Summary
כאן אנו מתארים שיטה כללית להקרנת מטריצת microseed אקראית. טכניקה זו מוצגת להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של ניסויי הקרנת התגבשות חלבון, להפחית את הצורך באופטימיזציה, ולספק אספקה אמינה של גבישים לאיסוף נתונים וניסויים יגנד שרייה.
Abstract
הקרנה אקראית מטריצת microseed (rMMS) היא טכניקת התגבשות חלבון שבו גבישי זרע מתווספים למסכים אקראיים. על ידי הגדלת הסבירות כי גבישים יגדלו באזור metastable של דיאגראמת הפאזות של חלבון, מוביל התגבשות נוסף לעתים קרובות מתקבל, את האיכות של גבישים המיוצרים עשויה להיות מוגברת, ואספקה טובה של גבישים לניסויי איסוף נתונים ושרייה מסופקת. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS שניתן להחיל גם ניסויים יושבים טיפה או תליית אדי ירידת דיפוזיה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב96 היטב או בתבנית מגש 24 גם.
Introduction
מהיישום לראשונה שלה על ידי פרוץ, Kendrew ועמיתים לעבודה בקביעת המבנים של המוגלובין ומיוגלובין, לצינורות אוטומטיים המודרניים תפוקה גבוהה של קונסורציומים גנומיקה המבניים, קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן macromolecular העניקה לנו הצצה מבנית חסרת תקדים אל עולם החלבון . טכניקה זו עדיין השיטה הניסיונית ביותר ישימה נרחב המאפשרת הדמיה הישירה של מבנה חלבון באטומי, או בסמוך לרזולוציה אטומית (כלומר בטווח Å 1-3). תנאי מוקדם לרנטגן עקיפה שיחול על חלבון הוא שזה חייב להיות ראשון התגבש, וזה בשלב זה של התהליך שנשאר צעד אחד הגדול שער הגבלה בקביעת מבנה בשיטות עקיפה 1, 2. למרות התקדמות משמעותית בהבנתנו את התהליך של התגבשות חלבון, ושיפורים משמעותיים באיכות והזמינות של מסכים התגבשות,מגשים, וטכנולוגיות קשורות, הוא נשאר בלתי אפשרי לחזות את הסבירות של התגבשות הצלחה 3 באופן מהימן. ניתן ליישם שיטות ביוכימיות וbiophysical להעריך אם חלבון של מציג עניין מאפיינים נוחים להתגרענות גביש וצמיחה, כלומר הוא זה מקופל היטב, הומוגנית, monodisperse, וכו ', לעומת זאת, תובנות אלו בשום אופן לא מספקות מנבא סופי של גיבוש נטייה.
זריעה כבר התיימרה ארוכה להיות שיטה מעשית לשיפור במספר, הגודל והאיכות של גבישים קיימים או חומר גבישי 4-7. גישה זו מבוססת על ההנחה שתנאים שתומכים בהתגרענות גביש לא יכולים להיות אופטימליים לגידול גבישים שלאחר מכן ולהיפך. על ידי העברת חומר גרעיני ממצב אחד למשנו, אפשר לנסות לנתק ביעילות תהליכים אלה, גישה ובכך נותנת למרחב חדש, שעדיין לא נחקר התגבשות,וכתוצאה מכך להגדיל את שיעור ההצלחה הכולל של ניסוי הקרנה. שיטות הוקמו תועדו לmacroseeding (i), ההעברה של גביש יחיד בשלמותו ממצב אחד לעוד 8, (ii) זריעת פס, העברת חומר גרעיני, בדרך כלל מתקבל על ידי הפעלת לחץ כיוונית באמצעות למשל השפם של חתול אל פני השטח של גביש קיים, ואחרי המעבר הבא של הזיף דרך טיפה חדשה התגבשות 9, וכן (iii) microseeding "קלאסי", ההעברה של "זרעים" קריסטל, שנוצרו על ידי קצירה כתוש גבישים (או גבישים חומר), לתנאים דומים לאלה שהניבו את הזרעים 10. יש לציין את כל שלושת שיטות אלה הם זמן רב וגרוע להרחבה, בוודאי בהשוואה למה שהוא בר השגה עם רובוטיקה התגבשות טיפול הנוזל המודרנית. גורמים אלה תרמו, ברמה מסוימת לפחות, לתפיסה שזרעing הוא שיטה לביקורים רק כאשר גישות אחרות נכשלו לשאת פרי.
microseeding מטריצה אקראית (rMMS) הוא חידוש המתודולוגי האחרון המשלב את היתרונות של microseeding המסורתי עם אלו של הקרנת תפוקה גבוהה ויכולת רחבה 11-13. גישה זו מסתמכת על הדור של מניית זרע, המיוצר מחומר גבישים גרעיני, אשר עשוי להיות aliquoted ל/ על כל sub-well/coverslip בתוך מסך התגבשות 96 מצב סטנדרטי. שיטה זו ישימה גם בישיבה או בתליית ניסויי דיפוזיה אדי טיפה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב24 גם או בפורמט מגש 96 היטב. rMMS הודגם בניסוי כדי להגדיל באופן משמעותי את שיעור הצלחה של התגבשות, ולייצר גבישים באיכות עקיפה גדולה יותר וכמות 11, 13, 14, ומייצג כלי חדשני בארסנל "crystallographers של גישות בoNgoing מאמץ לקראת הצלחה התגבשות. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS ולספק נתונים לדוגמה הממחישים את היעילות של טכניקה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיקולים אסטרטגיים
- הבחירה של זרע גבישים המשמשת לניסויי microseeding תשתנה בהתאם למטרת הניסוי. בתחילת פרויקט כדאי למצוא כמה להיטי התגבשות שיכולה לספק נקודות התחלה חלופיות לגביש אופטימיזציה. rMMS מקטין באופן משמעותי את הצורך באופטימיזציה של גביש כי גבישים באיכות טובה יש סיכוי גבוה יותר לגדול באזור metastable של דיאגרמת פאזות, כלומר באזור שבו בעקבות הפרעה או התגרענות המערכת חוזרת לשיווי משקל. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש באופן שגרתי rMMS בהקדם הגבישים הראשונים מתקבלים (או יותר נכון, ברגע שהגבישים הראשונים להפסיק לגדול).
- לסיבוב של rMMS הראשוני, מניית זרע צריכה להיעשות עם כמה שיותר חומר גבישים ככל האפשר. אם רק אחד גם הוא זמין המכיל גבישים, או אם הגבישים קטנים, זה עשוי להיות מועיל כדי להגדיר את החזרות מרובות שללהיט מקורי (ללא זריעה) כדי להגדיל את ההיצע של גבישים. אם, לעומת זאת, כמה להיטים שונים מתקבלים, ניתן לקצור גבישי זרע מכמה תנאים ומעורבבים יחד.
- כדי להימנע מהפרדת פאזות, קריסטלים גדלו בתנאים עתיר מלח צריכים להיות שנקטפו בנפרד מגבישים גדלו בתנאים גבוה PEG. אם גבישים מכמה בארות מעורבבים, פתרון מאגר זה הוא פחות סביר לתת גבישי מלח יש לבחור עבור השעיה זרע. לדוגמא, יש להימנע מריכוזים גבוהים של פוספט, חומצה גופרתית, סידן ומגנזיום.
- מאוחר יותר בפרויקט זה עשוי להיות חשוב לחפש גבישים עם תאי יחידה אחרים על מנת לשפר את העקיפה, להימנע מגבישי תאומים, ולקבל גבישים המתאימים למחייב ligands. בשלב זה יש להשתמש רק הגבישים המתאימים ביותר (למשל אלה שdiffract הטוב ביותר) על מנת להפוך את מניית הזרע. סבבים חוזרים ונשנים של microseeding לפעמים נדרשים, שבו רק את "הטוב ביותר"גבישים משמשים כדי להפוך את הזרעים לסיבוב הבא. במידת האפשר," צריך להיות בשימוש נמהר ניטראלי "כמו PEG 3000 להשעות את גבישי הזרע בלעודד אנשי קשר רומן גביש ולהתגבש מתחמים שעשויות להיות בלתי יציב בהיי מלח פתרונות 12.
- ניסויים קלאסיים microseeding, שבו מצב התגבשות יחיד משמש, לעתים קרובות הבאים מועילים זיהוי של מצב מבטיח ובמהלך אופטימיזציה שלאחר מכן. זה לעתים קרובות יש צורך לדלל את מניות הזרע על מנת לקבל את המספר הרצוי של גבישים לכל טיפה. ניסוי "קומבינטורית" microseeding (שבו סדרה של מניות זרע של דילול הגדלת מתווספות למצב התגבשות) הוא שיטה מהירה למציאת הדילול האופטימלי של מניית הזרע. גישה זו מתוארת בהמשך.
2. הכנת מאגר הזרעים
- הפוך בדיקה זכוכית מעוגלת מהזכוכית פיפטה פסטר באמצעות להבה בונזן.
- מחממים את פיפטה קרובה לאמצע עד שהוא הופך להיות רך, ולאחר מכן להסיר במהירות אותו מהאש ולהוציא אותו על ידי משיכת לגזרים את הקצוות. מטרה למשוך את הכוס בקוטר מתחת 0.25 מ"מ.
- לשבור את הזכוכית בנקודה שבה היא סביב 0.25 מ"מ ובקצרה לצלול הסוף נשבר ללהבה. חזור על פעולה זו עד לחצי כדור זכוכית בקוטר של ~ 0.75 מ"מ נוצר בסופו של הדבר. בדיקה זו שימושית לריסוק חומר גבישים כפי שהוא בגודל מתאים עבור בולט עצמים מוצקים בסולם 0.01-1.0 מ"מ והוא אינו פוגע במשטח הפלסטיק של משנה גם מגש התגבשות או coverslip. בדיקות גדולות יותר (~ 1.0 מ"מ) עלולות למחוץ גבישים קטנים בצורה יעילה יותר, כי הגבישים לכודים בין הזכוכית והפלסטיק.
- הנח צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל זרעים חרוזים על קרח.
- בדוק מגש גיבוש שנקבע מראש באמצעות מערכת הדמיה גביש מיקרוסקופ או משקפת ובחר ap אחד או יותרpropriate בארות מהמגש שממנו למסוק חומר גבישים עבור דור מניית הזרע. ניתן להשתמש בכל חומר, כולל מחטים דקות, spherulites, microcrystals וגבישים בלתי סדירים, שהוקמו בצורה גרועה. מניית הזרע צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר הגבישים להפסיק לגדול, כחומר ישן יותר הוא סיכוי גבוה יותר להיות בחלק צולבים, ובכך להקטין את התאמתה לשימוש בניסויי זריעה. אם כל ספק קיים, האם חומר גבישים להיות שנקטפו הוא מלח או חלבון גם ניתן דמיינו באמצעות מערכת ההדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי UV או לפני הפתיחה, או חומר גבישים עשוי להיות נתון באתר ניתוח עקיפה X-ray במגש. בעת השימוש בגבישי חלבון גישה לשעבר לזרוח תחת קרינת UV, גבישי מלח יופיעו חסרי צבע.
- פתח את מגש ההתגבשות שנבחר היטב. ל96 היטב יושבים מגשי טיפה לחתוך את גיליון איטום הפלסטיק העליון סביב נבחר גם USIng להב סכין מנתחים. למגשי טיפה תלויה 24 גם להסיר את coverslip באמצעות פינצטה. הפוך את coverslip ולמקם אותו על משטח נקי ויציב. הסר 50 μl של פתרון המאגר ולהעביר את הנוזל לצינור microcentrifuge המכיל את הזרע ביד כדי להבטיח שהצינור נשאר על קרח לאורך כל הדרך.
- יסודיות לרסק את הגבישים בsubwell (מגש 96 היטב) או coverslip (מגש 24 גם) טיפות, באמצעות הבדיקה הזכוכית שהוכנה בסעיף 2.1, הצגת התוצאות תחת מיקרוסקופ. גבישים קטנים עשויים להימשך מספר דקות לרסק ביסודיות. שלב זה מאפשר למנהל הניסוי כדי לבדוק שהגבישים קלים לרסק ולכן אינו צולבים, וגם כי הם לא גבישי מלח. גבישי מלח לייצר לחצו ייחודי שניתן יהיה לשמוע והרגישו כשהם מרוסקים. אם הגבישים קשים וקשים למחוץ לנסות להשיג ולהשתמש בחומר טרי.
- הסר 5 μl של פתרון המאגר מהצינור ביד הזרע ולאransfer למשנה גם שווה הערך (יושב ניסוי טיפה), או coverslip (תלוי ניסוי טיפה) המכיל את חומר גבישים להיות שנקטפו. פיפטה נוזלית את זה ולמטה 5-6 פעמים כדי resuspend כמה שיותר את תוכן משנה טוב או coverslip ככל האפשר. להחזיר את ההשעיה לצינור ביד הזרע ולחזור על פעולה זו פעמיים נוספות, על מנת להבטיח שחומר גבישים כמה שהוא שנקטפו ככל האפשר.
- מערבולת ביד הזרעים לשתי דקות, עוצרת כל 30 שניות כדי לקרר את הצינור על קרח.
- לעשות סדרת דילול, דילול מניות הזרע בפתרון מאגר בפקטור של 4 עד 10 בכל שלב. בדרך כלל, יתקבלו גבישים רבים מדי בעת השימוש במניית זרע חי, כדי להשתמש במניות הזרע המדולל לשלוט במספר של גבישים לכל טוב. בסיבוב הראשון של rMMS, חשוב שלא לדלל את פתרון מניות הזרע, שכן ככל שהריכוז של זרעים יתקבלו יותר להיטי התגבשות.
- אם זה לא כדי לשמש היא מידately, להעביר את ההשעיה מניית הזרע וזרע המניה מדוללת ל-20 ° C, או -80 ° C במקפיא לאחסון. כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים, אשר עשוי להפחית את היעילות של מניית הזרע, לאחסן את החומר הזה בaliquots נפח הקטנים, כלומר 10-20 μl. ברגע קפוא, מניות זרעים נשמרות ללא הגבלת זמן עד הצורך.
3. הקמתה של התגבשות מגשים
- בהתאם לזמינות של מתקני התגבשות וההעדפות של הנסיין, הקרנת התגבשות rMMS יכולה להתבצע באמצעות שני מגשים 24 גם המעסיקים בשיטת דיפוזיה אדי טיפה התלויה, או מגשים 96, גם תוך שימוש בשיטת דיפוזיה אדי הטיפה יושבת. מגשי התגבשות לrMMS ניתן להקים גם ביד, תוך שימוש בנוזל טיפול מתקן רובוטית, או שילוב של שתיים.
- ניסוי rMMS טיפוסי שהוקם על ידי יד יהווה, 1.0 פתרון חלבון μl, מצב התגבשות 1.0 μl, ו0.5 מניית זרע μl. ניסוי טיפוסי להגדיר באמצעות רובוט התגבשות יכלול, פתרון חלבון 0.3 μl, מצב התגבשות 0.2 μl, ו0.1 מניית זרע μl.
- כדי לבצע סינון rMMS ב24 גם תלוי מגשי טיפה, ראשית, באמצעות פיפטה ידנית, להעביר 300 μl של כל מצב ממסך התגבשות מצב 96 היטב ב10 מיליליטר פורמט צינור אחד לתוך באר כל 4 x 24 גם התגבשות pregreased מגשים.
- μl העברת 1 של כל תנאי התגבשות ממאגר μl 300 על פני השטח של coverslip פלסטיק המתאים שממנו שני רצועות גיבוי מגן הקדמיות ואחוריות הוסרו.
- כדי μl 1 של כל תנאי התגבשות להוסיף 1 μl של פתרון חלבון ואחריו 0.5 μl של מניית זרע גביש. הפוך כל coverslip כך שהירידה של נוזל כלפי מטה מול והעמדה מעל למתאים היטב.
- לחץ כלפי מטה על coverslip, דחיסת sealing שומן ויוצר שכבה אטומה והמאובטח. ברגע שכל 96 הטיפות מבוססות, המגש צריך להיות מועבר לאינקובטור או בחדר טמפרטורה קבוע, בדרך כלל במעלות צלזיוס הטווח 4-18 לאחסון.
- כדי לבצע סינון rMMS ב96 היטב יושב מגשי טיפה ראשית להעביר 20-50 μl של כל מצב ממסך התגבשות מצב 96, גם בפורמט לחסום גם עמוק לתוך כל מקביל גם של מגש ההתגבשות. צעד העברה זו יכול להתבצע או באמצעות רובוט התגבשות, או על ידי העברה ידנית באמצעות פיפטה 8 ערוצים.
- פתרונות מניות העברת מאגר, חלבון וסיד לטיפין ביד או עם רובוט באמצעות הכרכים מפורטים ב3.1. כמה רובוטים התגבשות זמינים מסחרי לא לפנות לוותר, והעברת מניות זרע ביצועים באמצעות מערכת כזו עלולה לגרום לחסימה של מחלק טיפים או צינורות קשורים. סדר מחלק משתנה: כמה רובוטים לוותר כל הפתרונות בו זמנית. אםזה לא אפשרי, תחילה לוותר על חלבון, ולאחר מכן מאגר, ואז זרע מניות.
- אם איש קשר מחלק רובוט הוא לא העברה זמינה באמצעות הזרעים מצוידים במחט בוטה מזרק זכוכית בנפח נמוך. יש לשטוף את המחט על ידי העברתו דרך פתרון המאגר אז לוותר מניית הזרע לכל טיפה.
- לאטום את המגש באמצעות גיליון איטום שקוף ולהעביר לאינקובטור או בטמפרטורת חדר הקבוע לאחסון.
4. בדיקה של התגבשות מגשים
- דמיינו את כל ניסויי ההתגבשות או באמצעות מערכת הדמיה גביש מיקרוסקופ או משקפת. לשעבר בדרך כלל מעניק למשתמש שליטה רבה יותר על עומק נוף ואת מידת הגדלה מאשר האחרון, אך הוא זמן רב יותר.
- בדוק כל sub-well/coverslip ברצף ולהקליט כל ראיה של היווצרות גבישים. יש לבדוק ניסויים אחת לשעה 24 במשך 5 ימים לאחר ההקמה וn לאחר מכן פעם ב 7 ימים לתקופה של עד 4 שבועות.
- מחזורים רבים של rMMS נדרשים לעתים קרובות לפני גבישים באיכות עקיפה אופטימלית מיוצרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(א) דוגמא לניסוי rMMS
כדי להדגים את האפקטיביות של הקרנת rMMS אנחנו מוחלים בשיטה זו כדי ההתגבשות של ליזוזים ביצת תרנגולת הלבן (HEWL) וכבד שור קטלאז (BLC). שני אנזימים אלה הם crystallizable בהחלט ומבניים מאופיינים היטב מטרות 15, 16. ככזה גם לספק נבדקי מבחן מצוינים כדי להמחיש את שיעור הצלחה התגבשות המשופר השגה עם rMMS. ניסויי התגבשות הוקמו ב96 היטב יושב בפורמט מגש טיפה באמצעות רובוטיקה טיפול נוזלית. פתרונות של HEWL וBLC הופקו על ידי המסת אבקות lyophilized של כל אחד ב20 מ"מ טריס-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, לריכוזים סופיים של 100 מ"ג / מיליליטר ו20 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. לכל חלבון שלושה מסכים התגבשות 96 תנאי שימש; JCSG, PACT ומורפיוס. הקרנת התגבשות ללא microseeding בוצעה באמצעות כרכי מאגר של 50 μl, ו2 μlיושב טיפות הכוללות 1 μl של פתרון חלבון ו1 μl של פתרון מאגר. שישה המגשים היו מאוחסנים בחדר טמפרטורה קבוע על 18 מעלות צלזיוס ונבדקים מדי יום באמצעות מיקרוסקופ משקפת. כל ראיה של גידול גבישים נרשמה. אחרי חמישה ימים במצב אחד מכל מגש שנמצא כדי לתמוך בצמיחה של חומר גבישים נבחר ומשמש לייצור מניות זרע. הקרנת rMMS בוצעה כפי שלהקרנה שאינו rMMS, למעט ש2.5 μl יושב טיפות הכוללות 1 μl של פתרון חלבון, 1 μl של פתרון מאגר ו0.5 μl של מניית הזרע היו בשימוש. כל ששת מגשי rMMS הועברו לחדר טמפרטורה קבוע על 18 מעלות צלזיוס ונבדקים מדי יום באמצעות מיקרוסקופ משקפת. אחרי חמישה ימים מגשי rMMS של שני החלבונים נבדקו ומספר הטיפות עם גבישים נרשם. איור 1 מסכם את התוצאות מניסוי זה ומספק ניתוח כמוני. לHEWL 4-10 פילהגדיל בשיעור הצלחה של התגבשות, בהשוואה למגשים שאינם זרע, נצפה כאשר rMMS היה מוחלת על חלבון זה. יש לציין לBLC מצב אחד בלבד במסך מורפיוס נמצא להניב גבישים לעומת 55 תנאים שזוהו בעקבות השימוש בrMMS. יתר על כן, חלה עלייה של 3 ופי 7 בשיעור בהתגבשות BLC ההצלחה באמצעות JCSG ומסכי PACT בהתאמה. בכל המקרים, וללא קשר למסך התגבשות הקרנת rMMS משמש הניבה בסך הכל מספר גדול משמעותי של גבישים מהקרנה שאינה rMMS. חזרה על ניסויי הקרנת rMMS תאר באמצעות זרע מדולל 1:100 הניב באופן משמעותי פחות להיטים מאשר כאשר מניית הזרע חי הייתה בשימוש, מה שחזק את הדרישה לשימוש במניות חי בעת ביצוע הסיבוב של ניסויי rMMS הראשוני. עבור שני החלבונים לא הייתה וריאציה לכאורה קטנה באיכות גביש, נשפט על ידי גודל, מורפולוגיה, ושבירה כפולה. הערכה השוואתית של difאיכות שבריר של הגבישים שנוצרו באמצעות rMMS בניגוד לשיטות הקרנה מקובלות הולכת מעבר להיקפו של מחקר זה, לעומת זאת, ניתוח עקיפה ראשוני ראשוני באמצעות קרינת סינכרוטרון של קבוצת משנה של גבישים של שני החלבונים מבודדים מrMMS והמסכים שאינם rMMS ציין שם כדי יהיה וריאציה מעט באיכות עקיפה, כמו להישפט על סמך מגבלת רזולוציה ופרופיל מקום.
(ב) דוגמא של אופטימיזציה של מספר גבישים לכל טיפה
טכניקות Microseeding לתת באופן קבוע מקלחות של גבישים קטנים. לכן לעתים קרובות יש צורך לדלל את מניות הזרע כדי להפחית את הרמה של התגרענות. יתר על כן, זה עשוי לעתים להיות בלתי אפשרי לגדל גבישים בלהיט תנאים שנמצאו על ידי rMMS כאשר זריעה אינה משמשת 5. זה מקרים כאלה הוא לעתים קרובות מועיל כדי להשתמש microseeding "קלאסי", שבו כמה טיפות מוגדרות באמצעות אותו פתרון המאגר עם דילולים שונים של מניות זרע. ג זהלהיעשות באופן שיטתי במשך כמה תנאי הובלה על צלחת אחת באמצעות גישה "קומבינטורית" (פול רייכרט, מעבדות מחקר של מרק, תקשורת אישית), כפי שמוצג באיור 2. הנה פתרונות אחד או יותר להיט (H1 - H6) הם ויתרו לעמודות של צלחת התגבשות, תוך דילול של מניית זרעים שונה (S1 - S9) הוא הוסיף הטיפות של כל שורה. לכן כל שילוב של פתרון פגע ומניית זרע מדוללת נבדקים על צלחת אחת, ואת הרמה המתאימה של דילול וכל מגמות הנוכחיות יכולה בקלות להיות מזוהה.
יישמנו גישת microseeding קומבינטורית זה לשלושה חלבוני דגם, xylanase, thaumatin וthermolysin. כל חלבון נבדק עם מצב התגבשות שבעבר הוכח לתת שום גבישים בהעדר הזריעה, אבל נתן באופן עקבי גבישים כאשר זריעה הייתה בשימוש. תנאי ההתגבשות משמשים לxylanase, thaumatin ולאhermolysin מפורט בטבלה 2. ארבעה עד שישה תנאים הוקמו עבור כל חלבון עם או שתיים או שלוש חזרות של כל צירוף מניית חלבון / מצב / זרע כפי שמוצג. טיפות מורכבות 0.3 חלבון μl, 0.29 פתרון מאגר μl, ו10 מניית זרע NL. כל המגשים הוקמו באמצעות רובוט התגבשות טיפול נוזלי. מניית זרע מסודרת ושישה דילוליהן הוקמו עבור כל חלבון. פרטים ניסיוניים אחרים כבר דיווחו בעבר 12. המספר הממוצע של גבישים המתקבלים לכל טיפה זממו נגד הדילול של מניית הזרע באיור 3. נתונים אלו מראים כי מספר הגבישים כדלקמן יחסים בערך ליניארי עם מספר הזרעים הוסיפו. לשלושת החלבונים שנבדקו, 01:10 -3 ל1:10 -6 דילולים נדרשו להשיג 1-10 גבישים לכל טיפה.
טבלת 1. רשימה של חומרים.
| קוקטייל התגבשות | מספר הטיפות שהוקמו לכל מגש | |
| Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | 2 סולפט M אמוניום, 0.1 M טריס-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | 30% (w / v) PEG 4000, 0.2 נתרן אצטט M, 0.1 M טריס-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | formate נתרן 4 M | 3 |
| Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | 3.5 M אמוניום סולפט, נתרן כלורי 250 מ"מ, pH נתרן פוספט 50 מ"מ / אשלגן 7.5 | 3 |
| Xylanase (36 מ"ג / מיליליטר) | pH אשלגן זרחה 1.5 M 7.0 | 3 |
| Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 30% (w / v) PEG 4000, 0.2 M אמוניום אצטט, pH 0.1 ציטראט M נתרן 5.6 | 2 |
| 20% (w / v) PEG 4000, 20% (V / V) 2-propanol, 0.1 M-pH ציטרט הנתרן 5.6 | 2 | |
| Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 30 (w% / V) PEG 8000, 0.2 M אמוניום סולפט, 0.1 pH cacodylate M נתרן 6.5 | 2 |
| Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 20 (w% / V) PEG 8000, 0.2 אצטט M מגנזיום, 0.1 pH cacodylate M נתרן 6.5 | 2 |
| Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | 2 סולפט M אמוניום, 0.1 M טריס-HCl pH 8.5 | 2 |
| Thaumatin (30 מ"ג / מיליליטר) | גופרתי ליתיום 1.5 M, 100 HEPES מ"מ pH 7.5 | 2 |
| Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 20.0% (w / v) PEG 6000, pH חומצת לימון 100 מ"מ 5.0 | 3 |
| Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 1.26 M אמוניום סולפט, 200 גופרתי ליתיום מ"מ, 100 מ"מ טריס-HCl pH 8.5 | 3 |
| Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 10% (v / v)MPD, pH bicine 100 מ"מ 9.0 | 3 |
| Thermolysin (15 מ"ג / מיליליטר) | 800 מ"מ pH החומצה succinic 7.0 | 3 |
טבלה 2. פתרונות חלבון ותנאי התגבשות השתמשו בניסוי microseeding קומבינטורית.
איור 1. (א) השוואה בין rMMS והניסויים הקרנת התגבשות שאינה rMMS. תנאי תמיכה בצמיחת גביש נמצאים בירוקים, תנאים לא תמיכה בצמיחת גביש הם בצבע אפור. תנאים שנבחרו לשימוש בדור מניית זרע הם בצבע ורוד. מסכי התגבשות מסומנים כדלקמן ליזוזים הלבן, JCSG, שאינו rMMS, (ii) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, JCSG, rMMS, (iii) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, PACT, שאינו rMMS, (iv) תרנגולת ביצה (i) תרנגולת לדוגמא: ליזוזים הלבן גרם, PACT, rMMS, (v) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, מורפיוס, שאינו rMMS, (vi) ליזוזים הלבן ביצת תרנגולת, מורפיוס, rMMS, (ז) בכבד בקר קטלאז, JCSG, שאינו rMMS, (ח) כבד בקר קטלאז, JCSG, rMMS, (ט) קטלאז, PACT, שאינו rMMS, קטלאז, PACT, rMMS, קטלאז, מורפיוס, שאינו rMMS, כבד כבד שור (x) כבד שור (xi) כבד בקר (יב) שור קטלאז, מורפיוס, ניתוח השוואתי rMMS. (ב) לשיעור הצלחה התגבשות באמצעות rMMS והקרנת התגבשות שאינה rMMS. עבור מים שאינם rMMS הקרנת מספר תנאי התגבשות זוהו כתמיכה בצמיחת גביש של או HEWL או BLC מוצגים בכחול, לrMMS הקרנת מספר תנאי התגבשות זוהו כתמיכה בצמיחת גביש של או HEWL או BLC מוצג באדום. הנתונים מבוססים על בדיקה של מגשי התגבשות הודעה 5 ימי הקמתה.
"/> 2.jpg
איור 2. הפצה של תנאי התגבשות והשעיות מניית הזרע מדוללת לחלבון יחיד בניסוי microseeding קומבינטורית ירושלים. עמודות מודגשות H1-H6 מכילות תנאי התגבשות שונים תמיכה בצמיחת גביש חלבון המטרה. שורות מודגשות S1-S7 מכילות דילולים שונים של השעיה מניית זרע חלבון המטרה.
איור 3. מתאם בין דילול מניות הזרע ומספר ממוצע של גבישים המתקבלים לכל טיפה בניסוי microseeding קומבינטורית. שלושה חלבונים המשמשים היו xylanase, thaumatin וthermolysin. טיפות הוקמו בצלחת 96 היטב MRC באמצעות רובוט טיפול נוזלי, ומהוות 0.3 חלבון μl, 0.29 פתרון מאגר μl, ו10 NL של se הטריed מניות. הנתונים שהוצגו מבוססים על בדיקה של מגשי התגבשות הודעה 5 ימי הקמתה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה שתארנו שיטה כללית להקרנת התגבשות חלבון rMMS. אנחנו הוכיחו באמצעות שני חלבוני מבחן שיפור משמעותי בשיעור הצלחה גיבוש בשיטה זו. ניתוח עקיפה באמצעות קרינת סינכרוטרון של קבוצת משנה של גבישים שנוצרו באמצעות rMMS ושיטות שאינם rMMS חשף וריאציה מעט באיכות עקיפה בין הגבישים גדלו בשני שיטות, אם כי מחברים קודמים דיווחו כי גבישים באיכות טובה יש סיכוי גבוה יותר לגדול בניסויי rMMS 11, 13. HEWL וBLC אולי נתנו תוצאות לא טיפוסיות משום שהם קלים בצורה יוצאת דופן כדי להתגבש. אנחנו גם להמחיש את החשיבות של אופטימיזציה של הריכוז של מניות זרע גביש המשמשות בניסויי rMMS, ולהדגים כיצד זה יכול להיות מותאם על ידי דילול כדי להבטיח שמספר אופטימלי של גבישים באיכות עקיפה מיוצר.
rMMS היא תפוקה גבוהה פשוט,, מאודשיטה ניתנת להרחבה, שניתן להשתמש כדי להשלים את שיטות הקרנה מסורתיות. ניתן להגדיר ניסויים על ידי יד או על ידי רובוט, ב96 היטב או מגשי 24 גם, ולתלות או יושבים פורמטי ירידה. המגבלה העיקרית של rMMS היא שהוא מסתמכים על קבלת צורה כלשהי של חומר גבישים של חלבון מטרה (או של חלבון הומולוגי) על מנת ליצור את זרעים בערכאה הראשונה. יצוין, עם זאת, כי חומר גבישים באיכות גבוהה אין צורך, ואכן המחברים השתמשו בהצלחה microcrystals ומשקע אמורפי לעשות מניות זרע. השימוש בהקרנת rMMS אינו מוגבל לצמיחה של גבישים של חלבונים טבעיים. לדוגמא, rMMS מתאים גם לגבישים גדלים של גרסאות להחליף selenomethione או selenocysteine. במקרים כאלה, גבישים של החלבון האם ניתן להשתמש בם כדי להפוך את מניית הזרע. למרות שפרוטוקולי נוקלאציה גביש חלופי תועדו 1,4, אף חלים גם לar הרחב כמוAnge של חלבונים כrMMS.
לאחר rMMS גישת microseeding קומבינטורית ניתן להשתמש כדי לייעל את הרמה של זריעה כדי לייצר גבישים לאיסוף נתונים. התכונה זו שימושית במיוחד עבור ניסויי יגנד השרייה בו מספר גדול של גבישים לעתים קרובות נדרשים. שימוש בגישה זו מסך התגבשות כל ניתן להקים במהירות באמצעות microseeding בשילוב עם מניות זרע בדילול מלא, עם כל מניבים מספר קטן יחסית של גבישים כן.
לסיכום אנו מעודדים את כל מי שעוסקים בהתגבשות macromolecular לעשות rMMS חלק מהעבודה השגרתית שלהם בכל המקרים בהם גבישי diffracting אינם מתקבלים ישירות מהמסכים הראשוניים שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה בחלקו על ידי BBSRC (BB/1006478/1). PRR הוא הנמען של אוניברסיטת חברה מלכותית מלגת מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
