Summary
Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir.
Abstract
Rasgele microseed matris taraması (RMMler) tohum kristalleri rasgele ekranlar ilave edildiği bir protein kristalleştirme tekniktir. Kristaller, bir protein faz diyagramının metastabl bölgede büyüyecek olasılığını artırarak, ilave kristalizasyon yol genellikle üretilen kristallerin kalitesi artırılabilir, elde edilir ve veri toplama ve ıslatma deneyler için kristallerinin iyi bir besleme sağlanır. Burada el ile ya da 96-kuyu veya 24-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla oturma veya asılı damla buharı difüzyon deneyleri, ya da uygulanabilir RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır.
Introduction
Perutz, Kendrew ve yapısal genomik konsorsiyumların, modern yüksek kapasiteli otomatik boru hatları, hemoglobin ve miyoglobin yapılarını belirlemede işçiler ile ilk uygulamadan, makromoleküler X-ışını kristalografisi bize protein dünyasına görülmemiş bir yapısal bir bakış tanınan vardır . Bu teknik, atom at protein yapısının doğrudan görselleştirme izin en yaygın uygulanan deneysel yöntem kalır, ya da (yani 1-3 Å aralığında) atomik çözünürlükte yakın. Bir proteine uygulanacak X-ışını difraksiyonu için bir ön gereklilik, ilk kristalize olması gerektiğini, ve bu kırınım yöntem 1, 2 ile yapı belirlenmesinde büyük tek oran-sınırlayıcı aşama kaldığı işlemin bu aşamasıdır. Bizim protein kristalleştirme sürecinin anlaşılması ve kristalizasyon ekranlarının kalitesi ve kullanılabilirliği önemli gelişmeler önemli gelişmelere rağmen,tepsiler ve ilgili teknolojiler, güvenilir kristalleşme başarının 3 olasılığını tahmin etmek imkansız kalır. Biyokimyasal ve Biyofiziksel yöntemler ilgi görüntüler bir kristal protein çekirdeklenme ve büyüme için elverişli özellikleri, yani iyi katlanmış, homojen, tek dağılımlı, vs olup olmadığını değerlendirmek için uygulanabilir, ancak, hiçbir şekilde bu anlayış kristalleşme kesin bir belirleyici sağlamak eğilimi.
Tohum uzun mevcut kristal veya kristal malzemenin 4-7 sayısı, boyutu ve kaliteyi artırmak için uygun bir yöntem olduğu iddia edilmiştir. Bu yaklaşım kristal çekirdeklenmesini destekleyen bir durumdur sonraki kristal büyümesi ve tersi için optimal olmayabilir önermesine dayanır. Başka bir durum nucleatedi malzemeyi aktararak, kimse, bu süreçlerin etkin ayrılabilmesi için yeni, henüz keşfedilmemiş kristalleşme alanı böylece veren erişimi deneyebilirve bunun sonucu olarak bir tarama deneyinin genel başarı oranı artmaktadır. Kurulan yöntemleri, genellikle, örneğin kullanılarak yönlü basınç uygulaması ile elde edilen (i) macroseeding, bir 8 bir durum bütünüyle tek bir kristalin transferi, (ii) bir çizgi ekim, çekirdekli malzeme transferi için belgelenmiştir Yeni bir kristalizasyon damla 9, ve (iii) "klasik" mikro-ile bıyık sonraki geçişi ve ardından var olan bir kristal, yüzeyine bir kedi bıyık, hasat tarafından üretilen kristal "tohum", transfer kristaller (ya da kristal halinde ezilmiş Tohumlar 10 vermiştir benzer koşullar malzemesi). Özellikle bu yöntemlerin her üç örneği, modern sıvı kullanım kristalleştirme ile elde robotik ne göre, zaman alıcı ve kötü ölçeklenebilir. Bu faktörler algı, en azından belli bir düzeyde, katkıda bu tohuming diğer yaklaşımlar meyvelerini başarısız olduğunda, yalnızca ziyaret edilecek bir yöntemdir.
Rasgele matris mikro-(RMMler) yüksek verimli tarama ve ölçeklenebilirlik 11-13 olanlar ile geleneksel mikro-avantajlarını birleştiren yeni bir metodolojik bir yeniliktir. Bu yaklaşım, bir standart 96-durum kristalleşme ekran içinde her sub-well/coverslip üzerine / içine örnek edilebilir çekirdekli kristal bir malzemeden üretilen bir tohum stoku nesil dayanır. Bu yöntem, her iki el ile ya da 24-kuyu veya 96-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla buharı difüzyon deneyleri, oturma ya da asılı için de geçerlidir. RMMler önemli ölçüde kristalleşme başarı oranını artırmak ve daha fazla kırınım kalite ve miktar 11, 13, 14 kristallerini üretmek için deneysel olarak gösterdi, ve o de yaklaşımların crystallographers 'cephanelik yeni bir araç temsil edilmiştirkristalleşme başarı yolunda çaba ngoing. Burada RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır ve bu tekniğin etkinliğini gösteren örnek veriler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Stratejik Düşünceler
- Mikro-deney için kullanılan tohum kristallerinin seçimi deney nesnesine bağlı olarak değişecektir. Bir projenin başında o kristal optimizasyonu için alternatif başlangıç noktaları sağlayabilir çeşitli kristalleşme hit bulmak için yararlı olur. iyi kalitede kristaller rahatsızlık ya da aşağıdaki sistem denge döner nükleasyon burada bölgede yani faz şeması, metastabl bölgede büyümeye daha muhtemel olduğu için RMMler büyük ölçüde kristal optimizasyonu için olan ihtiyacı azaltır. Bu nedenle ilk kristalleri kısa sürede (ilk kristaller büyüyen durdurmak gibi, daha doğru, ya da) elde edilir gibi rutin kısa sürede RMMler kullanmanızı öneririz.
- RMMler ilk tur için, tohum stok mümkün olduğu kadar çok kristalli bir malzeme ile yapılmalıdır. Sadece bir iyi varsa o kristalleri içeren veya kristaller küçük, eğer birden fazla tekrarlar kurmak yararlı olabilirkristallerin arzını artırmak için (tohumlama olmadan) orijinal hit. Bununla birlikte, pek çok farklı isabet elde edilir ise, tohum kristalleri çeşitli koşullarda hasat edilir ve bir arada karıştırılabilir.
- Faz ayrılmasını önlemek için, yüksek tuz koşullarında yetiştirilen kristalleri yüksek PEG koşullarında yetiştirilen kristallerinden ayrı hasat edilmelidir. Birkaç kuyulardan kristaller karıştırılır ise, tuz kristalleri vermek üzere daha az olasıdır bir çözelti, tohum süspansiyonu için seçilmelidir. Örneğin, fosfat, sülfat, kalsiyum ve magnezyum, yüksek dozlarda kaçınılmalıdır.
- Daha sonra bir projede bu kırınım geliştirmek çiftli kristaller önlemek ve ligandları bağlamak için uygun olan kristaller elde etmek için farklı bir birim hücre kristaller aramak için önemli olabilir. Bu aşamada (örneğin, en iyi kırılmaktadırlar olanlar) sadece en uygun tohum kristalleri stok yapmak için kullanılmalıdır. Mikro-Bazen tekrarlanan mermi nerede sadece "iyi, gerekli"Kristalleri, bir sonraki tur için ekim stok yapmak için kullanılır. Mümkünse," PEG 3000 gibi nötr "yeni bir kristal çökelti temas teşvik etmek ve yüksek olarak kararsız olabilir kompleksleri kristalize için tohum kristalleri askıya almak için kullanılmalıdır -tuz çözeltileri 12.
- Tek bir kristalleşme durumdur kullanılan klasik mikro-deneyleri, umut verici bir durum ve sonraki optimizasyonu sırasında kimlik aşağıdaki sıklıkla faydalıdır. Bu damla başına kristallerinin istenen sayısını elde etmek için tohum stok sulandırmak için genellikle gereklidir. (Artan seyreltme tohum stoklarının bir dizi bir kristalizasyon eklenir) bir "birleştirici" mikro-deney tohum stoku optimum seyreltme oranını bulmak için hızlı bir yöntemdir. Bu yaklaşım, aşağıda tarif edilmektedir.
2. Tohum Stok hazırlanması
- Bir Bunsen alev kullanarak cam Pasteur pipeti bir yuvarlak cam soruşturma yapmak.
- Yumuşak hale gelinceye kadar ortasına yakın pipet ısıtın, sonra hızla alev çıkarın ve uçlarını ayrı çekerek dışarı çizin. Aşağı 0.25 mm altında bir çapa cam çekmek için hedefliyoruz.
- Bu yaklaşık 0.25 mm olan ve kısa bir süre alev içine kırık ucu dalma noktasında cam kırın. ~ 0.75 mm'lik bir çapa ucunda oluşturulur ile cam bir hemisfer kadar bu işlemi tekrar edin. Uygun şekilde 0.01-1.0 mm ölçekte katı nesnelerin çarpıcı için boyutlandırılır ve bir kristalizasyon tepsi alt oyuk ya da lamel plastik yüzeyine zarar vermez gibi bu prob, kristal halinde malzemeyi kırmak için yararlıdır. Kristalleri, cam ve plastik arasında sıkışıp çünkü büyük sondalar (~ 1.0 mm) daha etkili küçük kristaller ezmek olabilir.
- Buz üzerinde tohum Boncuk ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
- Binoküler mikroskop veya kristal görüntüleme sistemi kullanılarak önceden belirlenmiş kristalleşme tepsisini kontrol edin ve bir veya daha fazla ap seçintohum stok üretimi için kristal malzeme hasat için hangi tepsiden kuyuları propriate. Herhangi bir malzeme ince iğneler, kürecikler, mikro kristalleri ve düzensiz, kötü biçimli kristallerden de dahil olmak üzere kullanılabilir. Büyük malzeme, kısmen çapraz bağlanmış olması daha muhtemel olduğu gibi tohum stoku, böylece tohum deneylerde kullanım için uygunluğu azaltarak, en kısa sürede mümkün olan en kristaller artan durdurduktan sonra yapılmalıdır. Herhangi bir şüphe hasat edilecek olan kristal malzeme iyi bir UV floresan mikroskop ya da görüntüleme sistemi, açılmadan önceki kullanılarak görüntülenebilir, veya, kristalin malzemenin bir in-situ X-ışını kırınım analizi için tabi tutulabilir bir tuzu ya da protein olup olmadığı konusunda varsa Tepsiye. UV ışınlaması altında floresan olacak eski yaklaşım protein kristalleri kullanırken, tuz kristalleri renksiz görünür.
- Iyi seçilmiş kristalleşme tepsisini açın. 96-çevresinde de üst plastik sızdırmazlık levha kesti damla tepsilerini oturan için usi iyi seçilmişBir neşter bıçak ng. 24-iyi asılı damla tepsiler için bir cımbız kullanarak lamel kaldırmak. Lamel ters çevirin ve istikrarlı temiz bir yüzey üzerine koyun. Rezervuar çözeltisi 50 ul çıkarın ve boru boyunca buz üzerinde kalmasını sağlamak tohum boncuk içeren mikrosantrifüj tüpüne bu sıvıyı transfer.
- İyice mikroskop altında sonuçlarını görüntüleme, bölüm 2.1 'de hazırlanan cam sonda kullanılarak, subwell (96 oyuklu tepsi), lamel (24-çukurlu tabla) damla olarak kristaller ezmek. Küçük kristaller iyice ezmek için birkaç dakika sürebilir. Bu adım, deneyci kristaller tuz kristalleri olduğu da ezmek için kolaydır ve bu yüzden, çapraz bağlantılı değildir, ve bu kontrol sağlar. Tuz kristalleri duydum ve onlar ezilmiş zaman hissedilebilir bir ayırt edici tıklayın üretirler. Kristaller taze malzeme elde edilir ve kullanılır denemek ezmek için sert ve zor ise.
- Tohum Boncuk tüp ve t rezervuar çözeltisi 5 ul kaldırransfer eşdeğer alt oyuk (damla deneyi oturma) ya da lamel (asılı damla deneyi) hasat edilecek olan, kristal halinde malzemeyi ihtiva eden için. Mümkün olan en alt iyi ya da lamel içindekiler kadar yeniden askıya almak için, bu sıvı yukarı ve aşağı 5-6 kez Pipet. Tohum Boncuk tüp süspansiyon dönmek ve çok kristalli malzeme mümkün olduğunca hasat sağlayarak, iki kez daha bu adımı tekrarlayın.
- Buz üzerinde tüp soğutmak için her 30 saniye durma, iki dakika için tohum boncuk vorteksleyin.
- 4, her bir aşamada 10 kadar bir faktör ile çözeltide tohum stok seyreltilmesi, bir seyreltme serisi yapın. Tipik olarak, çok fazla kristal seyreltilmemiş tohum stokları kullanılıyorsa elde edilen, yani oyuk başına kristallerinin sayısını kontrol etmek için seyreltilmiş tohum stokları kullanmak olacaktır. Tohumların konsantrasyonu daha fazla kristalleşme vurur elde edilecek beri RMMler ilk turda, o tohum stok solüsyonu sulandırmak için önemli değildir.
- Bu derhal kullanılmak üzere değilserilmesi, bir -20 ° C tohum stok süspansiyonu ile sulandırılmış tohum stokları transferi, ya da depolama için -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya. Küçük hacimli alikotları örneğin, 10-20 ul, bu malzemeyi depolamak, tohum stoku etkinliğini azaltabilir ki, tekrarlanan donma-erime döngülerinden önlemek. Dondurulmuş kez ihtiyaç kadar, tohum stoklarının süresiz muhafaza edilebilir.
3. Kristalizasyon Tepsi kurulması
- Kristalleşme tesisleri ve deneyci tercihleri mevcudiyetine bağlı olarak, RMMler kristalleşme tarama oturan damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak asılı damla buhar difüzyon yöntemi kullanılarak 24-kuyu tepsileri, veya 96-kuyu tepsileri kullanarak yapılabilir. RMMler için kristalizasyon tepsiler robotik işleme bir sıvı dağıtıcı ya da ikisinin bir kombinasyonu kullanılarak, elle ya da kurulabilir.
- Elle kurulmuş tipik bir RMMler deney, 1.0 ul protein çözeltisi, 1.0 ul kristalleşme durumu ihtiva edecek ve0.5 ul tohum stok. Bir kristalleşme robot kullanarak kurmak tipik bir deney, 0.3 ul protein çözeltisi, 0.2 ul kristalleşme durumu ve 0.1 ul tohum stok içerecektir.
- 24-çukurlu damla tepsiler askıdaki RMMler tarama gerçekleştirmek için, ilk olarak, bir el pipet kullanılarak, 4 x 24 oyuklu pregreased kristalleştirme her kuyuya, 10 ml bir tüp biçiminde bir 96 oyuklu durum kristalleşme ekranından her bir durum içinde 300 ul transfer tepsiler.
- Her ikisi de ön ve arka koruyucu alt şeritler çıkarılınca edilmiş olan karşılık gelen bir plastik lamel yüzeyi üzerine her bir 300 ul her bir hazneden kristalizasyon transferi 1 ul.
- Her bir kristalizasyon durumunun 1 ul için kristal tohum stoklar 0.5 ul ve ardından protein çözeltisi 1 ul ekle. Sıvı damla aşağı doğru bakan ve de uygun yukarıdaki pozisyonu olduğu gibi her lamel ters çevirin.
- Aşağıya lamel basın, seali sıkıştırılmasıyağ ng güvenli bir yalıtım oluşturur. Bir kere 96 damla kurulmuş, tepsi genellikle depolama için yaş aralığı 4-18 ° C, bir inkübatör veya sabit sıcaklık odasında transfer edilmelidir.
- 96 oyuklu damla tepsisi ilk olarak her bir kristalleşme tepsinin de karşılık gelen derin kuyu blok biçiminde, 96 oyuklu bir durum kristalleşme ekranından her bir durum 20-50 ul transfer oturma RMMler tarama yapmak için. Bu transfer adımı, 8 kanallı pipet kullanarak, bir kristalizasyon robot ya da manuel transferi kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Elle veya 3.1 ayrıntılı hacimleri kullanarak bir robot ile damla transfer rezervuar, protein ve tohum stok çözümleri. Bazı ticari kristalleşme robotlar kesiciyi temas etmezler ve böyle bir sistemi kullanarak bir performans tohum hisse devir ipuçlarını veya ilgili boruları dağıtım tıkanmasına neden olabilir. Dağıtma sırası değişkendir: Bazı robotlar aynı anda tüm çözümleri dağıtmak. Eğersonra stok tohum, rezervuar sonra, ilk protein dağıtmak, bu, mümkün değildir.
- Robot tevzi bir temas, kör bir iğne ile donatılmış bir düşük hacimli bir cam şırınga kullanılarak tohum mevcut transfer değilse. Daha sonra her bir damla halinde, tohum dağıtım stok rezervuar çözelti içinden geçirilerek iğne durulayın.
- Şeffaf sızdırmazlık sayfasını kullanarak tepsiyi Seal ve bir inkübatör veya depolama için sabit sıcaklık odasında transfer.
4. Kristalizasyon Tepsi Muayene
- Binoküler mikroskop ya da bir kristal görüntüleme sistemi kullanılarak tüm kristalizasyon deneyleri gözünüzde canlandırın. İlk madde genel görünüşüdür derinliği boyunca, kullanıcı daha fazla kontrol ve ikinci daha büyütme derecesini elde edilir, ancak daha fazla zaman alır.
- Sırayla her sub-well/coverslip incelemek ve kristal oluşumu herhangi bir kanıt kaydedin. Deneyler her 24 kurulmasını takiben 5 gün boyunca saat ve kontrol edilmelidirn daha sonra bir kez kadar 4 hafta boyunca her 7 gün.
- Optimum kırılma kaliteli kristaller üretilmektedir önce RMMler birden döngüleri genellikle gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir RMMler deney (A) Örnek
RMMler tarama etkinliğini göstermek için, biz tavuk yumurtası beyaz lisozim (HEWL) ve sığır karaciğer katalaz (BLC) kristalizasyonuna için bu yöntemi uygulanır. Bu enzimler fazlasıyla kristalize olan ve yapısal olarak iyi hedefleri 15, 16 karakterize edilir hem de. Böyle iki RMMler ile elde geliştirilmiş kristalleşme başarı oranını göstermek için mükemmel denekler sağlamak gibi. Kristalizasyon deneyleri 96-sıra sıvı taşıma robotik kullanarak açılan tepsi biçiminde oturan kuruldu. HEWL ve BLC çözümü, sırasıyla 100 mg / ml ve 20 mg / ml 'lik nihai konsantrasyonda 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7.5, içinde her biri liyofilize tozların eritilmesi ile üretildi. Her protein için üç 96-durum kristalleşme ekranlar kullanıldı; JCSG, PACT ve Morpheus. Mikro-olmayan kristalizasyon tarama rezervuar 50 ul hacimli ve 2 ul kullanılarak gerçekleştirilmiştirprotein çözeltisi 1 ul ve rezervuar çözeltisi ihtiva eden 1 ul damla oturma. Altı tepsiler 18 ° C'de sabit sıcaklık odasında saklanır ve binoküler mikroskop kullanılarak günlük kontrol edildi. Kristal büyüme herhangi bir kanıt kaydedildi. Beş gün sonra, kristal malzemenin gelişimini desteklemek için bulunmuştur, her tepsi tek seçilen koşul ve ekim stok üretimi için kullanılır. RMMler tarama protein çözeltisi 1 ul, rezervuar çözeltisi 1 ul ve tohum için stoklar 0.5 ul içeren oturan damla 2.5 | il kullanıldı olması hariç olmak üzere, non-RMMler tarama gibi gerçekleştirilmiştir. Altı RMMler tepsiler 18 ° C 'de bir sabit sıcaklık odasında aktarılır ve bir mikroskop kullanılarak günlük olarak incelendi. Beş gün sonra, her ikisi de proteinlerin RMMler tepsiler incelendi ve kristalleri ile damla sayısı kaydedildi. Şekil 1, bu deneyden elde edilen sonuçları özetlemektedir ve kantitatif analiz sağlar. HEWL bir 4-10 kat içinnon-tohumlu tepsiler ile karşılaştırıldığında RMMler bu proteine uygulandığı zaman, gözlenmiştir, kristalleşme başarı oranı artar. Özellikle BLC Morpheus ekranındaki tek bir durum RMMler kullanımı, aşağıdaki tanımlanan 55 koşullar ile karşılaştırıldığında, kristaller elde etmek için bulunmuştur. Bundan başka, sırasıyla JCSG ve PACT ekranlar kullanan BLC kristalizasyonda başarı oranında bir 3 ila 7-kat daha yüksek olmuştur. Tüm durumlarda, ve ne olursa olsun kristalleşme ekranın kullanılan RMMler tarama olmayan RMMler tarama göre kristaller önemli ölçüde daha büyük sayısı elde edilmiştir. RMMler eleme deneylerinde tekrarı RMMler deneylerin ilk turda gerçekleştirirken seyreltilmeden stokları kullanma gereksinimini takviye edici, seyreltilmemiş tohum stoku kullanılan duruma göre önemli ölçüde daha az bir isabet elde 1:100 seyreltilmiş tohum kullanılarak açıklanmıştır. Boyutu, morfolojisi ve çiftkırılım tarafından değerlendirilecek hem proteinlerin kristal kalitesinde çok az belirgin bir farklılaşma vardı. Dif karşılaştırmalı değerlendirmesiGeleneksel tarama yöntemlerinin aksine RMMler kullanılarak üretilen kristallerin kalitesi fraksiyonu bu çalışmanın dışında daha Ancak RMMler olmayan RMMler eleme işlemlerinden izole edilmiş iki protein kristallerinin bir alt kümesi senkrotron radyasyonu kullanılarak ilk ön difraksiyon analizi için orada belirtilen çözünürlük sınırı ve spot profiline göre değerlendirilecek, kırınım kalitesinde çok az varyasyon.
Damla başına kristaller sayısını optimize (B) Örnek
Mikro-teknikleri düzenli küçük kristallerin duş verir. Bu, çekirdek oluşum seviyesini azaltmak için tohum stokları seyreltilmesi için genellikle gereklidir. Ayrıca, bazen tohumlama 5 kullanılmadığında RMMler tarafından bulunmuştur hit koşullarda kristallerinin büyümesini mümkün olabilir. Böyle durumlarda birkaç damla bir tohum stokunun farklı seyreltmesi ile aynı rezervuar çözümü kullanılarak ayarlanır "klasik" mikro-kullanmak için genellikle yararlı olur. Bu cŞekil 2'de gösterildiği gibi bir "birleştirici" bir yaklaşım (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, kişisel iletişim) kullanılarak, tek bir plaka üzerinde birden fazla talebi koşulları için sistematik olarak yapılabilir. Her satırın damla ilave edilir burada bir veya daha fazla hit solüsyonlar (H1 - - H6) bir tohum için stoklar farklı bir seyreltme (S9 S1) ise, bir kristalizasyon plakanın sütunlar halinde dağıtılır. Bu nedenle isabet çözüm ve seyreltilmiş tohum stokunun her kombinasyonu tek bir plaka üzerinde test edilir ve seyreltme ve mevcut herhangi eğilimlerin uygun seviyede kolayca tespit edilebilir.
Biz üç modeli proteinler, xylanase, taumatin ve termosilin bu birleştirici mikro-yaklaşım uygulanmıştır. Her protein, daha önce tohum yokluğunda hiçbir kristaller vermek üzere, gösterilmiş olan bir kristalleştirme koşulu ile test edilmiş, ancak tohum kullanıldığında sürekli kristaller vermiştir. Ksilanaz, taumatin ve t için kullanılan kristalizasyon koşullarıhermolysin Tablo 2'de listelenmiştir. Gösterildiği gibi, dört ila altı koşulları her bir protein / durum / tohum stoku kombinasyonunun iki ya da üç ya da tekrar ile her bir protein için kurulmuştur. Damlalar 0.3 ul protein, 0.29 ul rezervuar solüsyonu ve 10 nl tohum stok oluşmaktadır. Tüm tepsiler bir sıvı taşıma kristalleşme robot kullanılarak oluşturuldu. Temiz tohum stoku ve bunların altı sulandırmalar her protein için kurulmuştur. Diğer deneysel ayrıntıları daha önce 12 olarak bildirilmiştir. Damla başına elde edilen kristallerin ortalama sayısı, Şekil 3 'de tohum stokunun seyreltme karşı çizilir. Bu veriler kristallerinin sayısı, ilave edilen tohumların numarası ile hemen hemen doğrusal bir ilişki aşağıdaki göstermektedir. Test edilen üç proteinleri için, 1:10 ila 1:10 -3 -6 seyreltileri damla başına 1-10 kristallerinin elde edilmesi için gerekli idi.
Tablo 1. Malzeme listesi.
| Kristalleşme kokteyl | Tepsi başına kurulan damla sayısı | |
| Xylanase (36 mg / ml) | 2 M amonyum sülfat, 0.1 M Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | % 30 (ağ / hac) PEG 4000, 0.2 M sodyum asetat, 0.1 M Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 4 M sodyum format | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 3.5 M amonyum sülfat, 250 mM sodyum klorid, 50 mM sodyum / potasyum fosfat pH 7.5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 1.5 M potasyum fosfat pH 7.0 | 3 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | % 30 (ağ / hac) PEG 4000, 0.2 M amonyum asetat, 0.1 M sodyum sitrat pH 5.6 | 2 |
| % 20 (ağ / hac) PEG 4000,% 20 (v / v) 2-propanol, 0.1 M sodyum sitrat pH 5.6 | 2 | |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 30 (% ağ / hac) PEG 8000, 0.2 M amonyum sülfat, 0.1 M sodyum kakodilat, pH 6.5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 20 (% ağ / hac) PEG 8000, 0.2 M magnezyum asetat, 0.1 M sodyum kakodilat, pH 6.5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 2 M amonyum sülfat, 0.1 M Tris-HCl pH 8.5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 1.5 M lityum sülfat, 100 mM HEPES pH 7.5 | 2 |
| Termolizin (15 mg / ml) | % 20.0 (ağ / hac) PEG 6000, 100 mM sitrik asit pH 5.0 | 3 |
| Termolizin (15 mg / ml) | 1.26 M amonyum sülfat, 200 mM lityum sülfat, 100 mM Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Termolizin (15 mg / ml) | % 10 (v / v)MPD, 100 mM bisin pH 9.0 | 3 |
| Termolizin (15 mg / ml) | 800 mM süksinik asit pH 7.0 | 3 |
Tablo 2. Kombinatoryal mikro-deneyde kullanılan protein çözeltiler ve kristalizasyon koşulları.
Şekil 1. (A) RMMler olmayan RMMler kristalleştirme eleme deneylerinde karşılaştırılması. Kristal büyümeyi destekleyen koşullar yeşilde, kristal büyümesini destekleyen değil koşullar gri vardır. Tohum stoku nesil kullanım için seçilen şartlar pembe içindedir. (I) tavuk yumurtası beyaz lisozim, JCSG, non-RMMler, (ii) tavuk yumurtası beyaz lisozim, JCSG, RMMler, (iii) tavuk yumurtası beyaz lisozim, PACT, non-RMMler, (iv) tavuk aşağıdaki gibi kristallendirme ekranlar etiketlenir örneğin g beyaz lizozim, PAKT, RMMler, (v) tavuk yumurtası beyaz lizozim, Morpheus, non-RMMler, (vi) tavuk yumurtası beyaz lizozim, Morpheus, RMMler, (vii) sığır karaciğer katalaz, JCSG olmayan RMMler, (viii) sığır karaciğer katalaz, JCSG, RMMler, (ix) sığır karaciğer katalaz, PACT olmayan RMMler, (x) sığır karaciğer katalaz, PAKT, RMMler, (xi) sığır karaciğer katalaz, Morpheus, non-RMMler, (xii) sığır karaciğer katalaz, Morpheus, RMMler ve non-RMMler kristalleşme tarama kullanarak kristalleşme başarı oranı RMMler. (B) karşılaştırmalı analizi. HEWL veya BLC ya kristal büyümesini destekleyici olarak tanımlanan kristalleşme koşullarının sayısını tarama RMMler kırmızı gösterilmiştir olmayan RMMler HEWL veya BLC ya kristal büyümesini destekleyici olarak tanımlanan kristalleşme koşullarının sayıda tarama için, mavi gösterilmiştir. Veri kristalleşme tepsiler 5 gün sonrası kurulması denetimine dayanmaktadır.
2.jpg "/>
Şekil 2. Bir örnek kombinasyonal mikro-deneyde, tek bir protein için kristalleşme koşullarına ve seyreltilmiş tohum stok süspansiyonlar Dağılımı. Asma sütun H1-H6 hedef protein kristal büyümesini destekleyen, farklı kristalleşme koşulları içerir. Asma satır S1-S7, bir hedef protein tohum stok süspansiyonu farklı dilüsyonları içerir.
Şekil 3,. Tohum stok seyreltme ve birleştirici bir mikro-deneyinde damla başına elde edilen kristallerin ortalama sayısı arasındaki ilişki. Kullanılan üç protein ksilanaz, taumatin ve termolisin edildi. Damlalar bir sıvı kotarma robotu kullanılarak bir 96-çukurlu plaka MRC kurulmuş ve 0.3 ul protein, 0.29 ul rezervuar çözeltisi ve taze se 10 nl ihtiva edilmiştirstok ed. Sunulan veriler, kristalleştirme tepsiler 5 gün sonra kuruluş yoklanmasına dayanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda RMMler protein kristalleşme taraması için genel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntemi kullanarak, iki test proteinleri kristalleşme başarı oranında önemli bir artış ile göstermiştir. RMMler olmayan RMMler yöntemlerle üretilen kristaller bir alt kümesi senkrotron radyasyonu kullanılarak kırınım analizi, önceki yazarlar iyi kalitede kristaller RMMler deneylerde 11 büyümeye daha fazla olduğunu rapor olmasına rağmen, her iki yöntemi kullanılarak yetiştirilir kristalleri arasında difraksiyon kalitesinde daha az değişiklik ortaya 13. Onlar kristalize alışılmadık kolay çünkü HEWL ve BLC atipik sonuçlar vermiş olabilir. Ayrıca RMMler deneylerde kullanılan kristal tohum stoklarının konsantrasyonunun optimize önemini göstermektedir ve bu kırılma kalitesi kristallerinin bir uygun sayısı üretilir sağlamak için seyreltme ile ayarlanabilir gösterilmektedir.
RMMler son derece basit ve yüksek bir kapasiteye sahip olmasıdırGeleneksel tarama yöntemleri tamamlamak için kullanılabilir ölçeklenebilir yöntemi. Deneyler 96-kuyu veya 24-kuyu tepsiler, ve damla biçimlerini asılı ya da oturma, elden veya robot tarafından ayarlanabilir. RMMler başlıca sınırlama ilk olarak bir tohum stokları üretmek amacıyla bir hedef proteinin (ya da homolog bir protein) olan kristalimsi bir malzemenin bir formu elde bağımlı olmasıdır. Yüksek-kaliteli, kristalin madde gerekli değildir Bununla birlikte not edilmelidir, gerçekten de yazarlar, başarılı tohum stokları için mikro kristalleri ve amorf bir çökelti kullandık. RMMler tarama kullanılması doğal proteinlerin kristallerinin büyümesine sınırlı değildir. Örneğin, iyi RMMler selenomethione veya selenosistein ikame varyantlarının artan kristaller için uygundur. Bu gibi durumlarda, doğal proteinin tohum kristalleri stok yapmak için kullanılabilir. Alternatif kristal nükleasyon protokolleri 1,4 dokümante edilmiş olmasına rağmen, hiçbiri geniş AR için geçerlidirRMMler gibi proteinlerin ange.
RMMler sonra, mikro-kombinatoryal yaklaşım, veri toplama için kristalleri üretmek amacıyla tohumlama seviyesini optimize etmek için kullanılabilir. Bu kristallerden oluşan büyük bir sayıda sık sık gerekmektedir ligand-ıslatma deneyler için özellikle yararlıdır. Bu yaklaşım bütün bir ekranı kristalleştirme kullanılarak hızlı bir şekilde her bir kristallerinin nispeten az sayıda elde ile, seyreltilmiş tohum stoku ile kombinasyon halinde mikro-kullanılarak kurulabilir.
Sonuç olarak RMMler kırıcı kristaller başlangıç ekranlarından doğrudan elde değil tüm durumlarda rutin iş akışının bir parçası yapmak için makromoleküler kristalleşme yapan herkes teşvik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma BBSRC (BB/1006478/1) tarafından kısmen finanse edildi. PRR Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu almıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
