Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Синтез, Сотовый Доставка и Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 2
1Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 2NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, 3NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 4IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

Датчики флуоресценции являются мощными инструментами в области наук о жизни. Здесь мы опишем методику синтезировать и использовать дендримерных основе датчиков люминесцентные для измерения рН в живых клетках и в естественных условиях. Дендритных леса усиливает свойства сопряженных флуоресцентные красители, ведущих к улучшению свойств зондирования.

Abstract

Развитие люминесцентных индикаторов представляет собой революцию в области наук о жизни. Генетически кодируется и синтетические флуорофоры с возможностями зондирования позволило визуализировать биологически соответствующих видов с высоким пространственным и временным разрешением. Синтетические красители представляют особый интерес благодаря их высокой управляемость и широкий спектр измеряемых веществ. Тем не менее, эти молекулы страдают некоторые ограничения, связанные с поведением малой молекулы (плохая растворимость, трудности в адресности, часто не логометрический изображений не допускается). В этой работе мы вводим развитие датчиков дендримерных основе и представить процедуру измерения рН в пробирке, в живых клетках и в естественных условиях. Мы выбираем дендримеров как идеальную платформу для наших датчиков для их многих желательных свойств (монодисперсности, настраиваемые свойства, многозначности), которые сделали их широко используется эшафот в течение нескольких биомедицинских устройств. Сопряжение люминесцентных рНпоказатели с дендримером эшафот привело к усилению их исполнений зондирования. В частности дендримеров экспонат снижается утечки клеток, улучшение внутриклеточного адресности и позволяют логометрических измерений. Эти новые датчики были успешно использованы для измерения рН в живых HeLa клетки и в естественных условиях в мозге мыши.

Introduction

Использование флуоресцентных молекул маркировать определенные биологически-соответствующие молекулы полностью изменил способ, которым мы учиться биологических систем. Широкоугольный и конфокальной микроскопии позволило в режиме реального времени с высоким разрешением визуализации биологических процессов и в настоящее время являются одними из самых популярных методов для изучения биологических событий в пробирке, в клетках и в естественных условиях. 1 Соответствующий улучшение представляли разработки показателей флуоресценции , т.е. красителей, флуоресценция зависит от концентрации специфического молекулярного лица. рН и кальция показатели, в частности, имел огромное влияние на изучении физиологии клетки из-за огромного актуальности 2 + в биологии Н + и Ca. 2,3

Тем не менее, большинство из красителей зондирования присутствующих несколько внутренние ограничения, связанные с их небольшой поведения молекул, таких как: I) трудности в субклеточной targetiнг; II) плохой растворимостью в воде и, следовательно, плохой биосовместимостью;. и III) утечка клеток и, следовательно, отсутствие долгого изображений возможностью покадровой 4 Кроме того, сигнал из множества зондов не может быть исправлена ​​в зависимости от концентрации красителя (не изображений пропорциональный) и, следовательно, абсолютное измерение в клетках или в естественных условиях невозможно.

Мы недавно описал простой и эффективной методологии преодоления этих ограничений, на основе сопряжения красителей зондирования на дендримеров эшафот. 5 Дендримеры Монодисперсные гиперразветвленные полимеры с очень привлекательных свойств для биологических применений. 6 В частности несколько дендритные архитектуры были разработаны и используются для приготовления 7 и доставки генов. 8 Только в самое последнее несколько групп начали исследовать потенциал этих молекул как эшафот для сенсорных устройств. 9,10,11

Мы ранееописан простой путь синтеза по отношению к функционализации другой полиамидоамина (РАМАМ) строительные леса, основанный на NHS-активированных сложных эфиров. 12 Конъюгаты могут быть получены в одну стадию путем диализа, как только очистки. Интересно этот подход может быть легко применена к различным дендритных или полимерных каркасов. 13,14

Для достижения логометрических дендримеров изображений были дважды меченных с двумя наборами красителей: I) индикаторных рН (т.е. флуоресцеин) и б) рН-независимый флуоресцентный фрагмент (т.е. родамин). Это позволило выполнить точный изображений рН как отношение между флуоресцеин и родамин только зависит от рН и не более от концентрации зонда. Другой интересный подход к этому вопросу представлена ​​использования в течение жизни на основе зондов. 15 Как время жизни не зависит от концентрации зонда эти измерения не нужен логометрические коррекции. Тем не менее, LIFИзмерения Etime требуют более сложный инструментальную установки и их временное разрешение является оптимальным для быстрых физиологических процессов, тем самым ограничивая их возможности применения.

Для того чтобы выполнить внутриклеточного изображений, зонд должен быть доставлен через плазматическую мембрану в цитозоль. Поскольку дендримеры не проницаемой мембраны из-за их размера и гидрофильности, внутриклеточной доставки может быть достигнуто путем электропорации. С помощью этой методики, широко используемые в биологии для трансфекции, меченные макромолекулы могут быть эффективно доставлены в клетки, чтобы выполнить высокое качество изображения. Кроме того, при электропорации осложнений, связанных с дендримера эндоцитоза можно избежать как макромолекулы доставляется в цитоплазме. Интересно после электропорации различных дендримеров показывает различные локализации внутри клеток, даже в отсутствии каких-либо конкретных таргетирования последовательности. 5 этого Passivэ ориентации, только за счет физико-химических свойств дендримере, могут быть использованы для достижения органеллоспецифичными изображений рН.

Логометрический изображений можно выполнить с помощью конфокальной микроскопии. Флуоресцеин и родамин, ковалентно конъюгирован с дендритной строительных лесов, были отображены отдельно и пиксель-на-пиксель соотношение карта была создана. Несколько процедур по контролю внутриклеточного рН в живых клетках с помощью ионофоров не поступало. Ионофоры небольшие гидрофобные молекулы, способные транспортировать ионы через плазматическую мембрану; ионофоры для Н + ионов, таких как нигерицина, доступны и могут быть использованы для калибровки датчиков на основе дендримеров 16 Эти измерения показали линейную реакцию на рН аналогично тому, что наблюдалось. в пробирке. На основе калибровочной внутриклеточного рН может быть точно измерена. Эти измерения показали, что дендример основе датчика может быть ценным инструментом в исследовании Н + homeostASIS в живых клетках и патологических процессов, которые связаны сбои регулирования рН.

Недавно мы показали, что дендример основе датчики рН также может быть применен в естественных условиях, выполняя изображений рН в головном мозге анестезированных мышах. 17 Из-за сложной среде живых тканей высокого качества в естественных зондирования является технически сложной задачей. Здесь мы показываем, подробное описание экспериментальной процедуры в естественных условиях рН изображений с акцентом из важнейших вопросов, которые будут рассматриваться для выполнения точной визуализации рН в мозге. Двухфотонное микроскопии был принят на работу по двум основным причинам: я) использование инфракрасного света позволяет преодолеть отсутствие проникновения в ткани стандартного конфокальной микроскопии; II) широкий двухфотонного поглощения флуоресцеина и родамина позволит избежать их одновременное возбуждение осложнения, связанные с использованием двух длин волн возбуждения. измерения рН в мозге мыши былиуспешно проведены; датчики легко реагировать на гипоксию вызывают изменение рН в мозге внеклеточного пространства. Эти измерения показывают, что дендримеров на основе показателей может быть успешно использован для выделения физиологических и патологических изменение рН в естественных условиях в животной модели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Синтез датчиков

  1. В следующем разделе мы предлагаем процедуру сопряжения показателей рН в РАМАМ дендримеров. То же протокол может быть применен с минимальными изменениями в альтернативных дендримеров амин несущих. 5,17,13,14 Коммерчески доступные дендримеров и красители могут быть использованы без дополнительной очистки.
  2. Растворить дендример в безводном ДМСО (50 мкМ конечная концентрация). Подготовка 10 мМ исходные растворы флуоресцеина-NHS и тетраметил-родамина-NHS (ПМР) в безводном ДМСО.
  3. Добавить к раствору дендримера нужное количество флуоресцеина и ПМР. Молярное соотношение в смеси будет отражать количество красителей, загруженных на дендримера. Обычно 1 мл G4-ПАМАМ-дендримера раствора в микроцентрифужных трубки подвергают взаимодействию с 8 EQ (40 мкл) флуоресцеина и 8 EQ (40 мкл) ПМР. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов.
  4. Развести 1:10 деионизированной водой и загрузить реакциюСмесь в диализный мешок (MWCO = 10 кДа). Диализировать в течение 24 ч против деионизированной воды, заменяя часто воду в резервуар.
  5. Переносят раствор во флакон и подвергают сублимационной сухой в течение 24 часов. Фиолетовый порошок должен быть получен. Вес полученного твердого вещества и растворить его в MilliQ воде до конечной концентрации 10 мкМ. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С.

2. In Vitro рН Измерения

  1. Ибо в пробирке калибровки приготовить раствор 500 нм из дендримере в PBS (2 мМ фосфата) в кварцевую кювету. Использование очень разбавить PBS буфера (2 мм), чтобы избежать резких изменений рН в ходе титрования рекомендуется.
  2. Измерьте спектры излучения флуоресцеина (отл 488 нм) и TMR (отл 550 нм) и оптимизировать оптические настройки флуориметре добиться хорошего отношения сигнал-шум.
  3. Выполните рН титрование, добавляя небольшие объемы NaOH 0,1 н и HCl 0,1 N. После каждого добавления встряхнуть кюветудля смешивания, подождите 1 мин для уравновешивания и измеряют рН с помощью рН микроэлектрода. Спектры излучения флуоресцеина и ПМР должны регистрироваться для каждого шага без каких-либо изменений в оптических параметров.
  4. Участок интенсивность флуоресценции против рН для титрования. Сигнал родамина не должны влиять рН (<10%). Сигнал флуоресцеина должен быть сигмоидальная кривая и должны быть оснащены одним связывания модели с PK = 6,4.

3. Культура клеток и Электропорацию

  1. Выращивают клетки HeLa в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина (Invitrogen). Держите культуры клеток при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 атмосферы.
  2. Для дендримера электропорации, когда клетки сливающийся, вынуть, и промыть клетки с помощью DPBS (Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором). Снимите DPBS и добавить трипсин-ЭДТА. Нейтрализовать Trypгрешить, добавив среду, содержащую сыворотку, но не антибиотики. Центрифуга при 900-1200 оборотов в минуту в течение 2 мин при комнатной температуре. Выньте материал и промойте гранул с помощью DPBS.
  3. Граф клеток и взять 4 * 10 6 клеток. Центрифуга при 1200-1500 оборотов в минуту в течение 2 мин при комнатной температуре.
  4. Ресуспендируют клеточный осадок в 200 мкл microporation буфера (предоставленной microporator производителя) и передать клетки в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  5. Добавить дендример водного раствора в ресуспендировали клеток. Количество требуемого дендримера в образце зависит от типа ПАМАМ (обычно 250 нм для катионных и 2 мкМ для нейтральных дендримеров).
  6. Добавить электропорации буфера (предоставляется microporator производителя) в microporation трубки. Внесите клетки и дендримеров смеси с электропорации оконечности 100 мкл объема размера. Вставьте microporator пипетку в пипетки станции. Установите условие импульса для microporation: импульсное напряжение = 1005 В; импульс WIDй = 35 мсек; число импульсов = 2.
  7. После передачи импульсов клетки в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и центрифуги клеток течение 5 мин при 1200 оборотов в минуту, чтобы удалить избыток дендримере в среде. Пластина 10 мкл электропорации клеток на 35 мм с прозрачным дном посуды (WILLCO блюдо GWSt-3522) свежей средой без антибиотиков.

4. рН зондирования в Жилая клеток HeLa

  1. Клетки изображения с конфокальной микроскопии 12 часов после электропорации.
  2. Стандартный набор фильтров для флуоресцеина и родамина могут быть использованы. Если настраиваемые фильтры доступны множество зеленый канал от 500 - 550 нм и красный канал от 580 нм до 650 нм. Возбуждение на 488 нм является оптимальным для флуоресцеина в то время как родамин могли быть отображены либо с 543nm или 561 лазерной линии.
  3. Сосредоточьтесь на образец и настроить лазеры власть и детекторы получить максимально отношение сигнал-шум. Если электропорации был успешно клетки должны быть ярко флуоресцентный в обоих каналах.локализация зависит от размера и заряда используемого дендримера. Часто некоторые лизосомные локализации (небольшие перинуклеарные пузырьки) присутствует из-за эндоцитоза или раздробленности. Если локализация лизосомные преобладает, то есть большую часть флуоресценции локализуется внутри пузырьков и бедными сигнал наблюдается в цитоплазме, это означает, токсичность и измерения должны быть отброшены. Приобретать последовательно два канала, при необходимости приобрести несколько фотографий и усреднить изображения для улучшения качества изображения.
  4. Для калибровки рН зажим клеток с использованием буфера с ионофоров при различных рН и получить по крайней мере 20 клеток на рН, как описано выше. Для более подробного описания процедуры и состав буферов см. Bizzarri и Коллеги. 16 Мы предлагаем для измерения по крайней мере 5 очков от рН = 5,5 до рН 7,5. рН ниже 6 являются токсичными для клеток, но терпимо для короткий промежуток времени, мы предлагаем приобрести изображения как можно быстрее. Если клеткидемонстрировать признаки апоптоза, отказаться от клетки и перезапустить.
  5. Используйте ImageJ или аналогичное программное обеспечение для анализа данных. Импорт образы зеленого и красного канала, вычесть фон для создания пиксель за пикселем соотношении изображений с помощью инструмента "калькулятор изображения".
  6. Нарисуйте область интереса (ROI) Выбор нужного ячейку и измерения внутриклеточного зеленый-в-красный соотношение. Анализ все изображения, полученные и затем участок соотношение по сравнению с рН. В диапазоне от 5,5 до 7,5 тенденция должна быть линейной. Линейный форме точек, полученных даст калибровочную кривую, которая будет использоваться для преобразования зеленый-к-красный соотношение к рН.
  7. В качестве дополнительного контроля приобрести несколько необработанных клеток (не ионофоры) и попытаться вычислить рН с полученным калибровочной кривой. Значение между 7,2 и 7,4 должна быть получена.

5. В Vivo Подготовка образцов

  1. Эксперименты проводились на C57Bl/6J (мужчины и женщины) между послеродовой гай 28 и 70. Под наркозом мыши путем внутрибрюшинной инъекции уретана (т.е. этил карбамата) (20% вес / объем в физиологическом растворе, 20 мг / кг уретана). Животных умерщвляли после эксперимента с передозировкой уретана, за которым следует внутрисердечной инъекции того же анестезией.
  2. Выполнение внутримышечной инъекции дексаметазона натрия фосфата (2 мг / кг массы тела), чтобы уменьшить реакцию коры головного мозга стресс и отек мозга во время операции.
  3. Бритье голову животного и применять 2,5% геля лидокаина на кожу головы.
  4. Используйте ножницы, чтобы вырезать лоскут кожи, покрывающий череп обоих полушариях
  5. Вымойте подвергается кость физиологическим раствором и осторожно удалите надкостницы с помощью щипцов. Это обеспечит лучшую основу для клея и зубным цементом придерживаться с.
  6. Нанесите на заказ стали головной пост с центральным изображения камеры и приклейте ее с цианоакрилата в плоскости приблизительно параллельно с черепом над корковой области Iпроценты и зафиксировать его на месте с белым зубным цементом (Paladur).
  7. Закрепите голову мыши, чтобы выполнить трепанации черепа 2-3 мм в диаметре, пробуренной над интересующей области.
  8. Постарайтесь свести к минимуму нагрев коры во время операции, дуральных слез, или кровотечения.
  9. Держите кору орошали стерильной ACSF (126 мм NaCl, 3 мМ KCl, 1,2 мМ KH 2 PO 4, 1,3 мМ MgSO 4, 26 мМ NaHCO 3, 2,4 мМ CaCl 2, 15 мМ глюкозы, 1,2 ммоль HEPES в дистиллированной H 2 O , рН = 7,4).

6. рН изображений в мозга мыши

  1. В ходе эксперимента помощи дыхания животных, обеспечивающей O 2-обогащенный воздух. Кислород, обогащенного до 80%. O 2 парциальное давление и поток часто регулируется для достижения правильного помощи дыхания. Поддерживать постоянную температуру тела при 37 ° С с обратной контролируется отопления одеяло.
  2. Fix животное через стальную должности по цели двух-фотоНастройка н визуализации.
  3. Для того, чтобы придать датчик в коре головного мозга загрузить стеклянную пипетку, содержащий электрод AgCl (диаметр наконечника 4 мм) с раствору дендримера (1 мкМ). Электрод позволит записывать внеклеточные потенциалы полей.
  4. С установкой микроинъекции пипетки вставить в коре на глубине приблизительно 150 мкм. Введите в течение 1-2 мин при давлении 0,5 бар.
  5. Оптимизация оптической настройки для работы с изображениями. Мощность лазера должна быть скорректирована, чтобы минимизировать фотообесцвечивания и фотоповреждения. Обычно мощность лазера используется около 20 мВт и ПМТ усиления оставалось постоянным и равным 667 V так как предыдущие калибровки показали, что это напряжение дает наилучшее соотношение сигнал / шум.
  6. Для визуализации возбуждения датчика при 820 нм и обнаружить одновременно флуоресцеина и флуоресценции родамина через стандартные FITC и TRITC фильтров.
  7. Для времени решены измерения приобрести временные ряды покадровой с частотой 2 Гц.
  8. Для коррекции фон приобретают темно кадр с Ласег затвора закрыт для измерения среднего теплового шума, возникающего в ФЭУ и пьедестала обычно добавляются электроникой.
  9. Для анализа данных следовать той же процедуре сообщается в разделе 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показано схематическое представление конъюгации зондирования красители для различных дендритных лесов. Полученные показатели могут быть получены в одном удобном стадии синтеза из коммерчески доступных продуктов. Амин-дендримеры, имеющие подвергают взаимодействию с NHS-активированных красителей в ДМСО и очищали с помощью диализа. Эта общая процедура уже успешно используется для маркировки нескольких дендримеров: я) поколение РАМАМ Дендример 2, 4 и 6; 12 пегилированные РАМАМ дендримеров 17 и ПЭГ-дендритные гибриды 18. В отличие дендримеров показывают различные взаимодействия с клеток и тканей (локализация, токсичность, проницаемость, диффузии) выбор дендритной структуры тесно связана с нужным приложением и к образцу, представляющих интерес.

Датчики состоят из двух наборов флуоресцентных красителей: Я) показатели рН и II) рН-нечувствительным фрагменты, выступающие в качестве внутренние ссылки. Althух большое разнообразие показателей и ссылки доступны, лучшие результаты были получены с флуоресцеина и тетраметилродамин. Соотношение двух красителей может быть настроена просто с использованием различных молярных эквивалентов в реакции. Рисунок 2 показывает типичную титрование в пробирке датчика рН. Флуоресцеин и родамин может быть независимым возбуждением при 488 нм и 550 нм, соответственно, что позволяет минимально перекрестные помехи между двумя каналами. Как можно ясно увидеть, флуоресцеин (2А) показывает поведение рН-зависимую в то время как родамин (2А) сигнал не изменяется значительно в физиологическом интервале значений рН. Таким образом, соотношение этих двух сигналов не зависит от концентрации датчика но только на рН. Эта концентрация независимость будет иметь большое значение для биологических измерений, концентрация внутриклеточного зонд не может управляться.

Для живых клеток измерений ВВЕДЕНИбесклеточной доставка дендритных датчиков достигается с помощью электропорации. Эта методика широко используется в биологии для трансфекции ДНК и могут быть применены с минимальными изменениями по протоколу производителя. Через электропорации, макромолекулы могут быть доставлены непосредственно в цитоплазму, избегая каких-либо осложнений, связанных с везикулярного системы эндоцитоза. 3а показывает конфокальные образы HeLa клеток электропорации с датчиками дендримерных. Сильный сигнал в обоих флуоресцеина (зеленый, слева) и родамина (красный, средний) наблюдается. Два сигнала совершенно колокализуются демонстрируя целостность структуры датчика. Логометрический карту реконструируется путем деления два изображения пиксель за пикселем и представлены с псевдоцветовую шкала (рис. 3а, справа). рН была выполнена зажима с ионофоров, для калибровки датчика ответ внутри клеток. Калибровка с ионофоров является хорошо установленным протоколом, СевRAL протоколы были широко описаны и могут быть использованы без модификаций. 19 Показатели легко реагировать на рН с изменением зеленой к красной соотношении, как показано на фиг.3b. Это позволило нам получить калибровочной кривой (рис. 3в) для точных измерений рН. Линейный тренд при калибровке демонстрирует способность датчика реагировать на рН без возмущению от клеточной среде. Калибровочная кривая была использована для определения значения рН живых клеток HeLa быть 7,4 и 4,8 для цитоплазме и лизосомах, соответственно. Эти результаты находятся в хорошем согласии с литературой.

Наконец, мы показали, как датчики на основе дендримеров могут быть использованы для естественных изображений. Дендримеры может быть легко введен через ткань с процедурой, очень похожей на широко используемых показателей кальция. 20 После того, как в ткани, показатели диффузной крайне медленно, allowinг долгосрочный изображений до полного осушения ткани. Типичные результаты показаны на рисунке 4. Флуоресцеин (зеленый) и родамина (красный) сигналы были одновременно получены при возбуждении 820 нм и отношение ее создавали по принципу пиксель за пикселем, похожие на живые клетки измерений. Следует отметить, что показатели локализовать в межклеточное пространство; не-люминесцентные участки изображения, определить клеточные органы или мелкие кровеносные сосуды. Для того чтобы проверить реакцию датчика на рН, мы предложили использовать гиперкапнии. Действительно, диоксид углерода, как известно, изменяют равновесий карбонатных буферов в крови и тканях, что приводит к закислению тканей. 21 Как показано на фиг.4b, вдыхание 30% CO 2, достаточно, чтобы вызвать сильную реакцию датчик, который является полностью обратимым при повторном вентиляции мыши. Эти результаты демонстрируют потенциал датчиков дендримерных основе, чтобы выделить физиологические и годовыхthological изменения рН в живых клетках и в естественных условиях.

Рисунок 1
Рисунок 1. Синтез дендримеров на основе датчиков схематическое представление дендримера на основе датчика рН. Такую же процедуру можно применить к практически во всех амин-содержащего дендримера (слева). Продукт был получен через единый реакции конъюгации с последующим диализом. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Экстракорпоральное рН титрования для датчика дендримеров основе. а) Реакция индикатора рН флуоресцеина и б) яnternal ссылка, родамин, при которой отсутствует изменение над физиологическом интервале значений рН.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель результаты визуализации рН в живых HeLa клетки. а) конфокальной визуализации флуоресцеина канала (слева), родамина канал (среднего) и рН логометрический карте (справа). б) калибровка рН с ионофоров.) представитель логометрических карт клеток зажатых в различных рН. . Печатается по тексту Альбертацци L, BRONDI M, Павана GM, Сато СС и др. (2011) Дендримеров основе Люминесцентные показатели:.. В пробирке и в естественных приложений PLoS ONE 6 (12), e28450. DOI: 10.1371/journal.pone.0028450

Рисунок 4
Рисунок 4. рН изображений вМозг наркозом мыши. а) зеленый и красный канал (одновременно возбуждается на 820 нм) и рН логометрический карту. б) типичный ответ датчика к гиперкапнии (30% СО 2). По материалам:. Воспроизводится по Альбертацци L, BRONDI M, Павана GM, Сато СС и др. (2011) Дендримеров основе флуоресцентных износа:.. В пробирке и в естественных приложений PLoS ONE 6 (12), e28450. DOI:. 10.1371/journal.pone.0028450 Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги для успешного рН изображений с датчиками дендримеров на основе являются: I) выбор правильного дендритной строительных лесов и количество показателей, конъюгированных с ним и б) оптимизация протокола доставки датчика в клетках или в естественных условиях.

Синтетический процедура довольно легко и могут быть применены практически к каждому амина несущих разветвленного полимера. Датчики могут быть получены из коммерчески доступных дендримеров и NHS-активированных красителей в одну стадию. Мы считаем, что это модульная и простая процедура будет полезно для дальнейшего применения таких датчиков для различных биологических вопросов. Очистка может быть эффективно достигнуты путем диализа для удаления неконъюгированного красители. Выбор дендритной строительные леса, имеет решающее значение и зависит от конкретного применения желательно. Различные дендримеров как было показано, имеют своеобразные локализации внутри клеток за счет специфических взаимодействий с сubcellular структур. Обычный дендримеров (например ацетилированный ПАМАМ G4) не показывают взаимодействие внутри клеток и показать диффузный локализацию. Таким образом, они представляют собой хороший выбор для визуализации целых клеток. Напротив положительно заряженные дендримеров разных поколений (с G2 на G6) дисплей электростатические взаимодействия с отрицательно заряженными биомолекул (т.е. РНК) в результате специфического клеточного локализации. Катионные дендримеров, таким образом, идеально подходит для органелл конкретных изображений.

Выбор красителей зондирования является критическим. Некоторые показатели рН и рН-нечувствительным красители с различными эмиссии цвета и Н + сродства (рК) имеются. Мы попробовали многие комбинации различных красителей и лучшие результаты были получены с флуоресцеина и тетраметилродамин. Эта пара обеспечивает хороший ответ на рН в физиологическом диапазоне (PK = 6.4) и совместим с наиболее часто используемых настроек микроскопии фильтров. Для различных требований, таких как измеренияс в другом диапазоне рН, некоторые оптимизации могут быть необходимы. Примечательно, что не все показатели сохраняют свои свойства (яркость, PK) на дендримеров сопряжения 5 Такое поведение зависит как от красителя и дендримерных структур;. Однако, мы смогли сообщить несколько показателей, где фотофизические свойства показателей существенно не затронуты. 17 Если это так, мы предлагаем конъюгации красители через линкер с целью минимизации взаимодействий дендример-краситель. Несколько активные красители являются коммерчески доступными алкильными распорок 22 или в альтернативных линкеров ПЭГ могут быть использованы. Также количество показателей и соотношения показателей-на-ссылки красители на эшафот важно. Идеальное соотношение зависит от спектральной чувствительности установки, используемой микроскопии и от биологических образца процентной 5,17. Хотя некоторые устранение неисправностей могут быть необходимы, очень легко и быстро методика синтеза значительно облегчит процесс. В конце концовстепень функционализации дендримера, то есть процент конечных групп дендримере, которые конъюгированного с красителями, может повлиять на выступления показателей. Чтобы избежать растворимости проблемы мы предлагаем функционализации около 10% -20% от дендример концевыми группами. В случае дендримеров пегилированных Однако, из-за ПЭГ вклад в растворимости, полное функционализации может быть достигнута. Это также может ограничить нежелательное присутствие FRET и других явлений закалки между сопряженными красителей.

Дендримеров не проникающий в клетку, но внутриклеточной доставки может быть достигнуто путем электропорации. Мы использовали протокол производитель ДНК-трансфекции для клеточной линии интереса без дальнейших модификаций. Важным параметром является концентрация дендримера в буфере электропорации, в частности в случае показателей с плохой яркости или дендримеров, что при высоких концентрациях может быть токсичными к клеткам. Низкий Concentrations из дендримере приведет к плохой сигнала внутри клеток в то время как высокие концентрации вызовет токсичность и вызывают гибель клеток. Идеальная концентрация зависит от пары дендример / индикатора, а также от настроек изображения доступной и может потребоваться оптимизация. Если электропоратора не доступна в лаборатории, микроинъекции может представлять реальную альтернативу. Тем не менее, это техника одноклеточных и сделает приобретение значительного количества отображаемого клеток более трудоемкий.

Процесс создания образа датчики является очень гибкой и может быть легко адаптирована к нескольким микроскопии установок. Ранее мы сообщали использование датчиков под конфокальной системы с перестраиваемой акустико-оптических фильтров 5,17, но стандартных наборов FITC / TRITC фильтра также может быть использован. Когда оптимальными внутриклеточная концентрация получается, визуализации рН проста. Мы предлагаем оптимизацию интенсивности лазерного излучения, отверстие и детекторы получить в широком диапазоне от датчика внутриклеточныхконцентрации перед запуском калибровки рН с ионофоров. Если же установка микроскопии при тех же условиях калибровка может быть использована для всех экспериментах. Здесь мы предлагаем логометрические воображение для того чтобы избежать датчика концентрации зависимость и артефакты. Еще одна интересная методика для достижения этой цели представляется пожизненных основе зондов как элегантно показал Виноградов и его коллеги 15 и оба варианта отображения преимуществ и недостатков. Измерение времени жизни не требуют коррекции, поскольку они по своей природе процедуры не зависящих от концентрации и калибровки часто легче и более стабильной. Более того, один цвет используется избегая осложнений и возможного аберрацию, вызванную зеленой к красной изображений логометрического. Однако только несколько эффективных зонды срок службы доступны в то время как большой массив датчиков интенсивности на основе коммерчески доступны. Оборудование, необходимое для радиометрического изображения является более простым и, вероятно, доступны в качествеtandard микроскопии центр. Более того Измерение времени жизни по своей природе медленно и не может быть применен, чтобы следовать быстро биологические процессы. Поэтому выбор между этими двумя методов сильно зависит от аппаратуры и доступной от конкретного биологического процесса, представляющего интерес.

Хотя концептуально похоже, естественных изображений в является более сложным, чем в культуре клеток. Отношение сигнал-шум уменьшается за счет рассеяния и взаимодействия с тканями может влиять на отклик датчика. Кроме того, диффузия через ткань и, таким образом, утечка индикатора от области, представляющей интерес, представляют собой дополнительный выпуск не подарок для внутриклеточных измерений в культуре. По этим причинам, выбор индикатора имеет решающее значение. В то время как для внутриклеточных измерений большинство дендримеров прекрасно работают (G4, G4-AC, G6, РАМАМ-ПЭГ гибриды), так как в естественных условиях зондирования мы рекомендуем использовать пегилированных дендримеров. +17 IndПЕД эта архитектура является особенно эффективным для этой цели по нескольким причинам: I) ПЭГ увеличить размер дендримера и снижает его утечки из ткани; II) линкер PEG минимизирует тушение в результате красителя красителя и краситель-дендример взаимодействий и III) ПЭГ защищает красители из ткани избежать потерю функции часто наблюдается после инъекции ткани датчиков. Качество рН зондирования сильно зависит от успешного введения достаточного количества дендримера в ткани. Когда это будет достигнуто процедура обработки изображений и анализа данных подобны тому, что уже сообщалось в клеточной культуре. Это наглядная демонстрация эффективности датчика в естественных условиях и может использоваться в качестве внутреннего контроля индикатора активности до любого измерения.

Мы считаем, что эти результаты вместе с подробным описанием процедуры сообщили в этой работе позволит применение датчиков дендримерных основе, чтобы выделить физiological и патологические изменения рН в живых клетках и в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

По умолчанию: Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Полезные дискуссии с Isja де Feijter и Мэтт Бейкер выражается искренняя признательность.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).

Tags

Химия выпуск 79 методов расследования химии и материаловедения (общее) дендример флуоресценция датчики рН доставка конфокальной
Синтез, Сотовый Доставка и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Применение датчиков рН Дендримеров основе
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi,… More

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter