Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Synthese, Cellular Levering en Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 2
1Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 2NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, 3NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 4IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

Fluorescentie sensoren zijn krachtige hulpmiddelen in life science. Hier beschrijven we een methode te synthetiseren en te gebruiken dendrimeer gebaseerde fluorescente sensoren pH meten in levende cellen en in vivo. De dendritische steiger versterkt de eigenschappen van geconjugeerde fluorescente kleurstoffen leidt tot betere detectie eigenschappen.

Abstract

De ontwikkeling van fluorescerende indicatoren betekende een revolutie voor de life sciences. Genetisch gecodeerde en synthetische fluoroforen met sensing capaciteiten kon de visualisatie van biologisch relevante soorten met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Synthetische kleurstoffen zijn van bijzonder belang zijn dankzij hun hoge tunability en het brede scala van meetbare analyten. Echter, deze moleculen lijden een aantal beperkingen met betrekking tot kleine molecule gedrag (slechte oplosbaarheid, moeilijkheden bij targeting, vaak geen ratiometrisch imaging toegestaan). In dit werk introduceren we de ontwikkeling van dendrimeer gebaseerde sensoren zijn en een procedure voor pH-meting in vitro, in levende cellen en in vivo. We kiezen dendrimeren als ideaal platform om onze sensoren voor hun vele gewenste eigenschappen (monodispersiteit, instelbare eigenschappen, multivalentie) dat ze een veel gebruikte steiger voor meerdere biomedische apparaten gemaakt. De vervoeging van fluorescerende pHindicatoren om de dendrimer schavot geleid tot een verbetering van hun sensing optredens. In het bijzonder dendrimeren vertonen verminderde cel lekkage, verbeterde intracellulaire targeting en laat ratiometrisch metingen. Deze nieuwe sensoren werden met succes toegepast om de pH te meten in levende HeLa cellen en in vivo in muizenhersenen.

Introduction

Het gebruik van fluorescerende moleculen aan specifieke biologisch relevante moleculen te labelen is volledig veranderd de manier waarop we bestuderen van biologische systemen. Widefield en confocale microscopie toegestaan ​​voor een real-time hoge-resolutie visualisatie van biologische processen en tegenwoordig de meest populaire technieken studeren biologische gebeurtenissen in vitro in cellen en in vivo. 1A relevante verbetering werd voorgesteld door de ontwikkeling van fluorescentie indicatoren , dwz kleurstoffen waarvan de fluorescentie afhankelijk is van de concentratie van een specifieke moleculaire entiteit. pH en calcium indicatoren bijzonder had een dramatisch effect op de studie van de celfysiologie door de enorme relevantie van H + en Ca2 +-ionen in de biologie. 2,3

De meeste van de detectie kleurstoffen vertonen vele intrinsieke beperkingen in hun kleine moleculen gedrag, zoals: i) moeilijkheden subcellulaire targeting, ii) een slechte oplosbaarheid in water en daardoor slechte biocompatibiliteit,. en iii) cel lekkage en dus weinig tijd-lapse imaging vermogen 4 Bovendien is het signaal van vele probes kunnen niet worden gecorrigeerd voor de afhankelijkheid van de kleurstof concentratie (non- ratiometrische beeldvorming) en derhalve een absolute meting in cellen of in vivo niet mogelijk.

We hebben recent beschreven een eenvoudige en effectieve methode om deze beperkingen op basis van de conjugatie van sensing kleurstoffen op een dendrimeer steiger. 5 Dendrimeren zijn monodisperse hypervertakte polymeren met zeer aantrekkelijke eigenschappen voor biologische toepassingen. 6 name dendritische verscheidene platforms ontwikkeld en gebruikt voor drug 7 en gen delivery. 8 Zeer recent verscheidene trad vanaf het potentieel van deze moleculen als matrix voor sensoren onderzoeken. 9,10,11

We hebben eerderbeschreven een eenvoudige synthetische route naar de functionalisering van verschillende polyamidoamine (PAMAM) scaffolds gebaseerd op NHS-geactiveerde esters. 12 Conjugaten kunnen in een enkele stap worden verkregen door middel van dialyse zoals het zuiveren. Interessant deze benadering kan eenvoudig worden toegepast op een verscheidenheid van dendritische of polymere scaffolds. 13,14

Om ratiometrisch beeldvorming dendrimeren bereiken waren dubbel-gelabeld met twee sets van kleurstoffen: i) een pH-indicator (dwz fluoresceïne) en ii) een pH-onafhankelijke fluorescerende groep (dwz rhodamine). Dit liet ons toe om nauwkeurige pH beeldvorming uitgevoerd als de verhouding tussen fluoresceïne en rhodamine alleen afhankelijk van de pH en niet meer van de concentratie van de probe. Een andere interessante benadering van dit probleem wordt vertegenwoordigd door het gebruik van levensduur probes. 15 Aangezien de levensduur niet afhankelijk probeconcentratie deze metingen geen ratiometrische correctie nodig. Echter, lifetime metingen vereisen een meer gecompliceerde instrumentale setup en hun temporele resolutie is suboptimaal voor snelle fysiologische processen, waardoor de beperking van hun potentiële toepassingen.

Om intracellulaire beeldvorming uitvoeren, moet de sonde over het plasmamembraan te leveren in het cytosol. Aangezien de dendrimeren niet doorlaatbaar membraan vanwege hun grootte en hydrofiliciteit kan intracellulaire afgifte worden bereikt door elektroporatie. Met deze techniek op grote schaal gebruikt in de biologie voor transfectie, gelabelde macromoleculen kunnen effectief in cellen afgeleverd hoge beeldkwaliteit voeren. Bovendien, met elektroporatie complicaties gerelateerd aan dendrimeer endocytose kunnen worden vermeden als de macromoleculen rechtstreeks geleverd aan het cytoplasma. Interessant na elektroporatie verschillende dendrimeren toont verschillende lokalisaties in de cellen zelfs bij gebreke van een specifieke targeting-sequentie. 5 Deze passievee gericht, alleen vanwege de fysisch-chemische eigenschappen van het dendrimeer, kan worden benut om organel-specifieke pH beeldvorming bereiken.

Ratiometrische beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie. Fluoresceïne en rhodamine, covalent geconjugeerd met de dendritische schavot werden afzonderlijk afgebeeld en een pixel-voor-pixel verhouding map is gemaakt. Verschillende procedures intracellulaire pH controle in levende cellen door middel van ionoforen gemeld. Ionoforen zijn kleine hydrofobe moleculen voor ionen over het plasmamembraan vervoer; ionoforen voor H + ion, zoals nigericine, zijn beschikbaar en kunnen worden gebruikt om dendrimeer gebaseerde sensoren kalibreren 16 Deze metingen toonden een lineaire respons op pH overeenkomstig hetgeen waargenomen. in vitro. Op basis van de kalibratie intracellulaire pH nauwkeurig kan worden gemeten. Deze metingen toonden aan dat dendrimer gebaseerde sensor een waardevol instrument in studie H + homeost kan zijnasis in levende cellen en pathologische processen die pH-regulering storingen betrekken.

We hebben onlangs aangetoond dat dendrimeer gebaseerde pH sensoren ook kan worden toegepast in vivo uitvoeren pH beeldvorming in de hersenen van verdoofde muizen. 17 Wegens de complexe omgeving van levende weefsels hoge kwaliteit in vivo detectie is technisch uitdagend. Hier laten we een gedetailleerde beschrijving van de experimentele procedure voor in vivo pH beeldvorming met nadruk van de cruciale kwesties die moeten worden aangepakt om een nauwkeurige pH beeldvorming te voeren in de hersenen. Twee-foton microscopie werd toegepast om twee belangrijke redenen: i) het gebruik van infrarood licht kan het ontbreken van weefselpenetratie standaard confocale microscopie overwinnen, ii) de algemene twee-foton absorptie van fluoresceïne en rhodamine toestaan ​​hun gelijktijdige excitatie vermijden van de complicaties met betrekking tot het gebruik van twee golflengten voor excitatie. pH-metingen in de hersenen van muizen warenmet succes uitgevoerd; sensoren gemakkelijk reageren op hypoxie veroorzaken verandering van de pH in de hersenen extracellulaire ruimte. Deze metingen tonen aan dat dendrimeer gebaseerde indicatoren met succes kunnen worden gebruikt om fysiologische en pathologische verandering van de pH in vivo in een diermodel markeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese van de sensoren

  1. In de volgende paragraaf geven we een procedure voor de vervoeging van pH indicatoren PAMAM dendrimeren. Hetzelfde protocol kan worden toegepast met minimale modificatie alternatieve amine-dragende dendrimeren. 5,17,13,14 handel verkrijgbare dendrimeren en pigmenten kunnen zonder verdere zuivering worden gebruikt.
  2. Los het dendrimeer in watervrij DMSO (50 uM eindconcentratie). Bereid 10 mM voorraad oplossingen van fluoresceïne-NHS en tetramethyl-rhodamine-NHS (TMR) in watervrij DMSO.
  3. In het dendrimeer oplossing de gewenste hoeveelheid fluoresceïne en TMR. De molaire verhouding in het mengsel de hoeveelheid kleurstoffen geladen op het dendrimeer weerspiegelen. Typically 1 ml G4 PAMAM dendrimeer oplossing in een microcentrifugebuis reageren met 8 eq (40 pl) van fluoresceïne en 8 eq (40 pl) van TMR. Roer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
  4. Verdun 1:10 met gedemineraliseerd water en laadt de reactiemengsel in een dialysezak (MWCO = 10 kDa). Dialyze gedurende 24 uur tegen gedemineraliseerd water vervangen vaak het water in het reservoir.
  5. Breng de oplossing een flesje en vriesdrogen om 24 uur. Een paars poeder worden verkregen. Weeg het verkregen vaste en oplossen in milliQ water bij een eindconcentratie van 10 uM. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C.

2. In Vitro pH-metingen

  1. Voor in vitro kalibratie wordt een oplossing van 500 nM dendrimeer in PBS (2 mM fosfaat) in een kwarts cuvet. Het gebruik van een zeer verdunde PBS-buffer (2 mM) om abrupte pH gedurende de titratie te vermijden wordt aanbevolen.
  2. Meet de emissiespectra van fluoresceïne (exc 488 nm) en TMR (exc 550 nm) en optimaliseren van de optische instellingen van de fluorimeter een goede signaal-ruisverhouding te bereiken.
  3. Voer een pH titratie door kleine hoeveelheden NaOH 0,1 N en HCl 0,1 N toe te voegen Na elke toevoeging schud de cuvettevoor het mengen, wacht 1 min voor equilibratie en wordt de pH met behulp van een micro-elektrode pH. Emissiespectra van fluoresceïne en TMR moeten worden geregistreerd voor elke stap zonder enige verandering in de optische instellingen.
  4. Teken de fluorescentie-intensiteit vs pH voor de titratie. De rhodamine signaal moet worden niet beïnvloed door de pH (<10%). De fluoresceïne signaal zou een sigmoïdale curve en wordt voorzien van een bindende model met pK = 6,4.

3. Celkweek en Elektroporatie

  1. Ontwikkel HeLa-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 E / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (Invitrogen). Houd celkweek bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer.
  2. Voor dendrimer elektroporatie, wanneer de cellen confluent, verwijder de media en was cellen met behulp van DPBS (Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing). Verwijder de DPBS en voeg trypsine-EDTA. Neutraliseren de trypzondigen door toevoeging dat een serum bevat, maar geen antibiotica. Centrifugeer bij 900-1200 rpm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de media en spoel de pellets met behulp DPBS.
  3. Tel de cellen en nemen 4 * 10 6 cellen. Centrifugeer bij 1.200-1.500 rpm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Resuspendeer de celpellet in 200 ui microporatie buffer (geleverd door de fabrikant microporator) en breng cellen een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  5. Voeg dendrimeer waterige oplossing in geresuspendeerde cellen. De hoeveelheid benodigde dendrimeer per monster is afhankelijk van het soort PAMAM (typisch 250 nM voor kationische en 2 uM voor neutrale dendrimeren).
  6. Voeg elektroporatie buffer (geleverd door de fabrikant microporator) in een microporatie buis. Pipetteer de cellen en dendrimeren mengsels met elektroporatie puntje van 100 ul volume-en kleinbedrijf. Plaats de microporator pipet in de pipet station. Stel de pols voorwaarde voor microporatie: impulsspanning = 1.005 V; puls width = 35 msec; puls aantal = 2.
  7. Na de puls overdracht cellen een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 1200 rpm om de overmaat dendrimeer in het medium te verwijderen. Plaat 10 ul van geëlektroporeerde cellen op 35 mm glazen bodem gerechten (Willco-dish GWSt-3522) met vers medium w / o antibiotica.

4. pH Sensing in Living HeLa cellen

  1. Afbeeldingscellen met een confocale microscoop 12 uur na elektroporatie.
  2. Standaard filter set voor fluoresceïne en rhodamine kunnen worden gebruikt. Als afstembare filters zijn beschikbaar set een groene kanaal 500-550 nm en een rode kanaal van 580 nm tot 650 nm. Excitatie bij 488 nm is optimaal voor fluoresceïne terwijl rodamine kon worden afgebeeld of met de 543nm of de 561 laserlijn.
  3. Focus op het model en pas lasers kracht en detectoren krijgen tot de signaal-ruisverhouding te maximaliseren. Als de elektroporatie was succesvol cellen moeten helder fluorescerend in beide kanalen. Delokalisatie afhankelijk van de grootte en lading van de dendrimeer gebruikt. Vaak een aantal lysosomale lokalisatie (klein perinucleaire blaasjes) aanwezig is als gevolg van endocytose of verkokering. Als het lysosomale lokalisatie overheerst, dus de meeste van de fluorescentie is gelokaliseerd binnen blaasjes en slechte signaal wordt waargenomen in de cytosol, dit betekent toxiciteit en meting worden weggegooid. Verwerven achtereenvolgens de twee kanalen, indien nodig verwerven meerdere afbeeldingen en het gemiddelde van de beelden om de beeldkwaliteit te verbeteren.
  4. Voor kalibratie klem cel pH buffers gebruikt met ionoforen bij verschillende pH en ten minste het 20 cellen per pH zoals hierboven beschreven. Voor een gedetailleerde beschrijving van de procedure en samenstelling van de buffers zie Bizzarri en medewerkers. 16 Wij stellen voor ten minste 5 punten met pH = 5,5 tot pH = 7,5 te meten. pH lager dan 6 zijn giftig voor cellen, maar getolereerd voor korte tijd, raden wij u aan de beelden zo snel mogelijk te verwerven. Als cellentonen tekenen van apoptose, gooi de cellen en opnieuw te starten.
  5. Gebruik ImageJ of analoge software voor data-analyse. Importeer de beelden van de groene en rode kanaal, aftrekken achtergrond en maak een pixel per pixel verhouding beeldvorming met de functie "Beeld calculator".
  6. Teken een gebied van belang (ROI) de gewenste en meet de intracellulaire groen naar rood verhouding. Analyseren van alle verkregen beelden en dan plot van de verhouding ten opzichte van de pH. In het bereik 5,5-7,5 indien de ontwikkeling lineair. De lineaire regressie van de verkregen punten de ijkcurve die wordt gebruikt om groen naar rood verhouding zetten tot pH geven.
  7. Als verdere controle verwerven verschillende onbehandelde cellen (geen ionoforen) en proberen om de pH te berekenen met de verkregen kalibratiecurve. Een waarde tussen 7,2 en 7,4 te worden verkregen.

5. In Vivo Monsterbereiding

  1. Experimenten werden uitgevoerd op C57BL/6J (mannen en vrouwen) tussen postnatale day 28 en 70. De muis verdoofd met een intraperitoneale injectie van Urethaan (bijvoorbeeld ethyl carbamaat) (20% g / v in fysiologisch zout, 20 mg / kg urethaan). Dieren werden opgeofferd na experimenteren met een overdosis urethaan gevolgd door een intracardiale injectie van dezelfde verdoving.
  2. Voer een intramusculaire injectie dexamethason natriumfosfaat (2 mg / kg lichaamsgewicht) aan de corticale stressrespons en cerebraal oedeem in de chirurgie.
  3. Scheren hoofd van het dier en 2,5% lidocaïne gel op de hoofdhuid.
  4. Gebruik een schaar om de klep van de huid die de schedel van beide hersenhelften te snijden
  5. Was de blootgestelde bot met zout en verwijder voorzichtig het periost behulp van een tang. Dit zal zorgen voor een betere basis voor lijm en tandheelkundige cement te houden met.
  6. Breng een op maat gemaakte stalen kop post met een centrale beeldvorming kamer en lijm deze met cyanoacrylaat in een vlak dat ongeveer parallel met de schedel over de corticale regio iBELANG en zet deze vast met witte tandheelkundige cement (Paladur).
  7. Bevestig de kop van de muis om een ​​craniotomie van 2-3 mm diameter geboord in het gebied van belang uitgevoerd.
  8. Probeer de verwarming van de cortex te minimaliseren tijdens de operatie, durale tranen, of bloeden.
  9. Houd de cortex superfused met steriele ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2PO 4, 1,3 mM MgSO4, 26 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl2, 15 mM glucose, 1,2 mM HEPES in gedestilleerd H2O , pH = 7,4).

6. pH beeldvorming in de hersenen van muizen

  1. Tijdens het experiment voor dierlijke ademhaling verstrekken van O 2-verrijkte lucht. Zuurstof wordt verrijkt tot 80%. O 2 partiële druk en debiet wordt vaak ingesteld om een goede ademhaling steun te verkrijgen. Houd lichaamstemperatuur constant op 37 ° C met een feedback regelbare verwarming deken.
  2. Bevestig het dier door de stalen paal kader van de doelstelling van een twee-foton beeldvorming setup.
  3. Om de sensor te injecteren in de hersenen cortex plaats een glazen pipet met een AgCl-elektrode (tip diameter 4 mm) met de dendrimeer oplossing (1 uM). De elektrode laten extracellulaire veldpotentialen opnemen.
  4. Met een micro-injectie setup steek de pipet in de cortex op ongeveer 150 micrometer diepte. Injecteer gedurende 1-2 minuten bij een druk van 0,5 psi.
  5. Optimaliseer de optische opstelling voor de beeldvorming. Laservermogen moet worden aangepast aan photobleaching en photodamage minimaliseren. Typisch laservermogen werken circa 20 mW en PMT versterking werd constant gehouden op 667 V omdat eerdere kalibraties gebleken dat deze spanning geeft de beste S / N verhouding.
  6. Voor grafische prikkelen de sensor bij 820 nm en sporen tegelijk fluoresceïne en rhodamine fluorescentie via standaard FITC en TRITC filters.
  7. Voor de tijd opgeloste metingen verwerven time lapse serie op 2 Hz.
  8. Voor achtergrondinformatie correctie verwerven van een donkere frame met de laser gesloten sluiter om de thermische ruis ontstaan ​​in de PMT's en het voetstuk meestal toegevoegd door de elektronica te meten.
  9. Voor data-analyse volgt dezelfde procedure vermeld in hoofdstuk 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont een schematische weergave van de vervoeging van sensing kleurstoffen aan verschillende dendritische steigers. De resulterende indicatoren kan worden verkregen in een eenvoudige synthetische stap uit in de handel verkrijgbare producten. Amine-dragende dendrimeren reageren met NHS-geactiveerde kleurstoffen in DMSO en gezuiverd door dialyse. Deze algemene procedure is al met succes gebruikt voor het labelen van verschillende dendrimeren: i) PAMAM dendrimeer generatie 2, 4 en 6; 12 gepegyleerde PAMAM dendrimeren 17 en PEG-dendritische hybriden 18. In tegenstelling dendrimeren tonen verschillende interacties met cellen en weefsels (lokalisatie, toxiciteit, permeabiliteit, diffusie) de selectie van de dendritische structuur is sterk gerelateerd aan de gewenste toepassing en met het model van belang.

De sensoren bestaan ​​uit twee sets van fluorescente kleurstoffen: i) pH indicatoren en ii) pH-ongevoelige groepen als interne gevonden. Althdoorgedreven een grote verscheidenheid van indicatoren en referenties zijn de beste resultaten verkregen met fluoresceïne en tetramethylrhodamine. De verhouding van de twee kleurstoffen kan eenvoudig worden afgesteld met verschillende molaire equivalenten in het reactiemengsel. Figuur 2 toont een typische in vitro titratie van een pH-sensor. Fluoresceïne en rhodamine kunnen afzonderlijk worden geëxciteerd bij 488 nm en 550 nm, respectievelijk, waardoor minimale overspraak tussen de twee kanalen. Zoals duidelijk blijkt, fluoresceïne (figuur 2A) toont een pH-afhankelijke gedrag tijdens rhodamine (Figuur 2A) signaal niet significant verandert de fysiologische pH. Daarom is de verhouding van deze twee signalen afhankelijk sensor concentratie maar alleen op pH. Deze concentratie onafhankelijkheid zal van groot belang zijn voor de biologische metingen als intracellulaire probeconcentratie niet kan worden gecontroleerd.

Voor levende cellen metingen de intracellulaire levering van de dendritische sensoren wordt bereikt via elektroporatie. Deze techniek wordt veel gebruikt in de biologie voor DNA transfectie en kan worden toegepast met minimale variaties van de fabrikant protocol. Door elektroporatie, de macromoleculen kunnen rechtstreeks aan het cytoplasma geleverde vermijden complicaties in verband met vesiculaire stelsel van endocytose. Figuur 3a toont confocale beelden van HeLa-cellen geëlektroporeerd met het dendrimeer sensoren. Een sterk signaal in beide fluoresceïne (groen, links) en rhodamine (rood, midden) wordt waargenomen. De twee signalen perfect colocalize waaruit de integriteit van de sensorstructuur. Een ratiometrische kaart wordt gereconstrueerd door de twee beelden delen pixel voor pixel en vertegenwoordigde een pseudokleur schaal (figuur 3a, rechts). pH klemmen met ionoforen werd uitgevoerd om de sensor respons in cellen kalibreren. Kalibratie met ionoforen is een gevestigde protocol, Several protocollen zijn uitvoerig beschreven en kan worden gebruikt zonder aanpassingen. Indicatoren 19 snel reageren pH met een verandering van de groene tot rode-verhouding als getoond in figuur 3b. Dit liet ons toe om een kalibratie-curve (figuur 3c) te verkrijgen voor nauwkeurige pH metingen. De lineaire trend in de ijking toont het vermogen van de sensor om te reageren op pH zonder verstoring van de cellulaire omgeving. De kalibratiecurve werd gebruikt om de pH van levende HeLa cellen zijn 7.4 en 4.8 respectievelijk bepalen cytoplasma en lysosomen. Deze resultaten zijn in goede overeenstemming met de literatuur.

Tot slot hebben we laten zien hoe dendrimer gebaseerde sensoren kunnen worden gebruikt voor in vivo beeldvorming. Dendrimeren kan gemakkelijk worden geïnjecteerd door het weefsel met een procedure vergelijkbaar met de veelgebruikte calcium indicatoren. 20 Eenmaal in het weefsel, de indicatoren diffunderen uiterst langzaam, allowing lange termijn imaging voordat volledige weefsel drainage. Typische resultaten worden getoond in Figuur 4. Fluoresceïne (groen) en rhodamine (rood) signalen gelijktijdig verkregen met 820 nm excitatie en de verhouding kaart is gebouwd op een pixel-voor-pixel basis Soortgelijke cellen metingen leven. Met name de indicatoren lokaliseren in de extracellulaire ruimte, de niet-fluorescerende gebieden in het beeld te identificeren cellulaire instanties of kleine bloedvaten. Om de sensor reactie op pH te controleren, hebben we voorgesteld het gebruik van hypercapnie. Inderdaad, is kooldioxide bekend veranderen de evenwichten van de carbonaat buffers in bloed en weefsels, waardoor een verzuring van het weefsel. 21 Zoals getoond in figuur 4b, de inhalatie van 30% CO2 is voldoende om een sterke reactie van het induceren sensor die volledig reversibel na re-ventilatie van de muis. Deze resultaten tonen het potentieel van dendrimer gebaseerde sensoren te markeren fysiologische en pathological veranderingen van de pH in levende cellen en in vivo.

Figuur 1
Figuur 1. Synthese van dendrimeer-gebaseerde sensoren Schematische weergave van dendrimeer-gebaseerde pH-sensor. Dezelfde procedure kan worden toegepast op vrijwel alle amine-dragende dendrimeer (links). Product werd verkregen via een enkele conjugatiereactie gevolgd door dialyse. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. In vitro pH titratie een dendrimeer-gebaseerde sensor. a) Reactie van de pH-indicator fluoresceïne en b) de iINTERNE referentie, rhodamine, toont geen verandering over de fysiologische pH-bereik.

Figuur 3
Figuur 3. Representatieve resultaten pH beeldvorming in levende HeLa cellen. a) Confocale beeldvorming van fluoresceïne kanaal (links), rhodamine kanaal (midden) en pH ratiometrische map (rechts). b) pH kalibratie met ionoforen vertegenwoordiger. c) ratiometrische kaarten cellen geklemd bij verschillende pH. . Overgenomen uit Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al. (2011) Dendrimeer-Based TL Indicatoren:.. In vitro en in vivo toepassingen PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Figuur 4
Figuur 4. pH beeldvorming in debrein van verdoofde muis. a) groene en rode kanaal (tegelijkertijd opgewonden bij 820 nm) en pH ratiometrisch kaart. b) typische reactie van de sensor op hypercapnie (30% CO 2). Aangepast van:. Overgenomen uit Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al. (2011) Dendrimeer-Based TL Indicatoren:.. In vitro en in vivo toepassingen PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritische stappen voor een succesvolle pH beeldvorming met dendrimeer gebaseerde sensoren zijn: i) het selecteren van de juiste dendritische steiger en het aantal indicatoren geconjugeerd aan het en ii) het optimaliseren van de sensor productietijd protocol in cellen of in vivo.

Het synthetische proces is redelijk eenvoudig en kan praktisch worden toegepast op elk amine dragende hypervertakte polymeer. De sensoren kunnen worden verkregen uit commercieel verkrijgbare dendrimeren en NHS-geactiveerde kleurstoffen in een enkele stap. Wij geloven dat deze modulair en eenvoudige procedure gunstig voor de verdere toepassing van dergelijke sensoren voor verschillende biologische vragen zijn. Zuivering kan effectief worden bereikt door dialyse de geconjugeerde kleurstoffen te verwijderen. De keuze van de dendritische steiger is cruciaal en afhankelijk van de specifieke gewenste toepassing. Verschillende dendrimeren is aangetoond bijzondere lokalisaties binnen cellen vanwege specifieke interacties met subcellular structuren. Neutraal dendrimeren (bijvoorbeeld geacetyleerd PAMAM G4) niet op enige interacties binnen cellen te laten zien en tonen een diffuse lokalisatie. Zo vormen ze een goede keuze voor een whole-cell imaging. Integendeel positief geladen dendrimeren van verschillende generaties (G2 G6) weergave elektrostatische interacties met negatief geladen biomoleculen (bijvoorbeeld RNA) resulteert in specifieke cellulaire lokalisatie. Kationische dendrimeren zijn dus ideaal voor organel-specifieke beeldvorming.

De keuze van het registrerende kleurstoffen kritisch. Verschillende pH indicatoren en pH-ongevoelige pigmenten met verschillende kleuren emissie en H + affiniteit (pK) beschikbaar. We probeerden verschillende kleurstof combinaties en de beste resultaten werden verkregen met fluoresceïne en tetramethylrhodamine. Dit paar een goede respons op pH in het fysiologische bereik (pK = 6,4) en is compatibel met gebruikelijke microscopie filter opstellingen. Voor verschillende eisen, zoals metings in verschillende pH-gebied, kunnen sommige optimalisatie nodig. Opmerkelijk, niet alle indicatoren behouden hun eigenschappen (helderheid, pK) op dendrimer vervoeging 5 Dit gedrag hangt zowel af van kleurstof en dendrimer bouwwerken;. Maar we waren in staat om een aantal indicatoren waar de fotofysische eigenschappen van de indicatoren zijn niet significant beïnvloed te melden. 17 Als dit het geval we voor het conjugeren van de kleurstoffen door een linker om dendrimeer-kleurstof interacties minimaliseren. Verschillende reactieve kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar met alkyl spacers 22 of PEG alternatieve linkers worden gebruikt. Ook het aantal indicatoren en de verhouding indicatoren naar referentie kleurstoffen op het schavot belangrijk. De ideale verhouding hangt af van de spectrale gevoeligheid van de microscopie spantoestand en het biologische monster plaats 5,17. Hoewel sommige problemen kan nodig zijn, zal het zeer gemakkelijk en snel syntheseprocedure aanzienlijk vergemakkelijkt het proces. Eindelijkde mate van functionalisering van het dendrimeer, dat is het percentage eindgroepen van het dendrimeer die zijn geconjugeerd aan kleurstoffen, kunnen de prestaties van de indicatoren beïnvloeden. Om oplosbaarheid probleem dat we suggereren functionaliserende ongeveer 10% -20% van de dendrimer eindgroepen voorkomen. Bij gepegyleerde dendrimeren Vanwege PEG bijdrage oplosbaarheid, kan een volledige functionalisering bereikt. Dit kan ook de ongewenste aanwezigheid van FRET en het doven andere verschijnselen bij de geconjugeerde kleurstoffen beperken.

Dendrimeren niet celpermeable, maar intracellulaire afgifte kan worden bereikt door elektroporatie. We gebruikten DNA-transfectie fabrikant protocol voor de cellijn van belang, zonder verdere aanpassingen. Een belangrijke parameter is de concentratie van het dendrimeer in de elektroporatie buffer, met name bij indicatoren onvoldoende helderheid of dendrimeren die bij hoge concentraties toxisch voor cellen zijn. Lage concentrations van dendrimer zal resulteren in een slecht signaal in de cellen, terwijl hoge concentraties toxiciteit veroorzaakt en celdood. De ideale concentratie is afhankelijk van de dendrimer / indicator pair alsook op de beeldvorming setup vrij en kan wat optimalisatie nodig. Indien een electroporator niet beschikbaar is in het lab, kan micro-injectie een goed alternatief vormen. Dit is echter een eencellige techniek en de verwerving van een aanzienlijk aantal cellen afgebeeld omslachtiger maken.

De sensoren beeldopname is zeer flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende microscopie opstellingen. We eerder gemeld het gebruik van de sensoren onder een confocale systeem acusto afstembare optische filters 5,17 maar standaard FITC / TRITC filtersets kunnen ook worden gebruikt. Wanneer een optimale intracellulaire concentratie verkregen, pH beeldvorming eenvoudig. Wij stellen voor het optimaliseren van de laser intensiteit, pinhole en detectoren te krijgen over een groot bereik van de sensor intracellulaireconcentraties voordat u de pH-kalibratie met ionoforen. Als dezelfde microscopie instelling wordt gebruikt onder dezelfde omstandigheden de kalibratie worden gebruikt voor alle experimenten. Hier stellen we ratiometrisch beeldvorming sensor concentratie afhankelijkheid en artefacten te vermijden. Een andere interessante methode om dat te bereiken wordt voorgesteld door-looptijd gebaseerde probes elegant getoond door Vinogradov en medewerkers 15 en beide opties beeldscherm en nadelen. Lifetime metingen geen correctie nodig omdat ze intrinsiek concentratie-onafhankelijk en kalibratie procedures zijn vaak makkelijker en stabieler. Bovendien wordt een enkele kleur gebruikt vermijden van de complicaties en de eventuele afwijking veroorzaakt door de groene naar rode ratiometrische beeldvorming. Maar slechts weinig effectieve levensduur sondes zijn beschikbaar, terwijl een groot scala aan intensiteit gebaseerde probes zijn commercieel toegankelijk. De voor ratiometrische beeldvormingsapparatuur eenvoudiger en vaker in alstandaard microscopie faciliteit. Bovendien levensduurmetingen intrinsiek traag en kan niet worden toegepast om snelle biologische processen volgen. Daarom is de keuze tussen deze twee technieken sterk afhankelijk van de beschikbare instrumentatie en de specifieke biologische processen plaats.

Hoewel conceptueel vergelijkbaar, in vivo beeldvorming is een grotere uitdaging dan in de celkweek. Signaal-ruisverhouding verminderd door verstrooiing en de interacties met de weefsels kan de reactie van de sensor te beïnvloeden. Bovendien diffusie door het weefsel en dus lekkage van de indicator van het gebied van belang vormen een extra probleem niet intracellulaire metingen in cultuur aanwezig. Daarom is de keuze van de indicator cruciaal. Terwijl voor intracellulaire metingen de meeste van de dendrimeren werken uitstekend (G4, G4-Ac, G6, PAMAM-PEG hybriden), voor in vivo sensing adviseren wij het ​​gebruik van gepegyleerde dendrimeren. 17 IndBehoefte deze architectuur is bijzonder effectief voor dit doel om verschillende redenen: i) de PEG de grootte van het dendrimeer en vermindert het lekken uit het weefsel, ii) de PEG-linker minimaliseert quenching gevolg van kleurstof-kleurstof en kleurstof-dendrimeer interacties iii) de PEG schermt de kleurstoffen uit het weefsel vermeden het functieverlies vaak waargenomen na weefselinjectieplaats sensoren. De kwaliteit van de pH sensing sterk afhankelijk van de succesvolle injectie van een voldoende hoeveelheid dendrimeer in het weefsel. Wanneer dit gebeurt de beeldvormingsprocedure en gegevensanalyse zijn vergelijkbaar met wat reeds gerapporteerd voor de celkweek. Dit is een duidelijk bewijs sensor effectiviteit in vivo en kan worden gebruikt als een interne controle indicator activiteit vóór de meting.

Wij geloven dat deze resultaten samen met de gedetailleerde procedures die in dit werk zal de toepassing van dendrimer gebaseerde sensoren te Phys markereniological en pathologische veranderingen van de pH in levende cellen en in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Standaard: auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Nuttige discussies met Isja de Feijter en Matt Baker worden bedankt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).

Tags

Chemie onderzoekstechnieken Chemie en Materialen (algemeen) dendrimer fluorescentie sensoren pH levering confocale
Synthese, Cellular Levering en<em&gt; In vivo</em&gt; Toepassing van Dendrimeer-gebaseerde pH Sensoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi,… More

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter