, 26 mM NaHCOa _3, 2,4 mM _CaCl2, 15 mM glukos, 1,2 mM HEPES i destillerat _H2O , pH = 7,4).

6. pH-avbildning i Mouse Brain

1. Under experimentet stöd djur andning ger _O2 berikad luft. Syre är anrikad upp till 80%. O ₂ partiella tryck och flöde är ofta justeras för att få en ordentlig andningsstöd. Håll kroppstemperaturen konstant vid 37 ° C med en återkopplingskontrollerad värmefilt.
2. Fäst djuret genom stål inlägget under målet om en två-foton avbildning setup.
3. För att spruta in sensorn i hjärnbarken ladda en glaspipett innehållande en AgCl-elektrod (tip diameter 4 mm) med dendrimeren lösning (1 | iM). Elektroden gör det möjligt att spela in extracellulära fältpotentialer.
4. Med en mikroinjektion inställningar för in pipetten i cortex vid ca 150 nm djup. Spruta för 1-2 minuter vid ett tryck av 0,5 psi.
5. Optimera den optiska setup för avbildning. Lasereffekt bör justeras för att minimera fotoblekning och fotoskador. Normalt lasereffekt används är cirka 20 mW och PMT vinst hölls konstant vid 667 V sedan tidigare kalibreringar visade att denna spänning ger den bästa S / N-förhållande.
6. För avbildning väcka sensorn vid 820 nm och upptäcker samtidigt fluorescein och rodaminfluorescens genom standardiserade FITC och TRITC filter.
7. För tiden upplösta mätningar skaffa tid förfaller serien på 2 Hz.
8. För bakgrundskorrigering skaffa en mörk ram med laser slutaren stängd för att mäta den genomsnittliga termiska bruset som uppstår i PMTs och sockeln oftast lagts till av elektroniken.
9. För dataanalys följa samma förfarande som redovisas i avsnitt 4.

Representative Results

Figur 1 visar en schematisk representation av konjugering av avkänning färgämnen till olika dendritiska scaffolds. De resulterande indikatorer kan uppnås i en enkel syntetisk steg från kommersiellt tillgängliga produkter. Aminbärande dendrimers omsattes med NHS-aktiverade färgämnen i DMSO och renas genom dialys. Det allmänna förfarande har redan med framgång använts för märkning av flera dendrimers: i) PAMAM dendrimer generation 2, 4 och 6, ¹² pegylerade PAMAM dendrimers ¹⁷ och PEG-dendritiska hybrider ^18. Som distinkta dendrimers visar olika interaktioner med celler och vävnader (lokalisering, toxicitet, permeabilitet, diffusion) valet av den dendritiska strukturen är starkt relaterad till önskat program och med den förlaga av intresse.

Sensorerna består av två uppsättningar av fluorescerande färger: i) pH-indikatorer och ii) pH-okänsliga delarna fungerar som interna referenser. Althgrundlig ett stort antal olika indikatorer och referenser finns, de bästa resultaten har uppnåtts med fluorescein och tetrametylrodamin. Förhållandet mellan de två färgämnena kan avstämmas helt enkelt med användning av olika molära ekvivalenter i reaktionen. Figur 2 visar en typisk in vitro-titrering av en pH-sensor. Fluorescein och rodamin kan separat exciteras vid 488 nm och 550 nm, respektive, vilket gör att minsta överhörning mellan de två kanalerna. Såsom tydligt kan ses, fluorescein (figur 2A) visar ett pH-beroende beteende medan signalen rodamin (fig 2A) inte förändras väsentligt i det fysiologiska pH-området. Därför betyder förhållandet mellan dessa två signaler inte bero på sensor koncentration, men bara på pH-värdet. Denna koncentration oberoende kommer att vara av stor betydelse för den biologiska mätningar som intracellulär sond koncentrationen inte kan kontrolleras.

För levande celler mätningar intracellulärt leverans av de dendritiska sensorerna sker via elektroporation. Denna teknik används ofta i biologi för DNA-transfektion och kan appliceras med minimala variationer på tillverkarens protokoll. Genom elektroporation, kan de makromolekyler levereras direkt till cytoplasman, undvika komplikationer i samband med vesikulär system av endocytos. Figur 3a visar konfokala bilder av HeLa-celler elektroporerade med dendrimer sensorer. En stark signal i både fluorescein (grön, vänster) och rodamin (röd, mitten) observeras. De två signalerna perfekt colocalize visar integriteten av sensorstrukturen. En ratiometrisk karta rekonstrueras genom att dividera de två bilderna pixel-för-pixel och representerad med en pseudoskala (figur 3a, höger). pH-fastspänning med jonoforer utfördes, för att kalibrera sensorn respons inre celler. Kalibrering med jonoforer är ett väletablerat protokoll, seveRAL-protokoll har utförligt beskrivits och kan användas utan modifieringar. ¹⁹ Indikatorer lätt svara på pH med en förändring av det gröna-till-röd förhållande som visas i figur 3b. Detta tillät oss att skaffa oss en kalibreringskurva (Figur 3c) för noggranna pH-mätningar. Den linjära trenden i kalibrerings visar förmågan hos sensorn att reagera på pH utan störning från den cellulära miljön. Kalibreringskurvan har använts för att bestämma pH-värdet av levande HeLa-celler för att vara 7,4 och 4,8 för cytoplasma och lysosomer, respektive. Dessa resultat är i god överensstämmelse med litteraturen.

Slutligen är vi visade hur dendrimer baserade sensorer kan användas för in vivo-avbildning. Dendrimererna kan injiceras lätt genom vävnaden med ett förfarande som liknar de allmänt använda kalcium indikatorer. ²⁰ En gång i vävnaden, indikatorerna diffunderar mycket långsamt, allowing långsiktig avbildning innan fullständig vävnad dränering. Typiska resultat visas i Figur 4. Fluorescein (grön) och rodamin (röd) signaler har samtidigt erhållits med 820 nm excitation och förhållandet kartan byggdes på en pixel-för-pixel, som liknar levande celler mätningar. Noterbart indikatorerna lokalisera i det extracellulära utrymmet, de icke-fluorescerande områden i bilden identifiera cellulära organ eller små blodkärl. För att kontrollera sensor svar på pH, föreslår vi användning av hyperkapni. Faktum är koldioxid känt att förändra jämvikten av karbonatbuffertar i blod och vävnader, vilket resulterar i en försurning av vävnaderna. ²¹ Såsom visas i figur 4b, är tillräckligt för att inducera ett starkt svar på inhalering av 30% _CO2 sensor som är fullständigt reversibel vid åter ventilation av musen. Dessa resultat visar potentialen i dendrimer-baserade sensorer för att belysa fysiologiska och pathological förändringar av pH i levande celler och in vivo.

Figur 1. Syntes av dendrimer-baserade sensorer schematisk representation av dendrimer baserad pH-sensor. Samma förfarande kan tillämpas på praktiskt taget varje aminbärande dendrimer (vänster). Produkten erhölls genom en enda konjugeringsreaktion följt av dialys. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. In vitro pH-titrering för en dendrimer-baserad sensor. a) Svar av pH-indikator fluorescein och b) iNRE referens, rodamin, visar ingen förändring över det fysiologiska pH-området.

Figur 3. Representativa resultat av pH-avbildning i levande HeLa-celler. a) Confocal avbildning av fluorescein kanal (vänster), rodamin kanal (mitten) och pH ratiometrisk map (höger). b) pH-kalibrering med jonoforer. c) representativa ratiometrisk kartor av celler fastspända vid olika pH. . Reproduceras från Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer-baserade Fluorescerande indikatorer:.. In vitro-och in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Figur 4. pH-avbildning ihjärnan hos sövda musen. a) grön och röd kanal (samtidigt upphetsad vid 820 nm) och pH ratiometrisk kartan. b) typiska svaret från givaren till hyperkapni (30% _CO2). Anpassad från:. Reproducerad från Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer-baserade Fluorescerande indikatorer:.. In vitro-och in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

De kritiska stegen för framgångsrik pH-avbildning med dendrimer-baserade sensorer är: i) val av rätt dendritiska schavotten och antalet indikatorer konjugerade till den och ii) optimering av sensorleveransprotokoll i celler eller in vivo.

Det syntetiska förfarandet är relativt enkelt och kan appliceras praktiskt taget till varje aminbärande hyperförgrenad polymer. Sensorerna kan erhållas från kommersiellt tillgängliga dendrimererna och NHS-aktiverade färgämnen i ett enda steg. Vi tror att denna modulära och okomplicerat förfarande kommer att vara till nytta för den fortsatta tillämpningen av sådana sensorer för olika biologiska frågeställningar. Rening kan uppnås effektivt genom dialys för att avlägsna de icke-konjugerade färgämnen. Valet av den dendritiska scaffold är avgörande och beror på den önskade specifika applikationen. Olika dendrimers har visat sig ha speciella lokaliseringar inuti celler på grund av specifika interaktioner med subcellular strukturer. Neutrala dendrimerer (t.ex. acetylerad PAMAM G4) visar ingen interaktion inom celler och visa en diffus lokalisering. Därmed utgör de ett bra val för en hel-cell imaging. Tvärtom positivt laddade dendrimerer av olika generationer (från G2 till G6) display elektrostatiska interaktioner med negativt laddade biomolekyler (dvs. RNA) vilket resulterar i specifika cellulära lokalisering. Katjoniska dendrimerer är därför idealisk för organell specifik avbildning.

Valet av de avkännande färgämnen är kritisk. Flera pH-indikatorer och pH-okänsliga färgämnen med olika färg utsläpp och H ⁺ affinitet (PK) är tillgängliga. Vi försökte många olika färgämneskombinationer och de bästa resultaten erhölls med fluorescein och tetrametylrodamin. Detta par ger en bra respons på pH i det fysiologiska området (pK = 6,4) och är kompatibel med vanligen använda mikroskopi filterinställningar. För olika krav, såsom mätnings i olika pH-intervallet kan viss optimering krävas. Noterbart är inte alla indikatorer behåller sina egenskaper (ljusstyrka, PK) på dendrimer konjugering ⁵ Detta beteende beror både på färgen och dendrimer strukturer,. Dock, kunde vi rapportera flera indikatorer där fotofysikaliska egenskaper indikatorerna inte signifikant påverkas. ¹⁷ Om detta är fallet föreslår vi att konjugera färgämnena genom en linker för att minimera dendrimer-ningsinteraktioner. Flera reaktiva färgämnen är kommersiellt tillgängliga med alkyl distanser ²² eller i alternativa PEG-länkar kan användas. Även antalet indikatorer och förhållandet indikatorer-till-referens färgämnen på ställningen är viktigt. Det ideala förhållandet beror på den spektrala känslighet för mikroskopi inställningar som används och på det biologiska provet av intresse ^5,17. Även om en del felsökning kan behövas, kommer det mycket enkelt och snabbt syntetisk procedur hög grad underlätta processen. Slutligengraden av funktionalisering av dendrimeren, dvs den procentuella andelen av ändgrupper i dendrimeren som konjugeras till färgämnen, kan påverka prestanda hos de indikatorer. För att undvika alla problem löslighet vi föreslår functionalizing omkring 10% -20% av dendrimer ändgrupper. I fallet med pegylerade dendrimerer Men på grund av PEG bidrag till löslighet, kan åstadkommas ett fullständigt funktionalisering. Detta kan också begränsa den oönskade närvaron av FRET och andra kylningsfenomen mellan de konjugerade färgämnen.

Dendrimer är inte cell-permeabla men intracellulär avgivning kan uppnås genom elektroporation. Vi anställda DNA-transfektion tillverkaren protokoll för cellinje av intresse utan ytterligare ändringar. En viktig parameter är koncentrationen av dendrimeren i elektroporering buffert, i synnerhet när det gäller indikatorer med dålig ljusstyrka eller dendrimerer att vid höga koncentrationer kan vara toxiskt för cellerna. Låg concentrations av dendrimer ger dålig signal inuti celler medan höga koncentrationer orsakar toxicitet och framkalla celldöd. Den idealiska koncentrationen beror på dendrimeren / indikatorparet samt på bildinställningar finns tillgängliga och kan behöva lite optimering. Om en elektroporator inte finns i labbet, kan mikroinjektion utgöra ett giltigt alternativ. Detta är dock en encelliga teknik och kommer att göra förvärv av ett betydande antal avbildas celler mer arbetskrävande.

Sensorerna avbildningsproceduren är mycket flexibel och kan enkelt anpassas till flera mikroskopi uppställningar. Vi har tidigare rapporterat att användningen av sensorerna under konfokala systemet med avstämbara acusto optiska filter ^5,17 men standard FITC / TRITC filtersatser kan också användas. Då optimal intracellulära koncentrationen uppnås, är pH-avbildning okomplicerad. Vi föreslår att optimera laser intensitet, pinhole och detektorer vinna över ett stort antal sensor intracellulärakoncentrationer innan du kör pH-kalibrering med jonoforer. Om samma mikroskopi inställning används under samma förhållanden kalibreringen kan användas för alla experiment. Här föreslår vi ratiometrisk bildbehandling för att undvika sensorkoncentrationsberoende och artefakter. En annan intressant metod för att uppnå detta representeras av livstids-baserade prober som elegant visade genom Vinogradov och medarbetare ¹⁵ och båda visningsalternativ och nackdelar. Livstids mätningar kräver ingen korrigering eftersom de är elektriskt förfaranden koncentrationsoberoende och kalibrering är ofta lättare och mer stabil. Dessutom är en enda färg används undvika komplikationer och den eventuella avvikelse som framkallas av det grönt till rött ratiometrisk avbildning. Men bara ett fåtal effektiva livstid sonder är tillgängliga medan ett stort utbud av intensitetsbaserade sonder är kommersiellt tillgängliga. Den utrustning som krävs för ratiometrisk avbildning är enklare och mer sannolikt finns på såtandard mikroskopi anläggning. Dessutom mätningar livstid är i sig långsamma och kan inte tillämpas för att följa snabba biologiska processer. Därför valet mellan dessa två metoder är starkt beroende av instrumentering som finns och på den specifika biologiska processen av intresse.

Även begreppsmässigt lika, är in vivo imaging mer utmanande än i cellkultur. Signal-brusförhållandet reduceras med spridning och växelverkan med vävnaderna kan påverka svaret hos sensorn. Dessutom, diffusion genom vävnaden och därmed läckage av indikatorn från regionen av intresse utgör en ytterligare fråga inte närvarande för intracellulära mätningar i kulturen. Av dessa skäl är avgörande val av indikatorn. Även för intracellulära mätningar flesta dendrimererna fungerar utmärkt (G4, G4-Ac, G6, PAMAM-PEG-hybrider), för in vivo avkänning rekommenderar vi användning av pegylerade dendrimers. ¹⁷ Indeed denna arkitektur är särskilt effektiva för detta ändamål av flera skäl: i) Den PEG öka storleken på dendrimeren och minskar dess läckage från vävnaden, ii) PEG linker minimerar quenching uppstått genom färgämne-färgämne och färgämnes dendrimer interaktioner och iii) PEG skyddar färgämnena från den vävnad som man undviker förlust av funktion ofta observeras efter vävnads injektion av sensorer. Kvaliteten på den pH-avkännande starkt beroende av framgångsrik injektion av en tillräcklig mängd av dendrimeren i vävnaden. När detta uppnåtts avbildningsförfarande och dataanalysen är liknande till vad som redan rapporterats för cellkulturen. Detta är ett tydligt bevis på sensor effektivitet in vivo och kan användas som en intern kontroll av indikator aktivitet innan någon mätning.

Vi tror att dessa resultat tillsammans med de detaljerade förfaranden som redovisas i detta arbete kommer att göra det möjligt att tillämpa dendrimer-baserade sensorer för att markera fysiological och sjukliga förändringar av pH i levande celler och in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500