Summary
여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다.
Abstract
랜덤 microseed 매트릭스 스크리닝 (rMMS)는 종 결정은 임의의 화면에 추가되는 단백질 결정화 기술이다. 결정이 단백질의 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성을 증가시켜, 여분 결정화 리드 종종 생성 된 결정의 질이 향상 될 수 있고, 수득되며, 데이터 수집 및 침지 실험 결정체가 잘 공급이 제공된다. 여기에서 우리는 손으로 또는 96 - 웰 또는 24 웰 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 앉거나 매달려 드롭 증기 확산 실험 중 하나에 적용 할 수있다 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명합니다.
Introduction
페루 츠, Kendrew 및 구조 게놈 컨소시엄의 현대 높은 처리량 자동화 된 파이프 라인에, 헤모글로빈과 미오글로빈의 구조를 결정하는 동료에 의해 초기 응용 프로그램에서 고분자 X-선 결정학은 우리에게 단백질의 세계에 전례가없는 구조 살짝 여유있다 . 이 기술은 원자에서 단백질 구조의 직접적인 시각화를 허용하는 가장 널리 적용 실험 방법 유지하거나 (즉, 1-3 Å 범위) 해상도 원자 근처. 단백질에인가하는 X-선 회절을위한 전제 조건은 우선 결정화되어야한다는이며 회절 방법 1, 2에 의한 구조 분석에서 단일 최대 속도 - 제한 단계 유지 프로세스의이 단계이다. 트립 단백질 결정화 과정의 이해 및 결정화 화면의 품질 및 유용성에 큰 개선에 상당한 발전에도 불구하고,트레이 및 관련 기술, 그것을 확실하게 결정화 성공 3의 가능성을 예측하는 것은 여전히 불가능하다. 생화학 및 생물 물리학 적 방법이 관심을 표시하는 단백질은 결정 핵 생성과 성장에 유리한 특성, 즉, 잘 접힌, 균질, 단 분산 등의 여부를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다, 그러나, 어떠한 방식으로 이러한 분석은 결정의 최종적인 예측을 제공 성향.
시드는 오랫동안 존재 결정 또는 결정 성 물질 4-7의 숫자, 크기 및 품질을 향상시키기위한 가능한 방법으로 사칭되었다. 이 방법은 결정 핵 생성을 지원 조건이 후속의 결정 성장 및 그 반대를위한 최적이 아닐 수 있다는 전제에 기초한다. 다른 하나의 조건에서 핵 물질을 이동하여, 하나는 효과적으로 이러한 프로세스를 분리하는 새로운, 아직 미개척 결정화 공간에 따라서주는 접근을 시도 할 수 있습니다결과적으로 스크리닝 실험의 성공률을 증가시킬 수있다. 정해진 방법은 일반적으로 예를 들어 사용하는 지향성 압력의인가에 의해 얻어진 (I) macroseeding 다른 8 개의 조건에서 그 전체 단결정의 이동, (II)을 연속 시드, 핵 물질의 이동, 문서화 된 새로운 결정화 드롭 9, 그리고 (iii) "고전적인"microseeding 통해 수염의 후속 통과 한 다음 기존 결정의 표면에 고양이의 수염은, 수확에 의해 생성 된 결정 "씨앗"의 전송 결정 (또는 결정을 분쇄 씨앗 10를 산출하는 것과 유사한 조건에 자료). 특히 이러한 방법의 세 가지 확실히 현대 액체 처리 결정화 로봇과 달성 가능한 비교, 시간과 제대로 확장됩니다. 이러한 요소는 인식에, 적어도 어떤 수준에 기여하는 씨앗ING는 다른 접근이 결실을 맺기에 실패한 경우에만 방문 할 수있는 방법입니다.
임의의 행렬 microseeding (rMMS)는 높은 처리량 검사 및 확장 성을 11 ~ 13 그 전통 microseeding의 장점을 결합하여 최근의 방법 론적 혁신입니다. 이 방법은 표준 96 - 조건 결정화 화면 내의 각 sub-well/coverslip에 /로 분주 할 수있다 유핵 결정 성 물질에서 생산 된 종자 주식의 생성에 의존합니다. 이 방법은 두 손으로 또는 24도 또는 96도 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 증기 확산 실험을, 앉아 또는 교수형에 적용 할 수있다. rMMS 크게 결정화 성공률을 증가시키고, 더 큰 회절 질 및 양으로 18, 13, 14의 결정을 생성하기 위하여 실험적으로 증명하고, O에 접근 결정 학자 '병기 혁신적인 공구를 나타내고있다결정화 성공을 향한 노력을 ngoing. 여기에서 우리는 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명하고이 기술의 효과를 보여주는 샘플 데이터를 제공합니다.
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Protocol
1. 전략적 고려 사항
- microseeding 실험에 사용되는 종자 결정의 선택은 실험의 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 프로젝트의 시작 부분에 크리스탈 최적화를 위해 다른 시작 지점을 제공 할 수있는 몇 가지 결정 히트를 찾기 위해 도움이됩니다. 상질 결정 교란 다음 또는 시스템이 평형 상태로 복귀 핵화 곳 영역 즉 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성이 있으므로 rMMS 크게 결정 최적화의 필요성을 감소시킨다. 따라서 우리는 첫 번째 결정이 (즉시 최초의 결정이 성장 정지로, 더 정확하게, 또는) 얻을 수있다로 정기적으로 즉시 rMMS을 사용하는 것이 좋습니다.
- rMMS의 초기 라운드, 시드 콘텐츠는 극력 결정질 재료로 만들어 져야한다. 하나의 잘 사용할 수있는 경우 그 결정을 포함, 또는 결정이 작은 경우, 다수의 반복을 설정하는 것이 도움이 될 수 있습니다결정의 공급을 증가하는 (시드 제외) 원본 히트. 그러나, 여러 가지 히트를 얻을 수 있으며, 경우, 종자 결정은 몇 가지 조건에서 수확과 함께 혼합 할 수 있습니다.
- 상 분리를 방지하기 위해, 높은 염 조건에서 성장 된 결정을 높은 PEG 조건에서 성장 된 결정 별도로 수확한다. 여러 우물에서 결정이 혼합되어있는 경우, 소금 결정을 줄 가능성이 적습니다 저장 솔루션은 씨앗 서스펜션을 선택해야합니다. 예를 들어, 인산염, 황산염, 칼슘, 마그네슘의 고농도는 피해야한다.
- 나중에 프로젝트는, 회절을 향상 한쌍으로 결정을 피하고, 리간드 결합에 적합한 결정을 얻기 위해 서로 다른 단위 세포와 결정을 찾기 위해 중요 할 수있다. 이 단계에서 (예를 들면 최선을 회절하는 것) 가장 적당한 결정 시드 재고를 확인하는 데 사용되어야한다. microseeding의 반복을 라운드는 여기서 만 "최고, 필요"결정은 다음 라운드에 씨앗 주식을 만드는 데 사용됩니다. 가능하면,"이러한 PEG 3000 중립 "침전제는 새로운 결정 연락처를 장려하기 위해 높은 불안정 할 수 있습니다 단지를 구체화 할 수있는 종자 결정을 중지하는 데 사용되어야합니다 소금 솔루션 12.
- 하나의 결정화 조건을 사용하는 고전 microseeding 실험은 유망한 조건의 후속 최적화 동안 식별 다음 종종 도움이된다. 그것은 드롭 당 결정의 원하는 번호를 얻기 위하여 종자 스톡을 희석하는 것이 필요하다. (증가 희석의 씨앗 주식의 일련의 결정화 조건에 추가됩니다) "조합"microseeding 실험 씨앗 주식의 최적의 희석을 찾기위한 빠른 방법입니다. 이 방법은 아래에 설명된다.
2. 시드 재고 준비
- 분젠 불꽃을 사용하여 유리 파스퇴르 피펫으로부터 둥근 유리 프로브를 만들.
- 부드러운 될 때까지 중간 근처 피펫을 가열 한 후 신속하게 불에서 제거하고 끝을 따로 잡아 당겨 끌어. 아래 0.25 mm 이하의 직경 유리를 당겨하는 것을 목표로하고 있습니다.
- 이 약 0.25 mm이며, 간단히 화염에 깨진 끝을 뛰어 점에서 유리 휴식. ~ 825 mm의 직경이 단부에 형성되어있는 유리의 반구 때까지 이것을 반복한다. 이 적절하게 0.01 ~ 1.0 mm의 규모에 단단한 물체에 부딪혀서에 맞는 크기와 그것이 결정 트레이 하위 잘 또는 커버 슬립의 플라스틱 표면을 손상하지 않는 한이 프로브는 결정 성 물질을 분쇄하는 데 유용합니다. 결정이 유리와 플라스틱 사이에 갇혀 있기 때문에 큰 프로브 (~ 1.0 mm)를보다 효율적으로 작은 결정을 분쇄 할 수 있습니다.
- 얼음에 시드 비드를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 배치합니다.
- 쌍안 현미경 또는 결정 촬상 시스템을 이용하여 미리 설정된 결정화 트레이를 검사하고, 하나 이상의 AP를 선택시드 재고 세대를위한 결정 자료를 수확되는 트레이에서 우물와 적합한. 모든 물질은 미세 바늘, 구정, 미결정 및 불규칙한, 잘못 구성된 결정을 포함하여 사용 할 수 있습니다. 구형 물질이 부분적으로 가교 결합 될 가능성 같이 시드 콘텐츠는 따라서 시드 실험에 사용하기위한 그것의 적합성을 줄여, 가능한 빨리 결정 성장 정지 후에 만들어 져야한다. 의심은 수확 될 결정질 재료가 잘은 UV 형광 현미경 또는 이미징 시스템 전에 개구 행을 사용하여 가시화 될 수 있고, 또는 결정 성 물질은 인 - 시튜 X-선 회절 분석을 실시 할 수있다 염 또는 단백질인지에 존재하지 않으면 트레이. UV 조사하에 형광 것이다 갑 접근법 단백질 결정을 사용하는 경우, 염 결정은 무색 나타날 것이다.
- 잘 선택한 결정 트레이를 엽니 다. 96 - 웰 주위에 상단 플라스틱 밀봉 시트를 잘라 드롭 트레이에 앉아에 대한 USI 잘 선택메스의 칼날을 겨. 24 잘 매달려 드롭 용지함 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립을 반전하고 안정된 깨끗한 표면에 놓으십시오. 저장 용액 50 μl를 제거하고 튜브에 걸쳐 얼음에 남아있는 것을 보장 시드 비드를 포함하는 microcentrifuge 관에이 액체를 전송합니다.
- 철저하게 현미경으로 결과를보고, 2.1 절에서 제조 된 유리의 프로브를 사용하여, subwell (96 - 웰 트레이) 또는 커버 슬립 (24 웰 트레이)에 떨어진다 결정을 분쇄. 작은 결정은 철저하게 분쇄하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 이 단계는 실험자 결정들은 염 결정되지 않는 것을 또한 분쇄하기 쉽기 때문에, 가교되지 않으며, 확인 할 수있다. 소금 결정은 듣고 그들이 분쇄 할 때 느낄 수있는 특유의 클릭을 생산하고 있습니다. 결정은 신선한 재료를 획득하고 사용하는 시도를 분쇄하기 힘든 어려운 경우.
- 씨 구슬 튜브와 t의 저장 용액의 5 μl를 제거를 ransfer에 해당하는 하위 아니라 (드롭 실험에 앉아), 또는 커버 슬립 (낙하 실험을 거는) 수확되는 결정 성 물질을 포함한다. 가능한 한 하위 잘 또는 커버 슬립 내용의 많은 부분을 재현 탁이 액체 위아래로 5 ~ 6 시간을 피펫. 씨 구슬 튜브에 서스펜션을 반환하고 많은 결정 물질을 가능한 한 수확하는 것이 보장, 두 번 더이 단계를 반복합니다.
- 얼음에 튜브를 냉각하기 위해 매 30 초 정지, 2 분 씨 구슬을 소용돌이.
- 4 각 단계에서 10의 요인에 의해 저장 솔루션의 씨앗 주식을 희석, 희석 시리즈를 확인합니다. 일반적으로, 너무 많은 결정을 희석 씨의 주식을 사용할 때 얻을, 잘 당 결정의 수를 제어하기 위해 희석 씨의 주식을 사용합니다. 씨앗의 농도보다 더 결정화 히트 수득되기 때문에 rMMS의 첫번째 라운드에서는, 시드 원액을 희석하지 않는 것이 중요하다.
- 그것은 즉시 주를 사용할 수없는 경우ately, -20 ° C에 씨앗 주식 서스펜션과 희석 씨의 주식을 전송하거나 저장 -80 C 냉장고 °. 작은 양 분량 씩, 즉 10 ~ 20 μL에이 물질을 저장, 씨앗 주식의 효능을 감소시킬 수있는, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지합니다. 냉동하면 필요할 때까지, 씨앗 주식은 무기한으로 유지 될 수있다.
3. 결정화 트레이 설립
- 결정화 설비와 실험자의 환경의 상황에 따라, rMMS 결정화 스크리닝 앉아 드롭 기상 확산법을 이용하여 걸려 드롭 기상 확산법을 이용한 24 - 웰 트레이, 또는 96 - 웰 트레이를 사용하여 수행 될 수있다. rMMS위한 결정화 트레이 로봇 디스펜서 처리 액체, 또는 둘의 조합을 이용하여, 손으로도 설정 될 수있다.
- 손으로 설정 전형적인 rMMS 실험, 1.0 ㎕의 단백질 용액, 1.0 ㎕의 결정화 조건을 포함하고합니다0.5 ㎕의 씨앗의 주식. 결정화 로봇을 사용하여 설정 전형적인 실험은 0.3 ㎕의 단백질 용액, 0.2 ㎕의 결정화 조건, 0.1 ㎕의 씨앗 주식을 포함 할 것이다.
- 24 웰 드롭 트레이 걸려 rMMS 검사를 수행하려면, 첫째, 수동 피펫을 사용하여, 4 × 24 웰 pregreased 결정의 각 웰에 10 ㎖ 단일 튜브 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 300 μl를 전송 트레이.
- 모두 전면과 후면 보호 역행 스트립 제거 된 해당 플라스틱 커버 슬립의 표면에 각각 300 ㎕의 저수지에서 각 결정화 조건의 양도 1 μL.
- 각 결정화 조건의 1 μL로 결정 씨앗 주식의 0.5 μL 다음에 단백질 용액 1 μl를 추가합니다. 액체의 드롭 하향 잘 적절한 위에 위치되도록 각 coverslip에 전환.
- 아래로 coverslip을 눌러, seali를 압축그리스를 겨 안전한 실을 형성한다. 일단 96 방울을 설립, 트레이는 일반적으로 스토리지에 대한 범위 4-18 °의 C에서 인큐베이터 또는 일정한 온도의 방에 전송해야합니다.
- 96 - 웰 드롭 트레이는 먼저 각각의 결정화 트레이 잘 대응에 깊은 우물 블록 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 20 ~ 50 μl를 전송 앉아 rMMS 검사를 수행합니다. 이 전사 공정은 8 - 채널 피펫을 사용하여 결정화 로봇 또는 수동 전송로를 사용하여 수행 될 수있다.
- 손으로 또는 3.1에 설명 된 볼륨을 사용하여 로봇 방울로 전송 저수지, 단백질과 씨앗 주식 솔루션을 제공합니다. 일부 상용 결정화 로봇은 분배를 접촉하지 않고, 이러한 시스템을 사용하여 성능의 씨앗 주식 전송 조언, 관련 배관 분배의 막힘의 원인이 될 수 있습니다. 분배의 순서는 변수 : 일부 로봇은 동시에 모든 솔루션을 분배. 면다음 주식을 배정 저수지 후, 최초의 단백질을 분배 이것은 불가능합니다.
- 로봇을 분배 접촉 무딘 바늘로 장착되어 낮은 볼륨 유리 주사기를 사용하여 씨앗 가능한 전송되지 않습니다. 각 드롭에 씨앗 주식을 분배 저장 솔루션을 통해 전달하여 바늘을 씻어.
- 투명 밀봉 시트를 사용하여 트레이를 밀봉하고 인큐베이터 또는 저장을위한 일정한 온도의 방에 전송할 수 있습니다.
4. 결정화 트레이의 검사
- 쌍안 현미경 또는 수정 이미징 시스템을 사용하여 모든 결정화 실험을 시각화. 전자는 일반적으로 뷰 깊이 이상의 사용자 큰 제어 및 후자보다 배율 수준을 수득하지만, 더 많은 시간이 걸린다.
- 순서대로 각 sub-well/coverslip를 검사하고 수정 형성의 증거를 기록. 실험마다 24 설립 다음 5 일 동안 시간과 검사해야N 이후에 한 번, 최대 4 주 동안 매 7 일마다.
- 최적의 회절 품질 결정이 생성되기 전에 rMMS의 여러 사이클은 종종 필요합니다.
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Representative Results
rMMS 실험 (A) 예
rMMS 검사의 효과를 입증하기 위해 우리는 암탉의 달걀 흰자위 라이소자임 (HEWL)과 소 간 카탈라제 (BLC)의 결정화에이 방법을 적용했다. 이 효소는 저명 결정화하고 구조적으로 잘 대상 (15, 16)를 특징으로 두. 등 모두 rMMS로 달성 향상된 결정화 성공률을 설명하기 위해 우수한 시험 과목을 제공하기 때문에. 결정화 실험은 96 - 웰 액체 처리 로봇을 사용하여 드롭 트레이 형식 앉아 년에 설립되었다. HEWL 및 BLC의 솔루션은 각각 100 ㎖ ㎎ / 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도 20 mM 트리스 - 염산, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5, 각각의 동결 건조 분말을 용해하여 제조 하였다. 각 단백질 세 96 조건 결정화 화면이 사용되었다; JCSG, PACT와 모피어스. microseeding없이 결정화 심사는 저수지 50 μL의 볼륨 및 2 μl를 사용하여 실시 하였다단백질 용액 1 μL 및 저장 솔루션 1 μl를 포함하는 방울을 앉아. 여섯 트레이는 18 ° C에서 일정한 온도의 방에서 저장 및 쌍안 현미경을 사용하여 매일 검사 하였다. 결정 성장의 증거를 기록했다. 5 일 후에 결정질 물질의 성장을 지원하기 위해 발견 된 각 트레이로부터 하나의 조건으로 선택하고, 시드 콘텐츠 생성을 위해 사용된다. rMMS 검사는 단백질 용액 1 μL, 저장 용액 1 μL와 씨앗 주식의 0.5 μl를 포함하는 방울을 앉아 2.5 μL가 사용 된 것을 제외하고, 비 rMMS 검사 등을 실시 하였다. 여섯 rMMS 트레이는 18 ° C에서 일정한 온도의 방에 옮겨 쌍안 현미경을 사용하여 매일 검사 하였다. 5 일 후에 두 단백질의 rMMS 트레이를 검사하고, 크리스탈 방울의 수를 기록했다. 그림 1은이 실험의 결과를 요약하고 정량적 인 분석을 제공합니다. HEWL 4 ~ 10 배 들어비 시드 트레이에 비해 rMMS은이 단백질에 적용했을 때, 관찰, 결정화 성공률의 증가. 특히 BLC위한 모피어스 화면에서 하나만 조건 rMMS 사용 다음 식별 55의 조건과 비교하여 결정을 수득하는 것으로 확인되었다. 또한, 각각 JCSG 및 PACT 화면을 사용하여 BLC 결정화의 성공률 3과 7 배 증가 하였다. 모든 경우에 상관없이 결정화 화면의 사용 rMMS 검사가 아닌 rMMS 검사보다 결정의 상당히 큰 수를 얻었다. rMMS 검사 실험의 반복은 rMMS 실험의 초기 라운드를 수행 할 때 희석 주식을 사용하기위한 요구 사항을 강화, 희석 씨의 주식을 사용할 때보다 훨씬 적은 안타를 산출 1:100 희석 씨앗을 사용하여 설명 할 수 있습니다. 크기, 형태, 복굴절에 의해 판단으로 두 단백질 결정의 품질에 약간의 명백한 변화가 있었다. DIF의 비교 평가종래의 검사 방법에 반대 rMMS을 사용하여 생성 된 결정의 분획 품질이 연구의 범위를 넘는다 그러나 rMMS 비 rMMS 화면으로부터 격리 두 단백질의 결정의 서브 세트의 방사광을 이용하여 초기 예비 회절 분석에있어 지시 해상도 제한 및 현장 프로필을 기반으로 판단으로, 회절 품질에 약간의 변화합니다.
방울 당 결정의 개수를 최적화 (B) 실시 예
Microseeding 기술은 정기적으로 작은 결정의 샤워 시설을 제공합니다. 이것은 핵 생성의 수준을 감소시키는 시드 스톡을 희석하는 것이 종종 필요가있다. 또한, 때때로 시드가 5를 사용하지 않을 때 rMMS 의해 발견 된 히트 조건에서 결정을 성장하기 불가능할 수있다. 이 같은 경우는 몇 방울 씨앗 주식의 다른 희석와 같은 저장 솔루션을 사용하여 설정된다 "고전"microseeding을 사용하는 것이 도움이된다. 이 C도 2에 도시 된 바와 같이이, "조합"접근 (폴 Reichert는 머크 연구소, 개인 통신)을 사용하여 단판에 몇개 리드 조건을 체계적으로 수행 될 수있다. 각 행의 방울에 추가됩니다 여기에 하나 이상의 히트 솔루션 (H1 - - H6)은 씨앗 주식의 다른 희석이 (S9 S1) 동안, 결정화 판의 열으로 분배된다. 따라서 히트 용액 및 희석 시드 콘텐츠의 모든 조합은 단판에 시험되고, 희석 및 존재하는 임의의 경향의 적절한 수준은 쉽게 식별 될 수있다.
우리는 세 가지 모델 단백질, 자일라나, 타우 마틴 서모이 조합 microseeding 방식을 적용했다. 각 단백질은 이전에 시드가없는 경우에는 결정을주지하는 것으로했다 결정화 조건에서 테스트하지만, 시드가 사용 된 경우 지속적으로 결정을했다했다. 크 실라 나제, 타우 마틴 t 사용 결정화 조건hermolysin는 표 2에 나와 있습니다. 그림과 같이 4 ~ 6 조건은 각각의 단백질 / 상태 / 종자 재고 조합의 두 개 또는 세 중 하나를 반복 각 단백질에 설립되었다. 방울은 0.3 ㎕의 단백질, 0.29 μL 저장 솔루션, 10 NL 씨의 주식을 구성. 모든 트레이는 액체 처리 결정화 로봇을 사용하여 설정 하였다. 깔끔한 씨앗 재고 및 그 여섯 희석은 각각의 단백질을 위해 설정되었다. 다른 실험 세부 사항은 이전에 12보고되었습니다. 드롭 당 얻어진 결정의 평균 수는 그림 3의 씨앗 주식의 희석에 그려집니다. 이러한 데이터는 결정의 수가 추가 종자의 수와 대략 선형의 관계를 다음과 것을 보여준다. 테스트 세 가지 단백질 1:10 -3 1:10 -6 희석은 드롭 당 1-10 결정을 얻기 위해 필요했다.
표 1. 재료의 목록입니다.
| 결정화 칵테일 | 트레이 당 설립 방울의 수 | |
| 크 실라 나제 (36 ㎎ / ㎖) | 2 M 황산 암모늄, 0.1 M 트리스 - 염산 pH를 8.5 | 3 |
| 크 실라 나제 (36 ㎎ / ㎖) | 30 % (w / v) PEG 4000, 0.2 M의 아세트산 나트륨, 0.1 M 트리스 - 염산 pH를 8.5 | 3 |
| 크 실라 나제 (36 ㎎ / ㎖) | 4 M 나트륨 포름산 | 3 |
| 크 실라 나제 (36 ㎎ / ㎖) | 3.5 M 황산 암모늄, 250 mM 염화나트륨, 50 mM의 나트륨 / 칼륨 인산염 pH를 7.5 | 3 |
| 크 실라 나제 (36 ㎎ / ㎖) | 1.5 M 인산 칼륨 pH를 7.0 | 3 |
| 타우 마틴 (30 ㎎ / ㎖) | 30 % (w / v) PEG 4000, 0.2 M 암모늄 아세테이트, 0.1 M 구연산 나트륨 pH를 5.6 | 2 |
| 20 % (w / v) PEG 4000, 20 % (v / v) 2 - 프로판올, 0.1 M 구연산 나트륨 pH를 5.6 | 2 | |
| 타우 마틴 (30 ㎎ / ㎖) | 30 (%의 w / v) PEG 8000, 0.2 M 황산 암모늄, 0.1 M 소듐 cacodylate 산도 6.5 | 2 |
| 타우 마틴 (30 ㎎ / ㎖) | 20 (%의 W / V) PEG 8000, 0.2 M 아세트산 마그네슘, 0.1 M 나트륨 cacodylate 산도 6.5 | 2 |
| 타우 마틴 (30 ㎎ / ㎖) | 2 M 황산 암모늄, 0.1 M 트리스 - 염산 pH를 8.5 | 2 |
| 타우 마틴 (30 ㎎ / ㎖) | 1.5 M의 황산 리튬, 100 mM의 HEPES pH를 7.5 | 2 |
| 써모 (15 ㎎ / ㎖) | 20.0 % (w / v) PEG 6000, 100 mM의 구연산 pH를 5.0 | 3 |
| 써모 (15 ㎎ / ㎖) | 1.26 M 황산 암모늄, 200 mM의 황산 리튬, 100 mM 트리스 - 염산 pH를 8.5 | 3 |
| 써모 (15 ㎎ / ㎖) | 10 % (V / V)MPD, 100 MM의 bicine 산도 9.0 | 3 |
| 써모 (15 ㎎ / ㎖) | 800 mM의 숙신산 pH를 7.0 | 3 |
표 2. 편성 microseeding 실험에 사용 된 단백질 용액 및 결정화 조건.
그림 1. (A) rMMS 비 rMMS 결정화 심사 실험의 비교. 결정 성장을지지하는 조건은 녹색이고, 결정 성장을 지원하지 않는 조건은 회색이다. 씨앗 주식 생성에 사용하기 위해 선택된 조건은 분홍색에 있습니다. (I) 암탉 흰자 리소자임, JCSG, 비 rMMS, (II) 암탉 흰자 리소자임, JCSG, rMMS, (III) 암탉 흰자 리소자임, PACT, 비 rMMS, (IV) 암탉은 다음과 결정화 화면이 표시되어 예를 들어, G 흰색 리소자임, PACT, rMMS, (V) 암탉 흰자 리소자임, 모피어스, 비 rMMS, (VI) 암탉 흰자 리소자임, 모피어스, rMMS, (VII) 소 간 카탈라제, JCSG, 비 rMMS, (VIII) 소 간 카탈라제, JCSG, rMMS, (IX) 소 간 카탈라제, PACT, 비 rMMS, (X) 소 간 카탈라제, PACT, rMMS, (XI) 소 간 카탈라제, 모피어스, 비 rMMS, (XII) 소 간 카탈라제, 모피어스, rMMS 비 rMMS 결정화 심사를 사용하여 결정화 성공률 rMMS. (B) 비교 분석. HEWL 또는 BLC 하나의 결정 성장을 지원하는 것으로 확인 된 결정화 조건의 수를 심사 rMMS이 빨간색으로 표시됩니다에 대한 비 rMMS이 HEWL 또는 BLC 하나의 결정 성장을 지원하는 것으로 확인 된 결정화 조건의 수를 심사, 파란색으로 표시됩니다. 데이터는 결정화 트레이 오일 포스트 설립 검사를 기준으로합니다.
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그림 2. 예를 들어 조합 microseeding 실험에서 하나의 단백질을 결정화 조건과 희석 씨 지료의 유통. 강조 열 H1-H6는 표적 단백질의 결정 성장을 지원하는 상이한 결정화 조건을 포함한다. 강조 행 S1-S7은 표적 단백질 씨앗 주식 현탁액의 다른 희석가 포함되어 있습니다.
그림 3. 씨앗의 주식 희석 및 조합 microseeding 실험에서 드롭 당 얻어진 결정의 평균 수 사이의 상관 관계. 사용 된 세 가지 단백질은 자일라나, 타우 마틴 서모했다. 방울 액체 처리 로봇을 사용하여 96 - 웰 MRC 플레이트에 설립, 0.3 ㎕의 단백질, 0.29 μL 저장 솔루션, 신선한 SE의 10 NL를 포함했다주식 에드. 제시된 데이터는 결정화 트레이 오일 포스트 설립 검사를 기준으로합니다.
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Discussion
본 논문에서 우리는 rMMS 단백질 결정화 검사에 대한 일반적인 방법을 설명했다. 우리는이 방법을 사용하여 두 개의 테스트 단백질 결정화 성공률에 상당한 향상을 사용하여 증명하고있다. rMMS 비 rMMS 방법을 사용하여 생성 된 결정의 서브 세트의 방사광을 사용하여 회절 분석은 이전의 저자는 좋은 품질 결정 rMMS 실험 11에서 성장할 가능성이있는 것으로보고되었지만, 방법을 사용하여 성장 결정 사이 회절 품질의 변동이 적고 밝혀 13. 그들은 결정화 비정상적으로 쉽기 때문에 HEWL 및 BLC는 전형적인 결과를 주어진 수 있습니다. 또한 rMMS 실험에 사용되는 크리스탈 시드 주식의 농도를 최적화의 중요성을 설명하고,이 회절 품질 결정의 최적의 수는 제조되는 것을 보장하기 위해 희석에 의해 조절 될 수있는 방법을 보여준다.
rMMS 높게, 심플, 높은 스루풋이며전통적인 스크리닝 방법을 보완하는 데 사용할 수있는 확장 가능한 방법. 실험은 96도 또는 24도 트레이에서 드롭 형식을 거는 나 앉아, 손으로 또는 로봇에 의해 설정 될 수 있습니다. rMMS의 주요 한계는 첫 번째 인스턴스에서 시드 주식을 생성하기 위해 표적 단백질 (또는 동종 단백질)의 결정 성 물질의 형태를 얻는 방법에 의존하고 있다는 점이다. 이는 고품질의 결정 성 물질이 필요하지 않은 것, 그러나 주목해야한다; 실제로 저자 성공적 시드 재고품 있도록 미세 결정 및 비결정 침전물을 사용했다. rMMS 스크리닝의 사용은 천연 단백질의 결정의 성장에 제한되지 않는다. 예를 들어, rMMS 잘 selenomethione 또는 셀레 노 시스테인으로 치환 변형의 결정 성장에 적합합니다. 이러한 경우, 원래의 단백질의 결정 시드 콘텐츠를 만들기 위해 사용될 수있다. 다른 결정 핵 생성 프로토콜 1,4 문서화되어 있지만, 아무도는 넓은 아칸소에로 적용 할 수 없습니다rMMS으로 단백질의 앤지.
rMMS 후에 편성 microseeding 접근법은 데이터 수집에 대한 결정을 생성하기 위해 시딩 수준을 최적화하기 위해 사용될 수있다. 이 결정의 다수가 자주 요구되는 리간드 전신 실험에 특히 도움이된다. 이 접근법보기 전체 결정화 스크린을 사용하여 신속하게 잘 각 결정의 상대적으로 적은 수를 산출하여, 희석 시드 콘텐츠와 조합 microseeding을 사용하여 확립 될 수있다.
결론적으로 우리는 rMMS 회절 결정이 초기 화면에서 직접 얻을 수없는 모든 경우에 자신의 일상적인 워크 플로우의 일부를 만들기 위해 고분자 결정화에 종사하는 사람을 격려한다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 BBSRC (BB/1006478/1)에 의해 부분적으로 투자되었다. PRR은 왕립 학회 대학 연구 활동의받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
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