Summary
Her beskriver vi en generel metode til tilfældig microseed matrix screening. Denne teknik er vist signifikant at øge succesraten af protein krystallisering screening eksperimenter, reducere behovet for optimering, og giver en pålidelig forsyning af krystaller til dataindsamling og ligand-iblødsætning eksperimenter.
Abstract
Tilfældig microseed matrix screening (RMMS) er et protein krystallisering teknik, hvor podekrystallerne føjes til tilfældige skærme. Ved at øge sandsynligheden for, at krystallerne vil vokse i den metastabile zone af et protein fase diagram, er ekstra krystallisering fører ofte opnået, kvaliteten af krystaller producerede kan øges, og et godt udbud af krystaller til indsamling og udblødning af data eksperimenter er forudsat. Her beskriver vi en generel metode til risikohåndteringsforanstaltninger, der kan anvendes til enten sidder dråbe eller hængende dråbe dampdiffusion eksperimenter, der er etableret enten i hånden eller ved hjælp af flydende håndtering robotteknologi, i 96-brønd eller 24-brønds bakke format.
Introduction
Fra sin oprindelige ansøgning fra Perutz, Kendrew og medarbejdere i at bestemme strukturer hæmoglobin og myoglobin, til de moderne high throughput automatiserede rørledninger i den strukturelle genomforskning konsortier har makromolekylære røntgenkrystallografi gav os en hidtil uset strukturel indblik i proteinet verden . Denne teknik er stadig den mest udbredte anvendelse eksperimentel metode, der tillader den direkte visualisering af protein struktur på det atomare, eller i nærheden af atomar opløsning (dvs. i 1-3 et interval). En forudsætning for røntgendiffraktion, der skal anvendes til et protein er, at det først skal krystalliseres, og det er denne fase af processen, der forbliver den største hastighedsbegrænsende trin i strukturen bestemmelse ved diffraktionsmetoder 1, 2. Trods betydelige fremskridt i vores forståelse af processen af protein krystallisering, og store forbedringer i kvaliteten og tilgængeligheden af krystallisering skærme,bakker og relaterede teknologier, er det stadig umuligt at pålideligt forudsige sandsynligheden for krystallisering succes 3.. Biokemiske og biofysiske metoder kan anvendes til at vurdere, om et protein af interesse displays gunstige egenskaber for krystal nukleær og vækst, dvs er det godt foldet, homogent, monodisperse, etc., men disse indsigter på ingen måde give en endelig prædiktor for krystallisering tilbøjelighed.
Seedning har længe været foregav at være en levedygtig metode til at forbedre det antal, størrelse og kvaliteten af de eksisterende krystaller eller krystallinsk materiale 4-7. Denne tilgang er baseret på den forudsætning, at en betingelse, der understøtter krystal nukleær ikke kan være optimal til efterfølgende krystalvækst og vice versa. Ved at overføre nukleerede materiale fra en tilstand til en anden, kan man forsøge at effektivt at afkoble disse processer, og dermed give adgang til nye, endnu uudforsket krystallisering plads,og som et resultat at øge den samlede succesrate for en screening eksperiment. Er blevet dokumenteret etablerede metoder for (i) macroseeding, overførsel af en enkelt krystal i sin helhed fra en tilstand til en anden 8, (ii) streak såning, overførsel af nukleerede materiale, normalt er fremkommet ved anvendelse af retningsbestemt tryk ved hjælp af for eksempel en kats knurhår til overfladen af en eksisterende krystaller, efterfulgt af efterfølgende passage af sidelinje gennem en ny krystallisation dråbe 9, og (iii) "klassiske" microseeding, overførsel af krystal "frø", der genereres ved at høste knust krystaller (eller krystallinsk materiale), i forhold svarende til dem, der gav frø 10. Især alle tre af disse metoder er tidskrævende og dårligt skalerbar, i hvert fald i forhold til hvad der er muligt med moderne væskehåndteringssystemer krystallisering robotteknologi. Disse faktorer har bidraget, på et vist niveau i det mindste, til den opfattelse, at frøING er en metode kun skal besøges, når andre metoder har undladt at bære frugt.
Tilfældig matrix microseeding (RMMS) er en nyere metodisk innovation, der kombinerer fordelene ved traditionel microseeding med de high throughput screening og skalerbarhed 11-13. Denne tilgang er baseret på frembringelsen af en podekultur fremstillet af nukleeret krystallinsk materiale, som kan være alikvoteret i / på hver sub-well/coverslip inden for en standard 96-tilstand krystallisation skærmen. Denne metode anvendes til både siddende eller hængende drop dampdiffusion eksperimenter, der er etableret enten i hånden eller ved hjælp af flydende håndtering robotteknologi, i 24-brønd eller 96-brønds bakke format. risikohåndteringsforanstaltninger er påvist eksperimentelt at øge krystallisering succesrate, og producere krystaller af større diffraktion kvalitet og kvantitet 11, 13, 14, og repræsenterer et innovativt redskab i krystallografer 'arsenal af tilgange i ongoing indsats for krystallisering succes. Her beskriver vi en generel metode til risikohåndteringsforanstaltninger og leverer prøve data illustrerer effektiviteten af denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Strategiske overvejelser
- Valget af frø-krystaller brugt til microseeding eksperimenter vil variere afhængigt af formålet med forsøget. I begyndelsen af et projekt, er det nyttigt at finde flere krystallisering hits, der kan give alternative udgangspunkter for krystal optimering. risikohåndteringsforanstaltninger reducerer behovet for krystal optimering, fordi god kvalitet krystaller er mere tilbøjelige til at vokse i den metastabile zone fasediagrammet, dvs i det område, hvor følgende forstyrrelse eller kernedannelse vender systemet tilbage til ligevægt. Vi foreslår derfor, at benytte RMM rutinemæssigt, så snart de første krystaller opnås (eller mere præcist, så snart de første krystaller stoppe voksende).
- For den indledende runde af risikohåndteringsforanstaltninger, bør en froeunderlag gøres med så meget krystallinsk materiale som muligt. Hvis kun én brønd er til rådighed, der indeholder krystaller, eller hvis krystaller er små, kan det være nyttigt til at etablere flere gentagelser afoprindelige hit (uden såning) at øge udbuddet af krystaller. Hvis der imidlertid er flere forskellige hits opnået, kan podekrystaller høstes fra en række betingelser og blandes sammen.
- For at undgå faseseparation bør krystaller dyrkes i høj saltbetingelser høstes separat fra krystaller dyrket i høj-PEG-forhold. Hvis krystaller fra flere brønde blandes, bør et reservoir løsning, der er mindre tilbøjelige til at give saltkrystaller vælges for frø suspension. For eksempel bør høje koncentrationer af phosphat, sulfat, calcium og magnesium undgås.
- Senere i et projekt, kan det være vigtigt at se krystaller med forskellige bearbejdningsenheder celler for at forbedre diffraktion, undgå dublering af krystaller, og opnåelse af krystaller, der er egnet til binding af ligander. På dette stadium skal bruges kun de mest egnede krystaller (f.eks dem, der diffract bedst) for at gøre froeunderlag. Undertiden gentagne runder af microseeding er påkrævet, hvor kun den "bedste"Krystaller bruges til at lave frø materiel til den efterfølgende runde. Hvis det er muligt, en" skulle neutral "fældningsmiddel såsom PEG 3000 blive anvendt til at suspendere podekrystallerne i at tilskynde til nye krystal kontakter og til at krystallisere komplekser, der kan være ustabile i høj -saltopløsninger 12.
- Klassiske microseeding eksperimenter, hvor en enkelt krystallisering tilstand anvendes, er ofte nyttigt efter identifikation af en lovende tilstand og under den efterfølgende optimering. Det er ofte nødvendigt at fortynde froeunderlag for at få det ønskede antal krystaller per dråbe. A "kombinatorisk" microseeding eksperiment (hvor er der tilføjet en række stamkulturer af stigende fortynding til en krystallisering tilstand) er en hurtig metode til at finde den optimale fortynding af froeunderlag. Denne fremgangsmåde er beskrevet nedenfor.
2. Forberedelse af froeunderlag
- Lav en afrundet glas sonde fra et glas Pasteur pipette ved hjælp af en bunsenbraender.
- Opvarm pipetten nær midten, indtil den bliver blød, derefter hurtigt fjerne det fra flammen, og trække det ud ved at trække fra hinanden i enderne. Til formål at trække glasset ned til en diameter på under 0,25 mm.
- Smadre glasset på det punkt, hvor det er omkring 0,25 mm, og kortvarigt styrte brudt ende i flammen. Dette gentages, indtil en halvkugle af glas med en diameter på ~ 0,75 mm er dannet på enden. Denne probe er nyttigt til knusning krystallinsk materiale, da det passende er dimensioneret til slående faste genstande på 0,01-1,0 mm skala og det ikke beskadiger plast overflade af en krystallisering bakke sub-godt eller dækglas. Større prober (~ 1,0 mm), kan knuse små krystaller mere effektivt, fordi krystallerne er fanget mellem glas og plast.
- Placer en 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende en Seed Bead på is.
- Undersøg en forud fastsat krystallisering bakke ved hjælp af en kikkert mikroskop eller krystal imaging system, og vælg en eller flere apmæssig brønde fra bakken, hvorfra at høste krystallinsk materiale til froeunderlag generation. Ethvert materiale kan bruges, herunder fine nåle, sfærulitter, mikrokrystaller og uregelmæssige, dårligt dannede krystaller. Frøene bestand bør foretages så hurtigt som muligt efter krystaller stoppe voksende, da ældre materiale er mere tilbøjelige til at være delvist tværbundet, hvilket reducerer dens egnethed til brug i såning eksperimenter. Hvis der er tvivl om, hvorvidt det krystallinske materiale, der skal høstes, er salt eller protein brønden kan visualiseres ved hjælp af et UV-fluorescens mikroskop eller imaging system før åbning eller krystallinske materiale kan udsættes for in-situ røntgendiffraktion analyse i bakken. Når du bruger de tidligere tilgang proteinkrystaller fluorescerer under UV-bestråling, vil saltkrystaller vises farveløs.
- Åbn den valgte krystallisering bakke godt. For 96-godt sidde drop bakker skærer gennem den øverste plast forseglingsark omkring den valgte godt USIng en skalpel. For 24-brønds hængende dråbe bakker fjerne dækglasset ved hjælp af en pincet. Vend dækglasset og anbringe den på en stabil ren overflade. Fjern 50 pi af reservoiret opløsning og overføre denne væske til mikrocentrifugerør indeholdende Seed Bead sikre, at røret forbliver på is i hele.
- Grundigt knuse krystallerne i subwell (96-brønds bakke) eller dækglas (24-brønds bakke) falder, ved hjælp glassondetypen udarbejdet i afsnit 2.1, visning af resultaterne under et mikroskop. Små krystaller kan tage flere minutter at knuse grundigt. Dette trin tillader eksperimentatoren for at kontrollere, at krystallerne er lette at knuse og er derfor ikke tværbundet, og at de ikke er saltkrystaller. Saltkrystaller producere en karakteristisk klik, der kan høres og mærkes, når de er knust. Hvis krystallerne er hårde og vanskelige at knuse forsøge at opnå og bruge friskere materiale.
- Fjern 5 ul af reservoiret opløsningen fra Seed Bead rør og tverførselsplacering til den tilsvarende sub-godt (siddende drop eksperiment) eller dækglas (hængende drop eksperiment), der indeholder krystallinsk materiale, der skal høstes. Pipette denne væske op og ned 5-6 gange for at resuspendere så meget af sub-godt eller dækglas-indholdet som muligt. Retur suspensionen til Seed Bead rør og gentag dette trin to gange mere, der sikrer, at så meget krystallinsk materiale høstes som muligt.
- Vortex Seed Bead i to minutter, stopper hver 30 sek til at afkøle røret på is.
- Lav en fortyndingsrække, fortynde froeunderlag i reservoir løsning med en faktor 4 til 10 på hvert trin. Typisk vil for mange krystaller opnås ved brug af en ufortyndet froeunderlag, så brug de fortyndede frøbeholdninger at kontrollere antallet af krystaller per brønd. I første runde af risikohåndteringsforanstaltninger, er det vigtigt ikke at fortynde froeunderlag løsning, da den større koncentration af frø jo flere krystallisering hits vil blive opnået.
- Hvis det ikke skal anvendes straksbart, overføre froeunderlag suspension og den fortyndede froeunderlag til en -20 ° C eller -80 ° C fryser til opbevaring. For at forhindre gentagne fryse-tø cykler, hvilket kan reducere effekten af froeunderlag Opbevar dette materiale i små mængder portioner, nemlig 10-20 gl. Når frosne, kan frøbeholdninger opbevares uendeligt indtil brug.
3. Etablering af Krystallisation Bakker
- Afhængig af tilgængeligheden af krystallisering faciliteter og præferencer forsøgslederen kan risikohåndteringsforanstaltninger krystallisering screening udføres ved hjælp af enten bakker med 24 brønde beskæftiger hængende drop dampdiffusion metode, eller 96-brønds bakker vha. siddende drop dampdiffusion metode. Kan etableres krystallisations bakker til risikohåndteringsforanstaltninger enten i hånden ved hjælp af en væskehåndtering robot dispenser, eller en kombination af de to.
- Et typisk risikohåndteringsforanstaltninger eksperiment oprettet ved hånden vil omfatte 1,0 pi protein løsning, 1,0 pi krystallisering tilstand, og0,5 pi froeunderlag. Et typisk eksperiment sat op ved hjælp af en krystallisering robot vil omfatte 0,3 pi protein løsning, 0,2 pi krystallisering tilstand og 0,1 pi froeunderlag.
- For at udføre risikohåndteringsforanstaltninger screening i 24-brønds hængende dråbe bakker, dels ved hjælp af en manuel pipette 300 pi af hver tilstand fra en 96-brønds tilstand krystallisation skærmen på 10 ml tube format i hver brønd i 4 x 24-brønds pregreased krystallisation bakker.
- Overfør 1 pi af hver krystallisation tilstand fra hver 300 pi reservoir på overfladen af en tilsvarende plast dækglas hvorfra både forreste og bageste beskyttende backing strimler er blevet fjernet.
- Til 1 ml af hver krystallisering tilstand tilføje 1 ml af protein løsning efterfulgt af 0,5 pi krystal froeunderlag. Vend hver dækglas, således at dråbe væske nedad vender og position over den relevante godt.
- Tryk nedad på dækglasset komprimere sealing fedt og danner en sikker forsegling. Når alle 96 dråber er etableret, skal bakken overføres til en inkubator eller konstant temperatur, som regel i intervallet 4-18 ° C til opbevaring.
- For at udføre risikohåndteringsforanstaltninger screening i 96-brønds siddende dråbe bakker først overføre 20-50 ul af hver tilstand fra en 96-brønds tilstand krystallisation skærm i dyb brønd blok format til hver tilsvarende brønd i krystallisering bakken. Dette trin overførsel kan udføres enten ved hjælp af en krystallisering robot, eller ved manuel overførsel ved hjælp af en 8-kanals pipette.
- Transfer reservoir, protein og froeunderlag løsninger på de dråber i hånden eller med en robot ved hjælp af de mængder, der er beskrevet i 3.1. Nogle kommercielt tilgængelige krystallisering robotter kontakter ikke dispensere, og udførelse froeunderlag transfer hjælp et sådant system kan resultere i blokering af dispensering tips eller tilhørende slange. Rækkefølgen af dispensering er variabel: nogle robotter dispensere alle løsninger samtidig. Hvisdette ikke er muligt, dispensere protein først, derefter Reservoir, så froeunderlag.
- Hvis en kontakt dispensering robot er ikke tilgængelig transfer frøene med en sprøjte lav volumen glas monteret med en stump kanyle. Skyl nålen ved at føre det gennem reservoiret løsning, så dispensere froeunderlag i hver dråbe.
- Forsegl bakken ved hjælp af en transparent forseglingsark og overføre til en inkubator eller konstant temperatur til opbevaring.
4.. Inspektion af Krystallisation Bakker
- Visualiser alle krystallisationseksperimenter ved hjælp af enten et binokulært mikroskop eller en krystal imaging system. Den tidligere generelt giver brugeren større kontrol over udsigt dybde og graden af forstørrelse end sidstnævnte, men er mere tidskrævende.
- Undersøg hver sub-well/coverslip i rækkefølge og registrere ethvert tegn på krystal-dannelse. Forsøgene skal efterses en gang hver 24 timer i 5 dage efter etablering ogn derefter en gang hver 7 dage i op til 4 uger.
- Kræves ofte adskillige cyklus af risikohåndteringsforanstaltninger før optimal diffraktion kvalitet krystaller er produceret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(A) Eksempel på en risikohåndteringsforanstaltninger eksperiment
For at demonstrere effektiviteten af risikohåndteringsforanstaltninger screening vi anvendt denne metode til krystallisering af hønseæggehvidelysozym (HEWL) og bovin leverkatalase (BLC). Begge disse enzymer er eminent krystalliserbar og strukturelt godt karakteriseret mål 15, 16. Som sådan både giver gode testpersoner med til at illustrere den forbedrede krystallisering succesrate opnås med risikohåndteringsforanstaltninger. Krystallisering eksperimenter blev etableret i 96-godt sidde drop bakke format ved hjælp af flydende håndtering robotteknologi. Opløsninger af HEWL og BLC blev fremstillet ved at opløse frysetørrede pulvere af hver i 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5, til slutkoncentrationer på 100 mg / ml og 20 mg / ml. For hvert protein tre 96-condition krystallisering skærme blev brugt, JCSG PACT og Morpheus. Krystallisation screening uden microseeding blev udført ved anvendelse reservoir volumener 50 pi, og 2 ulsiddende dråber indeholdende 1 ml protein-opløsning og 1 ml af reservoiropløsning. De seks bakker blev opbevaret i et rum med konstant temperatur ved 18 ° C og undersøges dagligt under anvendelse af et binokulært mikroskop. Ethvert tegn på krystal vækst blev registreret. Efter fem dages en enkelt betingelse fra hver bakke, der blev fundet til at understøtte væksten af krystallinsk materiale blev udvalgt og brugt til froeunderlag generation. risikohåndteringsforanstaltninger screening blev udført som for ikke-RMMS screening, med den undtagelse at 2,5 pi sidder dråber indeholdende 1 ml protein-opløsning, 1 ml af reservoiropløsning og 0,5 pi stamkultur blev anvendt. Alle seks risikohåndteringsforanstaltninger bakker blev overført til et rum med konstant temperatur ved 18 ° C og undersøges dagligt ved hjælp af en kikkert mikroskop. Efter fem dages RMMS bakker af begge proteiner blev inspiceret, og antallet af dråber med krystaller blev registreret. Figur 1 opsummerer resultaterne fra dette forsøg og giver kvantitativ analyse. For HEWL en 4 til 10-foldstigning i krystallisation succesrate, sammenlignet med ikke-podede bakker blev observeret, når RMM blev anvendt til dette protein. Især for BLC kun en enkelt betingelse i skærmbilledet Morpheus blev fundet at give krystaller i forhold til 55, er identificeret efter brug af risikohåndteringsforanstaltninger. Endvidere var der en 3 og 7-dobling i succesrate i BLC krystallisering hjælp JCSG og PACT skærme hhv. I alle tilfælde og uanset krystallisering skærm, der anvendes risikohåndteringsforanstaltninger screening gav en signifikant større samlet antal krystaller end ikke-risikohåndteringsforanstaltninger screening. Gentagelse af RMMS screening eksperimenter beskrives ved hjælp af en 1:100 fortyndet frø gav signifikant færre hits end når den ufortyndede froeunderlag blev brugt, hvilket forstærker kravet om at anvende ufortyndede lagre, når du udfører den indledende runde af risikohåndteringsforanstaltninger eksperimenter. For begge proteiner var der lidt tilsyneladende variation i krystal kvalitet, som bedømt af størrelse, morfologi, og dobbeltbrydning. Sammenlignende vurdering af DIFbrøkdel kvaliteten af de krystaller, der genereres ved hjælp af risikohåndteringsforanstaltninger i modsætning til konventionelle screeningsmetoder går uden for rammerne af denne undersøgelse, dog indledende indledende diffraktion analyse ved hjælp af synkrotronstråling af en delmængde af krystaller af begge proteiner isoleret fra risikohåndteringsforanstaltninger og ikke-risikohåndteringsforanstaltninger skærme angives der til være lidt variation i diffraktion kvalitet, som bedømt på grundlag af resolution grænse og spot profil.
(B) Et eksempel på at optimere antallet af krystaller per dråbe
Microseeding teknikker regelmæssigt giver byger af små krystaller. Det er derfor ofte nødvendigt at fortynde froeunderlag at reducere omfanget af kernedannelse. Desuden kan det undertiden være umuligt at dyrke krystaller hit betingelser, der blev fundet af risikohåndteringsforanstaltninger når podning ikke anvendes 5. Det sådanne tilfælde er det ofte nyttigt at bruge "klassiske" microseeding, hvor flere dråber er sat op ved hjælp af den samme reservoir løsning med forskellige fortyndinger af en froeunderlag. Denne cen ske systematisk i flere bly betingelser på en enkelt plade ved hjælp af en "kombinatorisk"-tilgang (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, personlig kommunikation), som vist i figur 2.. Her én eller flere hit opløsninger (H1 - H6) er dispenseret i de kolonner i en krystallisering plade, mens en anden fortynding af en stamkultur (S1 - S9) sættes til dråber af hver række. Derfor er hver kombination af hit-opløsning og fortyndet froeunderlag er testet på en enkelt plade, og det passende niveau for fortynding og tendenser tilstedeværende nemt kan identificeres.
Vi anvendte denne kombinatorisk microseeding tilgang til tre model proteiner, xylanase, thaumatin og termolysin. Hvert protein blev testet med en krystallisation tilstand, der tidligere havde vist sig ikke at give krystaller i fravær af såning, men gav konsekvent krystaller ved podning blev brugt. De krystallisationsbetingelser anvendes til xylanase, thaumatin og thermolysin er anført i tabel 2. Fire til seks betingelser blev fastsat for hvert protein med enten to eller tre gentagelser af hver protein / tilstand / froeunderlag kombination som vist. Dråber omfattede 0,3 ul protein, 0,29 pi reservoir løsning, og 10 nl froeunderlag. Alle bakker blev etableret ved hjælp af en flydende håndtering krystallisering robot. Neat froeunderlag og seks fortyndinger heraf blev oprettet for hvert protein. Andre eksperimentelle detaljer er blevet rapporteret tidligere 12. Det gennemsnitlige antal af krystaller opnået pr dråbe afbildes mod udvanding af froeunderlag i figur 3. Disse data viser, at antallet af krystaller følger en omtrent lineær sammenhæng med antallet af frø tilføjet. For de tre testede proteiner blev 01:10 -3 til 01:10 -6 fortyndinger kræves for at opnå 1-10 krystaller per dråbe.
Tabel 1. Liste over materialer.
| Krystallisering cocktail | Antal dråber, der er etableret pr bakke | |
| Xylanase (36 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfat, 0,1 M Tris-HCI pH 8,5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 30% (w / v) PEG 4000, 0,2 M natriumacetat, 0,1 M Tris-HCI pH 8,5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 4 M natriumformiat | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 3,5 M ammoniumsulfat, 250 mM natriumchlorid, 50 mM natrium / kaliumphosphatpuffer pH 7,5 | 3 |
| Xylanase (36 mg / ml) | 1,5 M kaliumphosphat pH 7,0 | 3 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 30% (w / v) PEG 4000, 0,2 M ammoniumacetat, 0,1 M natriumcitrat pH 5,6 | 2 |
| 20% (w / v) PEG 4000, 20% (v / v) 2-propanol, 0,1 M natriumcitrat pH 5,6 | 2 | |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 30 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M ammoniumsulfat, 0,1 M natriumcacodylat, pH 6,5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 20 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M magnesiumacetat, 0,1 M natriumcacodylat, pH 6,5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 2 M ammoniumsulfat, 0,1 M Tris-HCI pH 8,5 | 2 |
| Thaumatin (30 mg / ml) | 1,5 M lithiumsulfat, 100 mM HEPES, pH 7,5 | 2 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 20,0% (w / v) PEG 6000, 100 mM citronsyre, pH 5,0 | 3 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 1,26 M ammoniumsulfat, 200 mM lithiumsulfat, 100 mM Tris-HCI pH 8,5 | 3 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 10% (v / v)MPD, 100 mM bicin pH 9,0 | 3 |
| Thermolysin (15 mg / ml) | 800 mM ravsyre pH 7,0 | 3 |
Tabel 2. Proteinopløsninger og krystallisationsbetingelser, der anvendes i den kombinatoriske microseeding eksperimentet.
Figur 1. (A) Sammenligning af risikohåndteringsforanstaltninger og ikke-risikohåndteringsforanstaltninger krystallisering screening eksperimenter. Betingelser understøtter krystal vækst er i grøn, betingelser ikke understøtter krystal vækst er i grå. Betingelser valgt til anvendelse i stamkulturens generation er i pink. Krystallisering skærme er mærket som følger (i) hønseæggehvidelysozym, JCSG, ikke-risikohåndteringsforanstaltninger, (ii) hønseæggehvidelysozym, JCSG, risikohåndteringsforanstaltninger, (iii) hønseæggehvidelysozym PACT, ikke-risikohåndteringsforanstaltninger, (iv) høne fx g hvid lysozym, Pact, risikohåndteringsforanstaltninger, (v) hønseæggehvidelysozym, Morpheus, ikke-risikohåndteringsforanstaltninger, (vi) hønseæggehvidelysozym, Morpheus, risikohåndteringsforanstaltninger, (vii) okselever katalase, JCSG, ikke-risikohåndteringsforanstaltninger, (VIII) okselever katalase, JCSG, risikohåndteringsforanstaltninger, (ix) okselever katalase, PACT, ikke-risikohåndteringsforanstaltninger, (x) okselever katalase, Pact, risikohåndteringsforanstaltninger, (xi) okselever katalase, Morpheus, ikke-risikohåndteringsforanstaltninger, (xii) okselever katalase, Morpheus, risikohåndteringsforanstaltninger. (B) Sammenlignende analyse af krystallisering succesrate ved hjælp af risikohåndteringsforanstaltninger og ikke-risikohåndteringsforanstaltninger krystallisering screening. For ikke-risikohåndteringsforanstaltninger screening af antallet af krystallisationsbetingelser identificeret som støtte krystal vækst i enten HEWL eller BLC er vist i blå, for risikohåndteringsforanstaltninger screening af antallet af krystallisationsbetingelser identificeret som støtte krystal vækst i enten HEWL eller BLC er vist i rødt. Oplysningerne er baseret på inspektion af krystallisering bakker 5 dage efter etablering.
2.jpg "/>
Figur 2. Fordeling af krystallisationsbetingelser og fortyndet froeunderlag suspensioner for et enkelt protein i et eksempel kombinatorisk microseeding eksperiment. Fremhævede kolonner H1-H6 indeholder forskellige krystallisationsbetingelser understøtter målprotein krystalvækst. Fremhævet rækker S1-S7 indeholder forskellige fortyndinger af et mål protein froeunderlag suspension.
Figur 3. Sammenhæng mellem stamkulturens fortynding og gennemsnitligt antal krystaller opnået pr fald i en kombinatorisk microseeding eksperiment. De tre anvendte proteiner var xylanase, thaumatin og thermolysin. Dråber blev indført i en 96-brønds MRC pladen ved hjælp af en væske håndteringsrobot, og omfatter 0,3 pi protein, 0,29 pi reservoir opløsning og 10 nl af frisk SEed lager. De præsenterede data er baseret på inspektion af krystallisering bakker 5 dage efter etablering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir har vi beskrevet en generel metode til risikohåndteringsforanstaltninger proteinkrystallisation screening. Vi har vist, at bruge to test proteiner en betydelig forbedring i krystallisering succesrate ved hjælp af denne metode. Diffraktionsanalyse hjælp synkrotronstråling af en delmængde af krystaller genereres ved hjælp af risikohåndteringsforanstaltninger og ikke-risikohåndteringsforanstaltninger metoder afslørede lidt variation i diffraktion kvalitet mellem krystaller dyrket ved hjælp af enten metode, selv om de tidligere forfattere har rapporteret, at god kvalitet krystaller er mere tilbøjelige til at vokse i risikohåndteringsforanstaltninger eksperimenter 11, 13.. HEWL og BLC kan have givet atypiske resultater, fordi de er usædvanligt nemme at krystallisere. Vi illustrerer også vigtigheden af at optimere koncentrationen af krystal frøbeholdninger anvendes i risikohåndteringsforanstaltninger eksperimenter og viser, hvordan dette kan justeres ved fortynding for at sikre, at der produceres et optimalt antal af diffraktion kvalitet krystaller.
risikohåndteringsforanstaltningernes en enkel, høj kapacitet, højskalerbar fremgangsmåde, som kan anvendes til at supplere de traditionelle screeningsmetoder. Eksperimenter kan oprettes manuelt eller med robot, i 96-brønd eller bakker med 24 brønde, og i hængende eller siddende dråbe formater. Den største begrænsning risikohåndteringsforanstaltningernes at den er afhængig af at opnå en form for krystallinsk materiale af et målprotein (eller et homologt protein) for at generere en podekultur i første instans. Det skal dog bemærkes, at høj kvalitet krystallinsk materiale ikke er nødvendig, ja forfatterne har med succes brugt mikrokrystaller og amorft bundfald til opnåelse stamkulturer. Anvendelsen risikohåndteringsforanstaltningernes screening er ikke begrænset til vækst af krystaller af native proteiner. For eksempel er RMMS velegnet til dyrkning af krystaller af selenomethione eller selenocystein substituerede varianter. I sådanne tilfælde kan krystaller af det native protein kan anvendes til at gøre stamkultur. Selvom alternativ krystal nukleær protokoller er blevet dokumenteret 1,4, ingen er så anvendelig til så bredt arange af proteiner som risikohåndteringsforanstaltninger.
Efter risikohåndteringsforanstaltninger et kombinatorisk microseeding fremgangsmåde kan anvendes til at optimere graden af podning for at fremstille krystaller til dataindsamling. Dette er især nyttigt for ligand-iblødsætning eksperimenter, hvor der ofte kræves et stort antal krystaller. Ved hjælp af denne metode en hel krystallisering skærmen kan hurtigt etableret ved hjælp microseeding i kombination med en fortyndet froeunderlag, med hver brønd giver et relativt lille antal af krystaller.
Afslutningsvis vil vi opfordre alle engageret i makromolekylære krystallisering at gøre risikohåndteringsforanstaltninger en del af deres rutinemæssige arbejdsgange i alle tilfælde, hvor diffracting krystaller ikke er fremstillet direkte fra deres oprindelige skærme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret delvist af BBSRC (BB/1006478/1). PRR er modtageren af en Royal Society University Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
