Summary
Здесь мы опишем общий метод случайной microseed матрицы скрининга. Этот метод показан значительно увеличить шансы на успех белковых кристаллизации скрининга экспериментов, снизить потребность в оптимизации, а также обеспечить надежную поставку кристаллов для сбора данных и лиганд-купания экспериментов.
Abstract
Случайное скрининг microseed матрица (РММС) представляет собой метод кристаллизации белка, в котором затравочные кристаллы добавлен в случайных экранов. Увеличивая вероятность того, что кристаллы будут расти в метастабильной зоны фазовой диаграммы белка, дополнительные провода кристаллизации часто получают, качество кристаллов, произведенных может быть увеличена, и хороший запас кристаллов для сбора данных и купания экспериментов обеспечивается. Здесь мы опишем общий метод РММС, которые могут быть применены к либо сидя падение или висит диффузии экспериментов пара падение, установленных вручную или с использованием жидких робототехнику обработки, в 96-колодца или формате 24-а в трее.
Introduction
С момента своего первоначального заявления Перутца, Кендрю с сотрудниками в определении структуры гемоглобина и миоглобина, к современным высокой пропускной автоматизированных трубопроводов структурной геномики консорциумов, макромолекулярный рентгеновской кристаллографии предоставил нам беспрецедентную структурную заглянуть в мире белка . Этот метод остается наиболее широко применяется экспериментальный метод, который позволяет прямой визуализации структуры белка в атомной, или около атомным разрешением (т.е. в диапазоне 1-3 Å). Предпосылкой для рентгеновской дифракции, которая будет применяться к белку в том, что оно должно быть сначала кристаллизуется, и именно это этап процесса, который остается самым крупным ограничение скорости шаг в определении структуры дифракционными методами 1, 2. Несмотря на значительные успехи в понимании процесса кристаллизации белков, и значительные улучшения в качестве и доступности экранов кристаллизации,лотки, и связанные с ними технологии, остается невозможным достоверно предсказать вероятность успеха кристаллизации 3. Биохимические и биофизические методы могут быть применены для оценки того белок процентных дисплеев благоприятные характеристики для зарождения кристаллов и роста, то есть это хорошо сложенный, однородная, монодисперсными и т.д., однако, эти знания ни в коей мере обеспечить окончательный предиктором кристаллизации склонность.
Посев уже давно якобы быть жизнеспособным способ улучшения количество, размер и качество существующих кристаллов или кристаллического материала 4-7. Этот подход основан на том, что состояние, которое поддерживает зарождения кристаллов не может быть оптимальным для последующего роста кристаллов и наоборот. Передавая ядросодержащие материал из одного состояния в другое, можно попытаться эффективно отделить эти процессы, тем самым, предоставляя доступ к новым, еще неизведанные пространства кристаллизации,и в результате увеличения общего показателя успешности скрининга эксперимента. Штатные методы были зарегистрированы для (I) macroseeding, передача монокристалла во всей его полноте из одного состояния в другое 8, (II) полоска посева, передача зародышевого материала, как правило, полученной путем применения направленного давления с использованием, например усов у кошки на поверхность существующей кристалла, а затем последующего прохождения минимальным через новый падения кристаллизации 9, и (III) "классической" microseeding, передача Кристалл "семян", порожденных уборки раздавил кристаллы (или кристаллический материал), в условиях, сходных с теми, которые дали семенам 10. Примечательно все три из этих методов требуют много времени и плохо масштабируемым, конечно по сравнению с тем, что это достижимо с современными робототехники кристаллизации обработки жидкостей. Эти факторы способствовали, в какой-то степени, по крайней мере, в восприятии, что семяIng является методом для посещения только тогда, когда другие подходы не смогли приносить свои плоды.
Случайная матрица microseeding (РММС) Недавнее методологическая инновация, которая сочетает в себе преимущества традиционного microseeding с тех скрининга высокой пропускной и масштабируемости 11-13. Этот подход основан на генерации семенного материала, полученного из зародышевого кристаллического материала, который может быть аликвоты в / на каждой sub-well/coverslip в пределах стандартного экрана кристаллизации 96-условию. Этот метод применим к обоим сидя или висит пара падение диффузии эксперименты, установленные вручную или с использованием жидких робототехнику обработки, в 24-колодца или 96-луночного формата трее. РММС было продемонстрировано экспериментально значительно увеличить показатель успеха кристаллизации, и производят кристаллы повышения качества дифракции и количества 11, 13, 14, и представляет собой инновационный инструмент в арсенале кристаллографы "подходов в оNgoing усилия на пути к успеху кристаллизации. Здесь мы опишем общий метод РММС и обеспечить образцы данных, иллюстрирующих эффективность этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Стратегические соображения
- Выбор семенных кристаллов используется для microseeding экспериментов будет варьироваться в зависимости от целей эксперимента. В начале проекта было бы полезно, чтобы найти несколько хитов кристаллизации, которые могут обеспечить альтернативные отправные точки для оптимизации кристалла. РММС значительно снижает потребность в оптимизации кристаллической потому хорошего качества кристаллы, скорее всего, расти в метастабильной зоны фазовой диаграммы, т.е. в области, где следующие нарушения или зародышей система возвращается к равновесию. Поэтому мы предлагаем использовать РММС регулярно, как только первые кристаллы получаются (или, точнее, как только первые кристаллы перестают расти).
- Для первого раунда РММС, семенной фонд должны быть сделаны с такой же кристаллического материала, как это возможно. Если только один хорошо доступен, который содержит кристаллы, или если кристаллы малы, это может быть полезно для создания нескольких повторенийОригинальный хит (без посева) увеличить поставки кристаллов. Если, однако, несколько различных показов получены, затравочные кристаллы могут быть собраны из нескольких условий и смешивают вместе.
- Чтобы избежать разделения фаз, кристаллы, выращенные в условиях высокого соли должны быть собраны отдельно от кристаллов, выращенных в условиях высокого PEG. Если кристаллы из нескольких скважин смешивают, резервуар решение, менее вероятно, чтобы получить кристаллы соли должны быть выбраны для семян суспензии. Например, высокие концентрации фосфата, сульфата, кальция и магния следует избегать.
- Позже в проекте может быть важно, чтобы искать кристаллов с различными единичными элементами, чтобы улучшить дифракции, избежать двойниковых кристаллов, и получени кристаллов, которые подходят для связывания лигандов. На этой стадии только наиболее подходящие кристаллы (например, те, которые лучше всего преломлять) должен быть использован, чтобы сделать семенного фонда. Иногда повторные раунды microseeding требуются, где только "лучший"Кристаллы используются для создания семенного фонда для последующего раунда. Если это возможно,« нейтральный »осадителем такие как ПЭГ 3000 следует использовать приостановить затравочных кристаллов в поощрять новые хрустальные контакты и кристаллизоваться комплексы, которые могут быть нестабильными в высокой -солевые растворы 12.
- Классические эксперименты microseeding, где используется одно условие кристаллизации, часто бывают полезны после выявления перспективной состоянии и во время последующей оптимизации. Часто бывает необходимо разбавить семенного фонда, чтобы получить желаемое количество кристаллов на капли. "Комбинаторным" microseeding эксперимент (где ряд семенных запасов увеличением разбавления добавляют в состоянии кристаллизации) представляет собой быстрый способ для поиска оптимального разбавление семенного материала. Этот подход описан ниже.
2. Подготовка семенного фонда
- Сделать округлый стеклянный зонд из стекла пипетки Пастера с помощью пламени Бунзена.
- Нагрейте пипетку около середины, пока она не станет мягкой, а затем быстро снимите его с огня и оттянет, потянув за исключением концы. Цель вытащить стакан с диаметром менее 0,25 мм.
- Разбить стекло в точке, где она составляет около 0,25 мм и кратко окунуться сломанный конец в пламя. Повторите это, пока полусферы из стекла диаметром ~ 0,75 мм формируется на конце. Этот зонд полезно для дробления кристаллического материала, как это соответствующего размера для ударов твердых предметов на 0,01-1,0 мм масштабе и не повредить пластиковую поверхность кристаллизации лоток суб-колодца или покровное. Большие зонды (~ 1,0 мм) может раздавить маленькие кристаллы более эффективно, потому что кристаллы оказались в ловушке между стеклом и пластиком.
- Поместите 1.5 мл микроцентрифужную пробирку, содержащую бисера на льду.
- Проверьте заранее установленный лоток кристаллизации с помощью бинокулярного микроскопа или системы кристалл изображений и выберите один или несколько арpropriate скважин из лотка, из которого собрать кристаллический материал для производства семенного материала. Любой материал может быть использован в том числе тонких игл, сферолитов, микрокристаллов и нерегулярных, плохо образованных кристаллов. Семенной фонд должны быть сделаны как можно скорее после того, как кристаллы перестают расти, как старший материал, скорее всего, частично сшитый, тем самым уменьшая его пригодность для использования в посевных экспериментов. В случае каких-либо сомнений относительно того, кристаллический материал, чтобы быть собраны, является ли соль или белок вполне может быть визуализированы с помощью УФ-флуоресцентного микроскопа или систему формирования изображения перед открытием или кристаллический материал может быть подвергнут на месте рентгеновского дифракционного анализа в лоток. При использовании бывших кристаллы подход белка высветится под УФ-облучения, кристаллы соли появится бесцветным.
- Откройте выбранный лоток кристаллизации хорошо. Для 96-а, сидя падение лотки прорезать верхней уплотнительной листа пластика вокруг выбранный хорошо USIнг лезвие скальпеля. Для 24-а лотки капля крови удалить покровное использованием пинцета. Обратить покровное и поместите его на устойчивую чистую поверхность. Удалить 50 мкл раствора резервуара и передавать эту жидкость в микроцентрифужных трубки, содержащей бисера обеспечение того, чтобы трубка остается на льду во всем.
- Тщательно раздавить кристаллы в subwell (лоток 96-а) или покровного (лоток 24-а) падает, используя стеклянную зонд, подготовленный в разделе 2.1, просмотра результатов под микроскопом. Небольшие кристаллы может занять несколько минут, чтобы полностью подавить. Этот шаг позволяет экспериментатор, чтобы проверить, что кристаллы легко раздавить и поэтому не сшитый, а также, что они не являются кристаллы соли. Кристаллы соли производят характерный щелчок, который можно услышать и чувствовали, когда их будут бить. Если кристаллы жесткие и трудно подавить попытку получить и использовать свежий материал.
- Удалить 5 мкл резервуара раствора из бисера трубки и тransfer до эквивалента к югу от скважины (сидя эксперимент капля), или покровное (висит эксперимент капля), содержащей кристаллический материал, чтобы быть собраны. Пипетки это жидкость вверх и вниз 5-6 раз для ресуспендирования столько содержимого суб-луночных или покровное насколько это возможно. Вернуться подвеску к бисера трубки и повторить этот шаг в два раза больше, гарантируя, что столько, сколько кристаллическое вещество собирали, как это возможно.
- Вихря бисера в течение двух минут, останавливая каждые 30 сек, чтобы охладить пробирку на льду.
- Сделать серийные разведения, разбавляя семенного фонда в резервуара раствора на коэффициент от 4 до 10 на каждом этапе. Как правило, слишком много кристаллы будут получены при использовании в неразбавленном семенной фонд, так что используйте разбавленные запасы семян, чтобы контролировать количество кристаллов на лунку. В первом туре РММС, важно, чтобы не разбавлять семян исходного раствора, так как чем больше концентрация семян тем больше хитов кристаллизации будут получены.
- Если это не так, чтобы быть использованы немедленноленно, передать семенного подвеску и разбавленный семенного фонда к -20 ° С, или -80 ° C морозильник для хранения. Для предотвращения повторных циклов замораживания-оттаивания, которые могут снизить эффективность семенного фонда, хранить этот материал малыми порциями объему, т. е. 10-20 мкл. После того, как замороженные, запасы семян может храниться неограниченно долго, пока это необходимо.
3. Создание кристаллизации лотков
- В зависимости от наличия кристаллизации объектов и предпочтений экспериментатора, РММС скрининг кристаллизации может быть выполнена с использованием либо лотки 24-а, использующие висит метод диффузии пара падение или лотки 96-а, используя сидя метод падение диффузии паров. Кристаллизация лотки для РММС может быть установлена либо вручную, используя жидкость обработки робота дозатор, или сочетание того и другого.
- Типичный РММС эксперимент настроить вручную будет состоять, 1,0 мкл раствора белка, 1,0 мкл состояние кристаллизации, и0,5 мкл семенной фонд. Типичный эксперимент настроить с помощью кристаллизации робота будет состоять, решение 0.3 мкл белка, 0,2 мкл состояние кристаллизации, и 0,1 мкл семенной фонд.
- Для выполнения РММС скрининг в 24-луночные лотки висит падение, во-первых, с помощью ручного пипетки 300 мкл каждого условия с экрана условие кристаллизации 96-луночного в 10 мл формата одна трубка в каждую лунку 4 х 24-луночный pregreased кристаллизации лотки.
- Передача 1 мкл каждого условия кристаллизации из каждого резервуара 300 мкл на поверхность соответствующего пластического покровным из которых обе передние и задние защитную подложку полосы были удалены.
- К 1 мкл каждого условия кристаллизации добавить 1 мкл раствора белка с последующим 0,5 мкл кристаллов семенного фонда. Переверните каждый покровное такой, что падение жидкости обращенные вниз и положение выше соответствующая хорошо.
- Пресс вниз на покровное, сжимая sealiнг смазку и формирования безопасную печать. После того как все 96 капель установлено, лоток должны быть переданы в инкубаторе или постоянной комнатной температуре, обычно в диапазоне 4-18 ° С для хранения.
- Для выполнения РММС скрининг в 96-луночный сидит лотки падение во-первых передавать 20-50 мкл каждого условия с экрана условие кристаллизации 96-луночного глубокого в формате блока а в каждую соответствующую лунку лотка кристаллизации. Этот шаг передачи могут быть выполнены с использованием либо кристаллизации робота, или путем ручного перевода с использованием 8-канальную пипетку.
- Водохранилище перевод, белковые и семенного решения капель вручную или с роботом с помощью объемов, описанные в 3.1. Некоторые имеющиеся в продаже роботы кристаллизации не пишите диспенсирования и исполнительская семенной фонд передачи с использованием такой системы может привести к закупорке дозирования советы, связанные трубки. Порядок выдачи варьируется: некоторые роботы обойтись все решения одновременно. Еслиэто невозможно, обойтись белок, а затем резервуар, то семенного фонда.
- Если контакт дозирования робота не доступна передача семена, используя стекло с низким объем шприца, снабженного тупой иглы. Промыть иглу, пропуская ее через водохранилище раствору затем обойтись семенного фонда в каждой капле.
- Закройте лоток, используя прозрачную уплотнительную лист и передать инкубаторе или постоянной комнатной температуре для хранения.
4. Инспекция кристаллизации лотков
- Представьте все эксперименты кристаллизации, используя либо бинокулярный микроскоп или системы кристалл изображения. Бывший обычно дает пользователю больший контроль над глубиной просмотра и степень увеличения, чем вторые, но занимает больше времени.
- Проверьте каждую sub-well/coverslip в последовательности и записать любое доказательство образования кристаллов. Эксперименты должны проверяться один раз каждые 24 ч в течение 5 дней после установления ин впоследствии раз в 7 дней на срок до 4 недель.
- , Часто необходимы до оптимального качества дифракции кристаллов получают множество циклов РММС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(А) Пример эксперимента РММС
Чтобы продемонстрировать эффективность РММС скрининга мы применили этот метод для кристаллизации куриного яйца лизоцима (HEWL) и печени крупного рогатого скота каталазы (BLC). Оба эти ферменты в высшей кристаллизоваться и структурно охарактеризованы цели 15, 16. Таким образом оба обеспечивают отличные испытуемых, с которыми можно проиллюстрировать повышенную успеха кристаллизации достижимую с РММС. Кристаллизация эксперименты были созданы в 96-а сидя формат падение лоток с использованием жидких робототехнику обработки. Растворы HEWL и BLC были получены путем растворения лиофилизированных порошков друг в 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,5, до конечной концентрации 100 мг / мл и 20 мг / мл соответственно. Для каждого белка были использованы три экрана кристаллизации 96-состояние; JCSG, ПАКТ и Морфеус. Кристаллизация скрининг без microseeding проводили с использованием объемов резервуара 50 мкл, и 2 мклсидя капли, содержащие 1 мкл раствора белка и 1 мкл водохранилища решения. Шесть лотки хранились в постоянной комнатной температуре на 18 ° С и ежедневно проверять с помощью бинокулярного микроскопа. Любые доказательства роста кристаллов был записан. После пяти дней одно условие из каждого лотка, что было установлено, поддерживать рост кристаллического материала был выбран и используется для выработки семенного. РММС скрининг проводили, как для не-РММС скрининга, за исключением того, что использовали 2,5 мкл, сидящие капли, содержащие 1 мкл раствора белка, 1 мкл раствора резервуара и 0,5 мкл посевного материала. Все шесть РММС лотки были переданы постоянной комнатной температуре на 18 ° С и ежедневно проверять с помощью бинокулярного микроскопа. Через пять дней РММС лотки обоих белков были проверены и количество капель с кристаллов был записан. Рисунок 1 суммирует результаты этого эксперимента и обеспечивает количественный анализ. Для HEWL от 4 до 10 разувеличение скорости кристаллизации успеха, по сравнению с не-семенами лотков, наблюдалось, когда РММС был применен к этому белку. Примечательно для BLC только одно условие на экране Morpheus был найден, чтобы получить кристаллы, по сравнению с 55 условий, определенных после использования РММС. Кроме того, было увеличение скорости успеха в BLC кристаллизации с использованием JCSG и экраны PACT соответственно 3 и 7-кратный. Во всех случаях и независимо от экрана кристаллизации используемые РММС скрининг дает значительно большее общее количество кристаллов, чем не РММС скрининга. Повторение одних и тех скрининговых экспериментов РММС описывается с помощью 1:100 разбавленный семя дало значительно меньше хитов, чем при использовании в неразбавленном виде семенной фонд, усиливая требование использовать неразбавленные запасов при выполнении первый раунд РММС экспериментов. Для обоих белков было мало очевидным изменение качества кристаллов, если судить по размерам, морфологии и двулучепреломления. Сравнительная оценка дифкачество доля кристаллов, полученных с помощью РММС в отличие от обычных методов скрининга выходит за рамки данного исследования, однако, первоначальный анализ предварительный дифракции с использованием синхротронного излучения подмножества кристаллов обоих белков, выделенных из РММС и экранов без РММС указано там быть небольшим изменением в качестве дифракционной, если судить на основании предела разрешения и точечного профиля.
(В) Пример оптимизации количества кристаллов на падение
Microseeding методы регулярно подавать ливень мелких кристаллов. Поэтому часто необходимо разбавить семенной фонд, чтобы снизить уровень зарождения. Более того, иногда может быть невозможно вырастить кристаллы в условиях хит, которые были найдены на РММС когда раздаете, не используется 5. Это такие случаи часто полезно использовать «классическую» microseeding, где несколько капель создаются с использованием тех же пластов решение с разных разведений семенного материала. Это сбыть сделано систематически в течение нескольких условий свинца на одной пластине, используя «комбинаторной» подход (Павел Reichert, Merck Research Laboratories, личное общение), как показано на рисунке 2. Здесь один или несколько повреждений растворы (H1 - H6) распределяют в столбцах кристаллизации пластины, в то время как другая разбавление семенного материала (S1 - S9) добавляют к капель каждой строки. Поэтому каждая комбинация решения хит и разбавленной семенного фонда были протестированы на одной пластине, а соответствующий уровень разбавления и любых тенденций, присутствующих могут быть легко идентифицированы.
Мы применили этот комбинаторный подход microseeding в три модели белков, ксиланаза, тауматин и термолизина. Каждый белок был протестирован с условием кристаллизации, которые ранее было показано, не дать ни одного кристаллы в отсутствие посева, но последовательно получают кристаллы при посеве был использован. Условия кристаллизации, используемые для ксиланазы, тауматин и тhermolysin приведены в таблице 2. Были созданы четырех до шести условия для каждого белка либо с двух или трех повторений каждого белка / состояние / семенного комбинации, как показано на рисунке. Капли состоит 0,3 мкл белка, 0,29 мкл раствора резервуара и 10 NL семенной фонд. Все лотки были созданы с использованием жидкой обработки кристаллизации робота. Аккуратные семенной фонд и шесть разведения их были созданы для каждого белка. Другие экспериментальные данные были сообщалось ранее 12. Среднее число кристаллов, полученных за капли заговор против разбавления семенного фонда на рисунке 3. Эти данные показывают, что число кристаллов следует примерно линейную зависимость с количеством добавленных семян. За три испытанных белков, 1:10 -3 до -6 1:10 разведения требуется для получения 1-10 кристаллы на капли.
Таблица 1. Перечень материалов.
| Кристаллизация коктейль | Количество капель, установленных в лоток | |
| Ксиланазы (36 мг / мл) | 2 сульфат аммония М, 0,1 М Трис-HCl рН 8,5 | 3 |
| Ксиланазы (36 мг / мл) | 30% (вес / объем) ПЭГ 4000, 0,2 М ацетат натрия, 0,1 М Трис-HCl рН 8,5 | 3 |
| Ксиланазы (36 мг / мл) | 4 М формиата натрия | 3 |
| Ксиланазы (36 мг / мл) | 3,5 М сульфат аммония, 250 мМ хлорида натрия, фосфат рН 50 мМ натрий / калий 7,5 | 3 |
| Ксиланазы (36 мг / мл) | 1,5 М фосфатного рН калия 7.0 | 3 |
| Thaumatin (30 мг / мл) | 30% (вес / объем) ПЭГ 4000, 0,2 М ацетат аммония, 0,1 М цитрат натрия рН 5,6 | 2 |
| 20% (вес / объем) ПЭГ 4000, 20% (об / об) 2-пропанол, 0,1 М цитрат натрия, рН 5,6 | 2 | |
| Thaumatin (30 мг / мл) | 30 (% вес / объем) ПЭГ 8000, 0,2 М сульфат аммония, 0,1 М натрий какодилат рН 6,5 | 2 |
| Thaumatin (30 мг / мл) | 20 (% вес / объем) ПЭГ 8000, 0,2 М ацетат магния, 0,1 М натрий какодилат рН 6,5 | 2 |
| Thaumatin (30 мг / мл) | 2 сульфат аммония М, 0,1 М Трис-HCl рН 8,5 | 2 |
| Thaumatin (30 мг / мл) | 1,5 М сульфат лития, 100 мМ HEPES, рН 7,5 | 2 |
| Термолизин (15 мг / мл) | 20,0% (вес / объем) ПЭГ 6000, 100 мМ рН 5,0 лимонной кислотой | 3 |
| Термолизин (15 мг / мл) | 1,26 М сульфата аммония, 200 мМ сульфат лития, 100 мМ Трис-HCl рН 8,5 | 3 |
| Термолизин (по 15 мг / мл) | 10% (объем / объем)MPD, 100 мМ бицин рН 9,0 | 3 |
| Термолизин (15 мг / мл) | PH янтарной кислоты 7,0 800 мм | 3 |
Таблица 2. Белковые растворы и условия кристаллизации, используемые в комбинаторной эксперимента microseeding.
Рисунок 1. (А) Сравнение РММС и не-РММС скрининга кристаллизации экспериментов. Условия, поддерживающие рост кристаллов в зеленый, условия не поддерживающие рост кристаллов в серый. Условия выбранные для использования в семенной фонд поколения в розовый цвет. Экраны кристаллизации помечены следующим образом (я) курица яичный белок лизоцим, JCSG, не РММС, (II) курица яичный белок лизоцим, JCSG, РММС, (III) курица яичный белок лизоцим, ПАКТ, не РММС, (IV) курица например г белого лизоцим, ПАКТ, РММС, (V) курица яичный белок лизоцим, Морфеус, не РММС, (VI) курица яичный белок лизоцим, Морфеус, РММС, (VII) бычьего печени каталаза, JCSG, не РММС, (VIII) бычьей печени каталаза, JCSG, РММС, (IX) бычьего печени каталаза, ПАКТ, не РММС, (х) бычьего печени каталаза, ПАКТ, РММС, (XI) бычьего печени каталаза, Морфеус, не РММС, (XII) бычьего печени каталаза, Морфеус, РММС. (В) Сравнительный анализ успеха кристаллизации с использованием РММС и не-РММС скрининг кристаллизации. Для не-РММС скрининга количество условий кристаллизации, определенных в качестве поддержки роста кристаллов либо HEWL или BLC показаны синим цветом, для РММС скрининг количество условий кристаллизации, определенных в качестве поддержки роста кристаллов либо HEWL или BLC показаны красным цветом. Данные основаны на проверки кристаллизации лотков 5 дней после создания.
2.jpg "/>
Рисунок 2. Распределение условий кристаллизации и разбавленных семян фондовых суспензий для одного белка в примере комбинаторной эксперимента microseeding. Выделенные столбцы H1-H6 содержат различные условия кристаллизации, поддерживающие рост целевого белка кристаллов. Выделенные строки S1-S7 содержат различные разведения белка-мишени семенного подвески.
Рисунок 3. Корреляция между семенного разведения и среднего количества кристаллов, полученных за падение в комбинаторной эксперимента microseeding. Три белка были использованы ксиланаза, тауматин и термолизин. Капли были созданы в 96-луночный MRC пластины с использованием жидкой обработки робота, и включают в себя 0,3 мкл белок, 0,29 мкл раствора резервуара и 10 нл свежий себеред запас. Данные, представленные на основе осмотра лотки кристаллизации 5 дней после создания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы описали общий метод РММС белка скрининга кристаллизации. Мы показали, используя два тестовых белков значительно усилены в успешности кристаллизации с помощью этого метода. Анализ дифракции с использованием синхротронного излучения подмножества кристаллов, полученных с помощью РММС и методы, не РММС показал небольшое изменение качества дифракционной между кристаллов, выращенных с использованием либо метода, хотя предыдущие авторы сообщают, что хорошее качество кристаллов, скорее всего, расти в РММС экспериментов 11, 13. HEWL и BLC, возможно, дал атипичные результаты, потому что они необыкновенно легко кристаллизуется. Мы также иллюстрируют важность оптимизации концентрации кристаллических семенного используемых в экспериментах РММС, и показать, как это может быть установлено путем разбавления для того, чтобы оптимальное количество качественных дифракции кристаллов производятся.
РММС является простым, высокая пропускная способность, оченьСпособ масштабируемого которые могут быть использованы в дополнение традиционных методов скрининга. Эксперименты можно настроить вручную или роботом, в 96-колодца или лотки с 24 лунками, и в подвесных или сидя форматы падение. Основным недостатком РММС является то, что зависит от получения той или иной форме кристаллического материала целевого белка (или гомологичного белка) в целях получения семенного материала в первую очередь. Следует отметить, однако, что высококачественный кристаллический материал не требуется, более того, авторы успешно использовали микрокристаллы и аморфный осадок, чтобы сделать семенного материала. Использование РММС скрининга не ограничивается роста кристаллов нативных белков. Например, РММС хорошо подходит для выращивания кристаллов selenomethione или селеноцистеин замещенных вариантов. В таких случаях кристаллы нативного белка может быть использован, чтобы сделать семенного фонда. Хотя протоколы альтернативой зарождения кристаллов были зарегистрированы 1,4, ни одна из них применительно к более широкой арАнж белков как РММС.
После РММС комбинаторный подход microseeding может быть использован для оптимизации уровня посева с целью получения кристаллов для сбора данных. Это особенно полезно для лиганд-купания экспериментах, где большое количество кристаллов часто необходимых. Используя этот подход весь экран кристаллизации может быть быстро создана при помощи microseeding в сочетании с разбавленным семенного материала, с каждой лунке что дает относительно небольшое количество кристаллов.
В заключение мы призываем никого занимается макромолекул кристаллизации сделать РММС частью их обычной процесса во всех случаях, когда дифрагирующие кристаллы не полученных непосредственно от их начальных экранов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась частично BBSRC (BB/1006478/1). ПРР является получателем исследовательский грант Королевское общество университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
