Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Synthesis, Cellular Lieferung und Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 2
1Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 2NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, 3NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 4IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

Fluoreszenz-Sensoren sind mächtige Werkzeuge in Life Science. Hier beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren und zu verwenden Dendrimerbasis Fluoreszenzsensoren auf pH in lebenden Zellen und in vivo zu messen. Die dendritische Gerüst verbessert die Eigenschaften von konjugierten Fluoreszenzfarbstoffe, die zu verbesserten Sensoreigenschaften.

Abstract

Die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren eine Revolution für die Lebenswissenschaften. Genetisch kodierte und synthetische Fluorophore mit Sensor Fähigkeiten erlaubt die Visualisierung von biologisch relevanten Spezies mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Synthetische Farbstoffe sind von besonderem Interesse, dank ihrer hohen Abstimmbarkeit und das breite Spektrum der messbaren Analyten. Allerdings sind diese Moleküle leiden mehrere Einschränkungen auf kleine Molekül Verhalten bezogen (schlechte Löslichkeit, Schwierigkeiten bei der Targeting, oft nicht ratiometrische Bildgebung erlaubt). In dieser Arbeit wird die Entwicklung der Dendrimer-basierten Sensoren führen wir und stellen ein Verfahren für die pH-Messung in vitro, in lebenden Zellen und in vivo. Wir wählen Dendrimere als ideale Plattform für unsere Sensoren für ihre viele wünschenswerte Eigenschaften (Monodispersität, einstellbaren Eigenschaften, Multivalenz), die ihnen eine weit verbreitete Gerüst für verschiedene biomedizinische Geräte gemacht. Die Konjugation von fluoreszierenden pH-WertIndikatoren für die Dendrimer-Gerüst führte zu einer Verbesserung ihrer Leistungen Erfassungs. Insbesondere Dendrimere eine verminderte Zell Leckage, verbesserte intrazelluläre Targeting und erlauben ratiometrische Messungen. Diese neuartigen Sensoren wurden erfolgreich eingesetzt, um pH-Wert in lebenden HeLa-Zellen und in vivo im Gehirn der Maus zu messen.

Introduction

Die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen zu bestimmten biologisch relevanten Molekülen Etikett vollständig, wie biologische Systeme untersuchen wir verändert. Widefield und konfokale Mikroskopie für eine Echtzeit hochauflösende Visualisierung biologischer Prozesse und heute erlaubt zählen zu den beliebtesten Techniken der biologischen Ereignisse in vitro, in Zellen und in vivo zu untersuchen. 1 Eine relevante Verbesserung wurde durch die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren dargestellt , dh Farbstoffe, deren Fluoreszenz ist abhängig von der Konzentration eines spezifischen molekularen Einheit. pH-und Calcium-Indikatoren insbesondere hatte einen dramatischen Einfluss auf die Untersuchung der Zellphysiologie aufgrund der enormen Bedeutung von H + und Ca 2 +-Ionen in der Biologie. 2,3

I) Schwierigkeiten bei der subzellulären targeti: Allerdings sind die meisten der anwesenden Erkundung mehrere Farbstoffe immanente Grenzen ihrer kleinen Molekül Verhalten wie im Zusammenhangng, ii) schlechte Löslichkeit in Wasser und damit schlechte Biokompatibilität;. iii) Zell Leckage und damit der Mangel an lang Zeitraffer-Bildgebung Fähigkeit 4 Darüber hinaus wird das Signal von vielen Sonden kann nicht für die Abhängigkeit von der Farbstoffkonzentration korrigiert werden (nicht ratiometrische Bildgebung), und daher ist keine absolute Messung in Zellen oder in vivo möglich.

Wir haben kürzlich eine einfache und effektive Methode, um diese Einschränkungen zu überwinden, bezogen auf die Konjugation von Sensor Farbstoffe auf einem Dendrimer-Gerüst. 5 monodispersen Dendrimere sind hochverzweigte Polymere mit sehr ansprechenden Eigenschaften für biologische Anwendungen. 6 Insbesondere mehreren dendritischen Architekturen entwickelt und verwendet Drogen 7 und Gen-Lieferung. 8 Erst in jüngster Zeit einige Gruppen begonnen, das Potenzial der Moleküle als Gerüst für die Erfassungsvorrichtungen zu erforschen. 9,10,11

Wir haben vorherbeschrieben, einen einfachen Syntheseweg zur Funktionalisierung von verschiedenen Polyamidoamin (PAMAM)-Gerüst basierend auf NHS-Aktivester. 12 Konjugate können in einem einzigen Schritt durch Dialyse als nur Reinigung erhalten werden. Interessanter dieser Ansatz leicht zu einer Vielzahl von dendritischen oder polymere Gerüste angewendet werden. 13,14

Um ratiometrische Bildgebung Dendrimere zu erreichen waren doppelt markierte mit zwei Sätzen von Farbstoffe: i) ein pH-Indikator (z. B. Fluorescein) und ii) eine pH-unabhängige fluoreszierende Gruppe (dh Rhodamin). Dies erlaubte uns, eine genaue pH-Bildgebung als das Verhältnis zwischen Fluorescein und Rhodamin ist nur abhängig von dem pH-Wert und nicht mehr von der Konzentration der Sonde durchzuführen. Ein weiterer interessanter Ansatz für dieses Problem wird durch die Verwendung von Lebenszeit-basierte Sonden. Vertreten 15 Da die Lebensdauer nicht von Sondenkonzentration hängen diese Messungen müssen nicht ein ratiometrisches Korrektur. Jedoch LIFetime Messungen erfordern eine kompliziertere Instrumental Setup und deren zeitliche Auflösung für schnelle physiologische Prozesse suboptimal, was ihre Einsatzmöglichkeiten einschränkt.

Um intrazelluläre Bildgebung durchzuführen, muss die Sonde durch die Plasmamembran in das Cytosol abgegeben werden. Da die Dendrimere nicht durchlässige Membran aufgrund ihrer Größe und Hydrophilie, die intrazellulären Abgabe durch Elektroporation erreicht werden. Mit Hilfe dieser Technik, die weithin in der Biologie zur Transfektion verwendet werden, können markierte Makromoleküle effektiv in Zellen geliefert hohe Bildqualität durchzuführen. Außerdem mit der Elektroporation werden die Komplikationen Dendrimer Endozytose Zusammenhang kann vermieden werden, da die Makromoleküle werden direkt in das Zytoplasma geliefert. Interessanter nach der Elektroporation verschiedenen Dendrimere zeigt deutliche Lokalisation innerhalb der Zellen auch in Abwesenheit von spezifischen Zielsequenz. 5 Dieses passive Targeting, nur aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Dendrimers kann genutzt werden, um Organellen-spezifische pH-Bildgebung zu erzielen.

Ratiometrische Bildgebung können mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie werden. Fluorescein und Rhodamin, die kovalent an das dendritische Gerüst konjugiert ist, wurden separat abgebildet wird und ein Pixel-für-Pixel-Verhältnis der Karte erstellt wurde. Mehrere Verfahren zur intrazellulären pH in lebenden Zellen durch Ionophore steuern berichtet. Ionophore sind kleinen hydrophoben Molekülen, die Ionen über die Plasmamembran zu transportieren; Ionophore für H +-Ionen, wie Nigericin, sind verfügbar und können verwendet werden, um Dendrimer-Sensoren zu kalibrieren 16. Diese Messungen zeigten eine lineare Reaktion auf pH-Wert ähnlich zu dem, was beobachtet. in vitro. Auf der Grundlage der Eichintrazellulären pH-Wert genau gemessen werden konnte. Diese Messungen zeigen, dass Dendrimer-basierten Sensor kann ein wertvolles Werkzeug in der Studie H + homeost seinasis in lebenden Zellen und pathologischen Prozesse, die Fehlfunktionen beinhalten pH-Regulierung.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Dendrimer-basierten pH-Sensoren können auch in vivo angewendet werden, die Durchführung pH-Bildgebung im Gehirn von betäubten Mäusen. 17. Aufgrund der komplexen Umgebung von lebendem Gewebe eine hohe Qualität in vivo-Mess ist technisch anspruchsvoll. Hier zeigen wir eine detaillierte Beschreibung des experimentellen Verfahren zur In-vivo-Bildgebung mit Schwerpunkt pH-Wert der entscheidenden Fragestellungen im Hinblick auf eine genaue pH-Bildgebung im Gehirn durchzuführen. Zwei-Photonen-Mikroskopie hat aus zwei Gründen eingesetzt: i) die Verwendung von Infrarotlicht ermöglicht es, den Mangel an Gewebepenetration von Standard-konfokale Mikroskopie überwinden, ii) die breite Zwei-Photonen-Absorption von Fluorescein und Rhodamin zulassen, dass ihre gleichzeitige Anregung der Vermeidung Komplikationen die Verwendung von zwei Wellenlängen zur Anregung stehen. pH-Messungen in Maushirn warenerfolgreich durchgeführt; Sensoren leicht auf Hypoxie reagieren induzieren Änderung des pH-Wertes im Gehirn extrazellulären Raum. Diese Messungen zeigen, dass die Dendrimer-basierten Indikatoren können erfolgreich verwendet werden, um physiologische und pathologische Veränderung des pH in vivo in einem Tiermodell hervorzuheben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese der Sensoren

  1. Im folgenden Abschnitt stellen wir ein Verfahren für die Konjugation von pH-Indikatoren, um PAMAM-Dendrimere. Das gleiche Protokoll können mit minimalen Änderungen auf alternative Lager Amin-Dendrimere angewendet werden. 5,17,13,14 Handel erhältliche Dendrimere und Farbstoffe können ohne weitere Reinigungen verwendet werden.
  2. Löse das Dendrimer in wasserfreiem DMSO (50 &mgr; M Endkonzentration). Bereiten 10 mM Stammlösungen von Fluorescein-NHS und Tetramethyl-Rhodamin-NHS (TMR) in wasserfreiem DMSO.
  3. In den Dendrimer-Lösung die gewünschte Menge an Fluorescein und TMR. Das Molverhältnis in der Mischung die Menge an Farbstoffen auf dem Dendrimer geladen reflektieren. Typischerweise 1 ml G4-PAMAM-Dendrimer-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 8 eq (40 ul) von Fluorescein und 8 eq (40 ul) des TMR umgesetzt. Man rührt die Lösung bei Raumtemperatur für 12 Stunden.
  4. Verdünnen 1:10 mit VE-Wasser und laden Sie die ReaktionMischung in einem Dialysebeutel (MWCO = 10 kDa). Dialyse für 24 Stunden gegen deionisiertes Wasser häufig Ersetzen des Wassers in dem Behälter.
  5. Die Lösung wird in einem Glasfläschchen und gefriertrocknen 24 Stunden. Ein lila Pulver erhalten werden sollte. Gewicht der erhaltene Feststoff zu und löse es in Milli-Q-Wasser bei einer Endkonzentration von 10 uM. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C

2. In-vitro-pH-Messungen

  1. Für die in vitro-Kalibrierung bereiten eine Lösung von Dendrimer 500 nM in PBS (2 mM Phosphat) in einer Quarzküvette. Die Verwendung einer sehr verdünnten PBS-Puffer (2 mM), um plötzliche Änderungen des pH-Wertes während der Titration zu vermeiden, wird empfohlen.
  2. Messung der Emissionsspektren der Fluorescein (exc 488 nm) und TMR (exc 550 nm) und die Optimierung der optischen Einstellungen des Fluorimeters um ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
  3. Führen Sie eine pH-Titration durch Zugabe geringer Mengen von NaOH 0,1 N und 0,1 N HCl Nach jeder Zugabe schütteln Sie die Küvettezum Mischen, 1 min warten zur Äquilibrierung und Messung der pH mit Hilfe eines pH-Mikroelektrode. Emissionsspektren von Fluorescein und TMR sollte für jeden Schritt ohne irgendeine Änderung der optischen Einstellungen aufgezeichnet werden.
  4. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität vs pH-Wert für die Titration. Die Rhodamin-Signal sollte von pH-Wert (<10%) davon unberührt. Die Fluorescein-Signal sollte eine sigmoidale Kurve sein und sollte mit einer einzigen Bindungsmodell mit pK = 6.4 ausgestattet werden.

3. Zellkultur und Elektroporation

  1. Kultivieren HeLa-Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (Invitrogen) ergänzt. Halten der Zellkultur bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre.
  2. Für Dendrimer Elektroporation, wenn die Zellen konfluent, entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit DPBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). Entfernen Sie die DPBS und fügen Trypsin-EDTA. Neutralisieren Sie das TRYPsündigen, indem Medium mit Serum, jedoch keine Antibiotika. Zentrifuge bei 900-1200 Umdrehungen pro Minute für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Medien und spülen Sie die Pellets mit DPBS.
  3. Zählen Sie die Zellen und nehmen 4 * 10 6 Zellen. Zentrifuge bei 1200-1500 rpm für 2 min bei Raumtemperatur.
  4. Zellpellet in 200 ul Mikroporation Puffer (durch Mikroporator Hersteller) und übertragen Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. In Dendrimer wässrigen Lösung in resuspendierten Zellen. Die Menge des Dendrimer pro Probe erforderlich ist, ist abhängig von der PAMAM-Typ (typischerweise 250 nm für die kationische und 2 uM für neutrale Dendrimere).
  6. In Elektroporationspuffer (von Mikroporator Hersteller) in einer Mikroporation Röhre. Pipettieren Sie die Zellen und Dendrimere Gemische mit Elektroporation Spitze von 100 ul Volumen-Größe. Legen Sie die Mikroporator Pipette in die Pipettenstation. Stellen Sie die Puls Bedingung für Mikroporation: Impulsspannung = 1,005 V; Puls width = 35 ms, Pulszahl = 2 ist.
  7. Nachdem die Impulsübertragungszellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und Zellen für 5 min bei 1200 UpM um den Überschuss an Dendrimer in dem Medium zu entfernen. Die Platte 10 ul Elektroporation von Zellen auf 35 mm Glasbodenschalen (WillCo Schale GWSt-3522) mit frischem Medium w / o Antibiotika.

4. pH Sensing in Wohn HeLa-Zellen

  1. Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop 12 h nach der Elektroporation.
  2. Standard-Filtersatz für Fluorescein und Rhodamin verwendet werden. Wenn abstimmbaren Filter sind ein Satz grünen Kanal 500 bis 550 nm und eine rote Kanal von 580 nm bis 650 nm auf. Anregung bei 488 nm ist optimal für Fluorescein während Rhodamin könnte entweder mit dem 543nm oder 561 Laserlinie abgebildet werden.
  3. Konzentrieren Sie sich auf die Probe und stellen Laser und Detektoren Macht zu gewinnen, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Wenn die Elektroporation erfolgreich war hell fluoreszierende Zellen sollten in beiden Kanälen sein. DieLokalisierung hängt von der Größe und Ladung des Dendrimer verwendet. Oft einige lysosomale Lokalisation (kleine perinukleären Vesikeln) vorhanden ist, durch Endozytose oder Abschottung. Wenn die lysosomale Lokalisierung wiegt, dh die meisten der Fluoreszenz innerhalb Vesikeln lokalisiert und schlechten Signal im Cytosol beobachtet, so bedeutet dies, Toxizität und Messung verworfen werden sollte. Erwerben Sie nacheinander die beiden Kanäle, bei Bedarf mehrere Bilder erwerben und der Mittelwert der Bilder, um die Bildqualität zu verbessern.
  4. Zur Kalibrierung Klemmzelle unter Verwendung von Puffern mit pH-Ionophoren bei verschiedenen pH und erwerben mindestens 20 Zellen pro pH-Wert wie oben beschrieben. Für eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens und der Zusammensetzung der Puffer bitte Bizzarri und Mitarbeiter beziehen. 16. Wir empfehlen, mindestens 5 Punkte von pH = 5,5 bis pH = 7,5 zu messen. pH-Wert unter 6 sind giftig für Zellen, sondern für kurze Zeit geduldet, schlagen wir vor, um die Bilder so schnell wie möglich zu erwerben. Wenn Zellenzeigen Anzeichen von Apoptose, entsorgen Sie die Zellen und neu zu starten.
  5. Verwenden Sie ImageJ oder analoge Software für die Datenanalyse. Importieren Sie die Bilder von der grünen und roten Kanal, subtrahieren Hintergrund und erstellen Sie eine Pixel für Pixel Ratio Imaging mit dem Werkzeug "Bild-Taschenrechner".
  6. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) Auswahl der gewünschten Zelle und Messung der intrazellulären Grün-zu-Rot-Verhältnis. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder zu zeichnen und dann das Verhältnis gegenüber dem pH-Wert. Im Bereich von 5,5 bis 7,5 ist der Trend linear sein. Die lineare Anpassung der erhaltenen Punkte der Eichkurve, die verwendet werden, um grün zu rot-Verhältnis auf pH-Wert konvertieren, werden zu geben.
  7. Als weitere Kontrolle zu erlangen mehreren unbehandelten Zellen (keine Ionophore) und versuchen, pH-Wert mit der erhaltenen Eichkurve zu berechnen. Ein Wert zwischen 7,2 und 7,4 erhalten werden sollte.

5. In-vivo-Probenvorbereitung

  1. Die Experimente wurden auf C57Bl/6J (Männer und Frauen), die zwischen der postnatalen d durchgeführtay 28 und 70. Betäubt die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Urethan (dh Ethylcarbamat) (20% w / v in physiologischer Kochsalzlösung, 20 mg / kg Urethan). Die Tiere wurden nach dem Versuch mit einer Überdosis Urethan, gefolgt von einer intrakardialen Injektion der gleichen Narkose getötet.
  2. Ausführen einer intramuskulären Injektion von Dexamethason-Natriumphosphat (2 mg / kg Körpergewicht) die kortikale Stressantwort und Hirnödem während der Operation zu verringern.
  3. Rasieren Sie den Kopf des Tieres und gelten 2,5% Lidocain-Gel auf die Kopfhaut.
  4. Mit einer Schere, um die Klappe der Haut, die den Schädel beider Hemisphären geschnitten
  5. Waschen Sie die freiliegenden Knochen mit Kochsalzlösung und entfernen Sie vorsichtig die Knochenhaut mit einer Pinzette. Dadurch wird eine bessere Basis für Klebstoff und Zahnzement mit haften.
  6. Tragen Sie eine maßgeschneiderte Stahlkopf Post mit einem zentralen Bildraum und kleben Sie es mit Sekundenkleber in einer Ebene etwa parallel mit dem Schädel über den kortikalen Bereich von interest und fixieren Sie ihn mit weißen Zahnzement (Paladur).
  7. Befestigen Sie den Kopf der Maus, um eine Kraniotomie von 2-3 mm Durchmesser über der Region von Interesse gebohrt durchzuführen.
  8. Versuchen, die Erwärmung des Cortex während der Operation, Dura Tränen oder Blutung zu minimieren.
  9. Halten die Rinde mit sterilem ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2 strömt, 15 mM Glucose, 1,2 mM HEPES in destilliertem H 2 O , pH = 7,4).

6. pH-Bildgebung in der Maus-Gehirn

  1. Während des Experiments Hilfe tierischen Atmung Bereitstellen O 2-angereicherter Luft. Sauerstoff wird bis zu 80% angereichert. O 2-Partialdruck und Fluss wird häufig angepasst werden, um eine richtige Atmung Hilfe zu erhalten. Halten der Körpertemperatur konstant bei 37 ° C mit einer rückkopplungsgesteuerten Heizdecke.
  2. Befestigen Sie das Tier durch den Stahlpfosten unter dem Ziel einer Zwei-Foton Bildaufbau.
  3. Um den Sensor in der Hirnrinde zu injizieren laden einer Glaspipette, die ein AgCl-Elektrode (Spitzendurchmesser 4 mm) mit der Dendrimer-Lösung (1 uM). Die Elektrode wird es ermöglichen, die extrazelluläre Feldpotentiale zu erfassen.
  4. Mit einer Mikroinjektion Setup legen Sie die Pipette in der Hirnrinde bei etwa 150 um Tiefe. Injizieren für 1-2 Minuten bei einem Druck von 0,5 psi.
  5. Optimieren Sie den optischen Aufbau für die Bildgebung. Laserleistung sollte so eingestellt werden, Bleichen und Lichtschäden zu minimieren. Typischerweise Laserleistung eingesetzt wird, ist etwa 20 mW und PMT-Verstärkung wurde bei 667 V konstant gehalten, da Kalibrierungen ergab, dass diese Spannung gibt die beste S / N-Verhältnis.
  6. Für die Bildgebung erregt den Sensor bei 820 nm und erkennen gleichzeitig Fluorescein und Rhodamin-Fluoreszenz durch FITC und TRITC Standardfilter.
  7. Für zeitaufgelöste Messungen erwerben Zeitserie mit 2 Hz.
  8. Für Hintergrundkorrektur erwerben einen dunklen Rahmen mit dem laser Verschluß geschlossen, um den mittleren thermischen Rauschens sich in den PMTs und dem Sockel in der Regel von der Elektronik hinzugefügt messen.
  9. Für die Datenanalyse nach dem gleichen Verfahren in Abschnitt 4 angegeben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Konjugation des Erfassens Farbstoffe, verschiedene dendritischen Gerüste. Die resultierenden Indikatoren können in einem einzigen Syntheseschritt aus kommerziell erhältlichen Produkten erhalten werden. Amin-tragende Dendrimere mit NHS-aktivierten Farbstoffe in DMSO umgesetzt und durch Dialyse gereinigt. Dieses allgemeine Verfahren wurde bereits erfolgreich für die Kennzeichnung von mehreren Dendrimere verwendet: i) PAMAM-Dendrimer der Generation 2, 4 und 6, 12 pegyliertem PAMAM-Dendrimere 17 und PEG-18 dendritischen Hybriden. Im Unterschied Dendrimere zeigen unterschiedliche Wechselwirkungen mit Zellen und Gewebe (Lokalisierung, Toxizität, Permeabilität, Diffusion) die Auswahl der dendritische Struktur ist stark auf die gewünschte Anwendung und nach dem Muster des Interesses stehen.

Die Sensoren bestehen aus zwei Sätzen von fluoreszierenden Farbstoffen: i) pH-Indikatoren und ii) pH-unempfindlich Einheiten wirken als interne Referenzen. Although eine Vielzahl von Indikatoren und Referenzen zur Verfügung stehen, die besten Ergebnisse wurden mit Fluorescein und Tetramethylrhodamin erhalten. Das Verhältnis der zwei Farbstoffe kann einfach mit verschiedenen molaren Äquivalenten in der Reaktions abgestimmt werden. Fig. 2 zeigt eine typische in-vitro-Titration eines pH-Sensors. Fluorescein und Rhodamin separat bei 488 nm und 550 nm angeregt werden, eingesetzt werden, die mindestens ein Übersprechen zwischen den beiden Kanälen. Wie deutlich zu sehen ist, Fluorescein (2A) zeigt ein pH-abhängiges Verhalten während Rhodamin (2A) Signal nicht wesentlich im physiologischen pH-Bereich zu ändern. Daher ist das Verhältnis dieser beiden Signale nicht auf Sensor Konzentration aber nur auf pH-Wert abhängen. Diese Konzentration Unabhängigkeit wird von großer Bedeutung für die biologischen Messungen werden als intrazelluläre Konzentration der Sonde kann nicht gesteuert werden.

Für Live-Messungen der Zellen intrazellulären Lieferung der dendritischen Sensoren wird mittels Elektroporation erreicht. Diese Technik wird allgemein in der Biologie zur DNA-Transfektion verwendet und kann mit minimalen Veränderungen auf dem Protokoll des Herstellers eingesetzt werden. Durch Elektroporation können die Makromoleküle direkt in das Zytoplasma geliefert werden, vermeidet jegliche Komplikation der vesikulären System Endozytose bezogen. 3a zeigt konfokale Bilder von HeLa-Zellen mit den Dendrimer-Sensoren elektroporiert. Ein starkes Signal sowohl Fluorescein (grün, links) und Rhodamin (rot, Mitte) beobachtet. Die zwei Signale vollkommen colokalisieren Nachweis der Integrität der Sensorstruktur. Eine ratiometrische Karte wird durch Division der beiden Bilder Pixel für Pixel und mit einer Pseudofarbskala dargestellt (Abbildung 3a, rechts) rekonstruiert. pH-Klemmung mit Ionophoren wurde durchgeführt, um die Sensorantwort in Zellen zu kalibrieren. Kalibrierung mit Ionophore ist ein gut etabliertes Protokoll, mehRAL-Protokolle wurden ausführlich beschrieben und können verwendet werden, ohne Modifikationen. 19 Indikatoren leicht auf pH reagieren mit einer Änderung der Grün-zu-Rot-Verhältnis, wie in Fig. 3b gezeigt. Dies erlaubte uns, eine Kalibrierungskurve (3c) für eine genaue pH-Messungen zu erhalten. Der lineare Trend bei der Kalibrierung zeigt die Fähigkeit des Sensors, um einen pH-Wert ohne Störung der Zellumgebung zu reagieren. Die Eichkurve wurde verwendet, um den pH-Wert des lebenden HeLa-Zellen auf 7,4 und 4,8 für Zytoplasma und Lysosomen zu bestimmen sind. Diese Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit der Literatur.

Schließlich haben wir gezeigt, wie Dendrimer-Sensoren können für in vivo Bildgebung verwendet werden. Dendrimere können leicht durch das Gewebe mit einem Verfahren, ähnlich den weit verbreiteten Calciumindikatoren injiziert werden. 20. Sobald in dem Gewebe diffundieren die Indikatoren extrem langsam, allowing langfristig Bildgebung vor der vollständigen Gewebe Entwässerung. Typische Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Fluorescein (grün) und Rhodamin-(rote) Signale gleichzeitig mit 820 nm Anregung erhalten wurde und das Verhältnis der Karte auf einer Pixel-für-Pixel-Basis aufgebaut, ähnlich wie bei Zellen Messungen leben. Bemerkenswert ist, zu lokalisieren, die Indikatoren in den extrazellulären Raum, die nicht-fluoreszierenden Bereiche im Bild zu identifizieren Zellkörper oder kleine Blutgefäße. Um Sensorantwort auf pH-Wert zu überprüfen, haben wir vorgeschlagen, die Verwendung von Hyperkapnie. Tatsächlich ist Kohlendioxid bekannt, die Gleichgewichte der Carbonat-Puffer in Blut und Gewebe zu verändern, was zu einer Ansäuerung des Gewebes. 21. Wie in Fig. 4b gezeigt, ist die Inhalation von 30% CO 2 reicht aus, um eine starke Reaktion der veran Sensor, der bei der Wieder Belüftung der Maus vollständig reversibel ist. Diese Ergebnisse zeigen das Potential von Dendrimer-Sensoren zu markieren physiologischen und pathological Änderungen des pH-Wertes in lebenden Zellen und in vivo.

Figur 1
Fig. 1 ist. Synthese von Dendrimer-basierten Sensoren Schematische Darstellung der Dendrimer-basierten pH-Sensor. Das gleiche Verfahren kann auf praktisch jedem Amin-Lager Dendrimer (links) angewendet werden. Produkt wurde durch Konjugation einer einzigen Reaktion, gefolgt von Dialyse erhalten. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Figur 2
2. In vitro pH-Titration nach einem Dendrimer-basierten Sensors. a) Reaktion des pH-Indikators Fluorescein und b) internal Referenz, Rhodamin, zeigt keine Veränderung gegenüber dem physiologischen pH-Bereich.

Fig. 3
3. Repräsentative Ergebnisse der pH-Bildgebung in lebenden HeLa-Zellen. a) Die konfokale Bildgebung von Fluorescein-Kanal (links), Rhodamin-Kanal (Mitte) und pH-ratiometrische Karte (rechts). b) pH-Kalibrierung mit Ionophore. c) Vertreter ratiometrische Karten von Zellen bei verschiedenen pH-geklemmt. . Albertazzi von L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al reproduziert (2011) Dendrimer-basierten Fluoreszenzindikatoren:.. In-vitro-und In-vivo-Anwendungen PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Fig. 4
4. pH-Bildgebung in derGehirn von betäubten Maus. a) grüne und rote Kanal (gleichzeitig bei 820 nm angeregt) und pH-ratiometrischen Karte. b) typische Reaktion des Sensors auf Hyperkapnie (30% CO 2). Angepasst von:. Albertazzi von L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al reproduziert (2011) Dendrimer-basierten Fluoreszenz-Anzeigen:.. In-vitro-und In-vivo-Anwendungen PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die kritischen Schritte zur erfolgreichen pH-Bildgebung mit Dendrimer-Sensoren sind: i) die Auswahl der richtigen dendritischen Gerüsts und der Anzahl von Indikatoren, die es konjugiert ist, und ii) die Optimierung der Sensorübermittlungsprotokoll in Zellen oder in vivo.

Das synthetische Verfahren ist relativ einfach und kann praktisch zu jedem Amin-tragenden hyperverzweigten Polymeren aufgebracht werden. Die Sensoren können aus kommerziell erhältlichen Dendrimere und NHS-aktivierte Farbstoffe in einem einzigen Schritt erhalten werden. Wir glauben, dass diese modulare und unkompliziertes Verfahren wird vorteilhaft für die weitere Anwendung solcher Sensoren für eine Vielfalt von biologischen Fragen. Die Reinigung kann durch eine Dialyse erreicht werden, um die nicht-konjugierten Farbstoffe zu entfernen. Die Auswahl des dendritischen Gerüsts ist entscheidend und hängt von der gewünschten spezifischen Anwendung. Verschiedene Dendrimere haben gezeigt, eigentümliche Lokalisierungen innerhalb Zellen aufgrund spezifischer Wechselwirkungen mit subcellular Strukturen. Neutral Dendrimere (z. B. acetylierte PAMAM G4) keine Interaktion innerhalb der Zellen zu zeigen und zeigen eine diffuse Lokalisierung. So stellen sie eine gute Wahl für einen Ganzzellbildgebung. Im Gegenteil positiv geladene Dendrimere verschiedener Generationen (von G2 bis G6) Display elektrostatische Wechselwirkungen mit negativ geladenen Biomoleküle (dh RNA), was zu spezifischen zellulären Lokalisierung. Kationische Dendrimere sind somit ideal für den Organellen spezifische Bildgebung.

Die Wahl der Mess Farbstoffen kritisch. Mehrere pH-Indikatoren und pH-unempfindlichen Farbstoffe mit unterschiedlichen Farbabstrahlung und H +-Affinität (PK) zur Verfügung. Wir haben versucht, viele verschiedene Farbkombinationen und die besten Ergebnisse wurden mit Fluorescein und Tetramethylrhodamin erhalten. Dieses Paar eine gute Reaktion auf pH-Wert im physiologischen Bereich (pK = 6,4) und ist mit den üblichen Mikroskopie Filter-Setups kompatibel. Für unterschiedliche Anforderungen, wie Messs in verschiedenen pH-Bereich, können einige Optimierungs erforderlich. Bemerkenswert ist, nicht alle Indikatoren behalten ihre Eigenschaften (Helligkeit, PK) auf Dendrimer Konjugation 5 Dieses Verhalten hängt sowohl von Dendrimer-Farbstoff und Strukturen;. Jedoch waren wir in der Lage, mehrere Indikatoren, wo die photophysikalischen Eigenschaften der Indikatoren nicht signifikant beeinflusst zu melden. 17 Wenn dies der Fall ist, empfehlen wir Konjugieren der Farbstoffe durch einen Linker, um Dendrimer-Farbstoff-Wechselwirkungen zu minimieren. Mehrere Reaktivfarbstoffe sind im Handel mit Alkyl-Abstandhalter 22 oder in alternativen PEG-Linker vorhanden, verwendet werden. Auch die Anzahl der Indikatoren, und die Indikatoren Verhältnis zu Bezugs Farbstoffe auf dem Gerüst ist wichtig. Das ideale Verhältnis hängt von der spektralen Empfindlichkeit des Setup-Mikroskopie verwendet und auf der biologischen Probe von Interesse 5,17. Obwohl einige Fehlersuche erforderlich sein, wird das sehr einfach und schnell Syntheseverfahren erheblich erleichtern den Prozess. Schließlichder Grad der Funktionalisierung des Dendrimers, dh der Anteil der Endgruppen des Dendrimers, der Farbstoffe konjugiert sind, die Leistungen der Indikatoren beeinflussen. Um eine Löslichkeit Problem, das wir vorschlagen, Funktionalisierung von etwa 10% -20% der Dendrimer Ende Gruppen zu vermeiden. Im Fall von pegyliertem Dendrimere jedoch aufgrund PEG Beitrag zur Löslichkeit, kann eine vollständige Funktionalisierung erreicht werden. Dies kann auch zu begrenzen die unerwünschte Anwesenheit von FRET und andere Phänomene Abschrecken unter den konjugierten Farbstoffe.

Dendrimere sind nicht zellgängig, aber intrazellulären Transport durch Elektroporation erreicht werden. Wir verwendeten DNA-Transfektion Hersteller-Protokoll für die Zelllinie von Interesse, ohne weitere Modifikationen. Ein wesentlicher Parameter ist die Konzentration des Dendrimers in der Elektroporations-Puffer, insbesondere im Fall von Indikatoren mit schlechter Helligkeit oder Dendrimere, dass bei hohen Konzentrationen kann für Zellen toxisch sein. Low concentrations von Dendrimer wird in schlechten Signal in den Zellen führen, während hohe Konzentrationen Toxizität verursachen und induzieren Zelltod. Die ideale Konzentration ist abhängig von der Dendrimer / Indikator-Paar als auch auf der Bilddarstellungsaufbau frei und kann eine Optimierung benötigen. Wenn ein Elektroporator ist im Labor nicht verfügbar ist, kann die Mikroinjektion eine echte Alternative darstellen. Dies ist jedoch eine Einzelzelle und Technik wird der Erwerb einer bedeutenden Anzahl von Zellen abgebildet mühsamer zu machen.

Die Sensoren Abbildungsverfahren ist sehr flexibel und kann leicht an verschiedene Konfigurationen Mikroskopie angepasst werden. Wir haben bereits über die Verwendung der Sensoren unter einem konfokalen System mit abstimmbaren akusto-optischen Filter, aber 5,17 Standard FITC / TRITC-Filtersätze können ebenfalls verwendet werden. Wenn eine optimale intrazelluläre Konzentration erhalten wird, ist pH Abbildungs ​​unkompliziert. Wir schlagen vor, die Optimierung der Laserintensität, Lochkamera und Detektoren zu gewinnen über einen großen Bereich von SensorintrazellulärenKonzentrationen, bevor Sie den pH-Kalibrierung mit Ionophore. Wenn die gleiche Mikroskopie Setup wird unter den gleichen Bedingungen könnte die Kalibrierung für alle Experimente verwendet werden. Hier schlagen wir ratiometrische Bildgebung Sensor Konzentrationsabhängigkeit und Artefakte zu vermeiden. Eine weitere interessante Methode, dies zu erreichen wird durch Lebensdauer-basierte Sonden als elegant durch Vinogradov und Mitarbeiter zeigten 15 und beide Optionen Display Vor-und Nachteile dargestellt. Lebensdauermessungen keine Korrektur erfordern, wie sie sind eigenkonzentrationsunabhängig und Kalibrierungsverfahren sind oft einfacher und stabiler. Außerdem wird eine einzige Farbe, die Komplikationen zu vermeiden und die mögliche Abweichung von der grün nach rot ratiometrische Bildgebung induzierte verwendet. Doch nur wenige effektive Lebensdauer Sonden sind, während eine große Palette von intensitätsbasierten Sonden sind im Handel verfügbar. Die für ratiometrische Bildgebung erforderliche Ausrüstung ist einfacher und wahrscheinlich in sotandard-Mikroskopie-Anlage. Darüber Lebensdauermessungen sind eigen langsam und kann nicht angewendet werden, um biologische Prozesse schnell zu folgen. Deshalb ist die Wahl zwischen diesen beiden Techniken ist stark von der verfügbaren Instrumentierung und der spezifischen biologischen Vorgang von Interesse ist.

Obwohl vom Konzept her ähnlich, ist in vivo Bildgebung schwieriger als in der Zellkultur. Signal-Rausch-Verhältnis wird durch Streuung verringert und die Interaktionen mit den Geweben können die Reaktion des Sensors zu beeinflussen. Außerdem Diffusion durch das Gewebe und somit ein Austreten des Indikators von der Region von Interesse darstellen, einen nicht für die intrazelluläre Messungen in der Kultur vorhandenen weiteren Problem. Aus diesen Gründen ist die Auswahl des Indikators entscheidend. Während für die intrazelluläre Messungen meisten der Dendrimere funktionieren hervorragend (G4, G4-Ac, G6, PAMAM-PEG-Hybriden), für die in vivo-Mess empfehlen wir den Einsatz von pegyliertem Dendrimere. 17. IndEED dieser Architektur ist besonders wirksam für diesen Zweck aus mehreren Gründen: i) das PEG erhöht sich die Größe des Dendrimers und reduziert dessen Austreten aus dem Gewebe, b) das PEG-Linker das Abschrecken von Farbstoff-Farbstoff resultierende minimiert und Farbstoff-Dendrimer-Wechselwirkungen und iii) das PEG schirmt die Farbstoffe aus der Vermeidung des Verlusts der Funktion oft nach Gewebe Injektion von Sensoren beobachtet Gewebe. Die Qualität des pH Erfassungs hängt stark von der erfolgreichen Injektion einer ausreichenden Menge an Dendrimer in das Gewebe. Wenn dies erreicht ist, erfolgt die Bildgebung und die Datenanalyse sind ähnlich zu dem, was bereits für die Zellkultur berichtet. Dies ist ein klarer Beweis für die Wirksamkeit in vivo-Sensor und kann als eine interne Kontrolle der Indikator Aktivität vor jeder Messung verwendet werden.

Wir glauben, dass diese Ergebnisse zusammen mit den detaillierten Verfahren in dieser Arbeit berichtet, ermöglicht die Anwendung der Dendrimer-basierten Sensoren an phys. markierensiologische und pathologische Veränderungen des pH-Wertes in lebenden Zellen und in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Standard: Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Nützliche Gespräche mit Isja de Feijter und Matt Baker dankbar anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).

Tags

Chemie Heft 79 Forschungstechniken Chemie und Material (Allgemein) Dendrimer- Fluoreszenz- Sensoren pH-Wert Lieferung konfokale
Synthesis, Cellular Lieferung und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Anwendung der Dendrimer-basierten pH-Sensoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi,… More

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter