Summary
Aqui nós descrevemos um método geral para triagem aleatória matriz microseed. Esta técnica é mostrado para aumentar significativamente a taxa de sucesso de proteína de cristalização experimentos de triagem, reduzir a necessidade de otimização, e fornecer um suprimento confiável de cristais para a coleta de dados e experimentos ligante de imersão.
Abstract
Rastreio aleatório matriz microseed (MGR) é uma técnica de cristalização de proteínas, em que os cristais de semente são adicionados às telas aleatórios. Ao aumentar a probabilidade de que os cristais vai crescer na zona metaestável do diagrama de fases de uma proteína, leva cristalização extras são muitas vezes obtidos, a qualidade dos cristais produzidos poderá ser aumentado, e uma boa oferta de cristais para coleta de dados e experiências de imersão é fornecido. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR que podem ser aplicadas a qualquer sentados gota ou pendurados experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 96 poços ou formato de tabuleiro de 24 poços.
Introduction
A partir de sua aplicação inicial por Perutz, Kendrew e colegas de trabalho na determinação das estruturas de hemoglobina e mioglobina, aos alto rendimento modernos pipelines automatizados da genômica estrutural consórcios, macromolecular cristalografia de raios-X nos proporcionou uma visão estrutural sem precedentes no mundo da proteína . Esta técnica continua sendo o método experimental mais amplamente aplicável, que permite a visualização direta da estrutura da proteína em atômica, ou perto de resolução atômica (ou seja, no intervalo a 1-3). Um pré-requisito para a difracção de raios-X para ser aplicado a uma proteína é que ele deve primeiro ser cristalizado, e é esta fase do processo, que continua a ser o maior única etapa limitante da velocidade na determinação da estrutura por meio de métodos de difracção de 1, 2. Apesar dos avanços significativos em nossa compreensão do processo de cristalização de proteínas, e grandes melhorias na qualidade e disponibilidade de telas de cristalização,bandejas, e tecnologias relacionadas, permanece impossível prever com segurança a probabilidade de sucesso de cristalização 3. Métodos bioquímicos e biofísicos pode ser aplicado para avaliar se uma proteína de interesse apresenta características favoráveis para a nucleação e crescimento de cristais, ou seja, é bem dobrada, homogêneo, monodispersa, etc, no entanto, essas idéias de forma alguma fornecer uma previsão definitiva de cristalização propensão.
Sementeira tem sido suposto ser um método viável para aumentar o número, o tamanho e a qualidade dos cristais existentes ou material cristalino 4-7. Esta abordagem é baseada na premissa de que uma condição que suporta nucleação de cristais pode não ser ideal para o crescimento de cristais posterior e vice-versa. Por transferência de material nucleadas de uma condição para outra, pode-se tentar separar efetivamente esses processos, dando assim acesso, espaço novo cristalização ainda tão pouco explorado,e, como resultado do aumento da taxa de sucesso total de uma experiência de rastreio. Métodos estabelecidos foram documentadas para (i) macroseeding, a transferência de um único cristal na sua totalidade a partir de um estado para outro 8, (ii) sequência de semeadura, a transferência de material em núcleos, geralmente obtidos através da aplicação de pressão, por exemplo, usando direccional suiça de um gato para a superfície de um cristal existente, seguido pela passagem subsequente do suiça através de uma nova gota cristalização 9, e (iii) microdispersão "clássica", a transferência de cristais "sementes", gerados pela colheita esmagado cristais (ou cristalino material), em condições semelhantes às que produziram as sementes 10. Notavelmente todos esses três métodos são demorados e pouco escalável, certamente em comparação com o que é possível com modernos robótica cristalização manipulação de líquidos. Esses fatores têm contribuído, em algum nível, pelo menos, para a percepção de que as sementesing é um método único para ser visitado quando outras abordagens falharam a dar frutos.
Aleatório matriz microdispersão (MGR) é uma inovação metodológica recente que combina os benefícios da microdispersão tradicional com os de rastreio de alto rendimento e escalabilidade 11-13. Esta abordagem baseia-se na geração de um stock de sementes, produzido a partir de material cristalino nucleada, que podem ser divididas em alíquotas para / em cada sub-well/coverslip dentro de uma tela de cristalização de 96 condição padrão. Este método é aplicável tanto sentado ou pendurado experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 24 poços ou formato de tabuleiro de 96 poços. MGR foi demonstrada experimentalmente para aumentar significativamente a taxa de sucesso de cristalização, e produzir cristais de melhor qualidade e maior quantidade de 11, 13, 14 de difracção, e representa uma ferramenta inovadora no arsenal dos cristalógrafos de abordagens no oNgoing esforço para o sucesso de cristalização. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR e fornecer dados de exemplo que ilustram a eficácia desta técnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Considerações Estratégicas
- A escolha de uma semente de cristais utilizados para experiências microdispersão irá variar, dependendo do objetivo do ensaio. No início de um projeto é útil para encontrar vários hits de cristalização que podem fornecer pontos de partida alternativos para otimização de cristal. MGR reduz significativamente a necessidade de otimização de cristal porque cristais de boa qualidade são mais propensos a crescer na zona metaestável do diagrama de fases, ou seja, na região onde seguinte perturbação ou nucleação o sistema retorna ao equilíbrio. Assim, sugerimos usar Rmms rotineiramente assim que os primeiros cristais são obtidos (ou, mais precisamente, logo que os primeiros cristais parar de crescer).
- Para a rodada inicial de MGR, um estoque de sementes deve ser feita com o máximo de material cristalino possível. Se apenas um poço está disponível que contém cristais, ou se os cristais são pequenos, pode ser útil para definir múltiplas repetições dohit original (sem semeadura) para aumentar a oferta de cristais. Se, no entanto, vários acessos diferentes são obtidos, os cristais de semente podem ser colhidas a partir de várias condições e misturados em conjunto.
- Para evitar a separação de fase, os cristais crescidos em condições de alto sal devem ser colhidas separadamente dos cristais crescidos em condições de alta PEG. Se os cristais de vários poços são misturados, uma solução de reserva que é menos susceptível de dar origem a cristais de sal deve ser seleccionada para a suspensão de sementes. Por exemplo, a altas concentrações de fosfato, sulfato, cálcio e magnésio deve ser evitada.
- Mais tarde, num projecto, pode ser importante procurar cristais com células unitárias diferentes, a fim de melhorar a difracção, evitar cristais geminados, e obter cristais que são adequados para ligandos de ligação. Nesta fase, apenas os cristais mais adequadas (por exemplo, aqueles que difractam melhor) deve ser utilizado para fazer o material de sementes. Às vezes, são necessárias repetidas rodadas de microdispersão, onde apenas o "melhor"Cristais são usados para fazer o material de semente para o ciclo subsequente. Se possível, um" agente precipitante neutros "tais como o PEG 3000 deve ser usado para suspender os cristais de semente para encorajar novos contactos de cristais e cristalização de complexos que podem ser instáveis em alta soluções salinas-12.
- Experimentos microdispersão clássicos, onde uma condição única cristalização é usado, muitas vezes são úteis após a identificação de uma condição promissora e durante a otimização subseqüente. Muitas vezes, é necessário diluir o estoque de semente de forma a obter o número desejado de cristais por gota. A "combinatória" experimento microdispersão (onde uma série de estirpes de crescente diluição são adicionados a uma condição de cristalização) é um método rápido para encontrar a diluição ideal do estoque de sementes. Esta abordagem é descrita abaixo.
2. Preparação de semente da Bolsa
- Faça uma sonda de vidro arredondado de uma pipeta Pasteur de vidro usando uma chama de Bunsen.
- Aqueça a pipeta perto do meio até que se torne macio, em seguida, removê-lo rapidamente da chama e retirá-la, puxando para além das extremidades. Destinam-se a puxar o copo de diâmetro inferior a 0,25 mm.
- Quebre o vidro no ponto onde ela é de cerca de 0,25 milímetros e brevemente mergulhar o final arrombado a chama. Repetir este procedimento até um hemisfério de vidro com um diâmetro de 0,75 milímetros ~ é formada na extremidade. Esta sonda é útil para esmagar material cristalino, uma vez que está devidamente dimensionada para golpear objetos sólidos na escala de 0,01-1,0 mm e não danificar a superfície de plástico de uma cristalização bandeja sub-bem ou lamela. Sondas maiores (~ 1,0 mm) pode esmagar pequenos cristais de forma mais eficaz porque os cristais são presos entre o vidro e plástico.
- Coloque um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo uma semente de grânulo de gelo.
- Inspecione a bandeja cristalização pré-estabelecida, utilizando um microscópio binocular ou sistema de imagem de cristal e selecione uma ou mais apquada poços da bandeja a partir da qual colhem material cristalino para geração de estoque de sementes. Qualquer material pode ser utilizado, incluindo as agulhas finas, esferulites, microcristais e irregulares, cristais mal formados. O estoque de sementes deve ser feita o mais rapidamente possível após os cristais param de crescer, como o material mais antigo é mais provável que seja parcialmente reticuladas, reduzindo assim a sua adequação para uso em experimentos de semeadura. Se existir qualquer dúvida quanto ao facto de o material cristalino a ser colhido é o sal ou a proteína também pode ser visualizado utilizando um microscópio de fluorescência, UV ou um sistema de imagem antes da abertura, ou se o material cristalino pode ser sujeito a análise in-situ de difracção de raios-X na bandeja. Ao usar os antigos cristais de proteínas abordagem fluorescência sob irradiação UV, cristais de sal aparecerá incolor.
- Abra a bandeja de cristalização bem selecionado. Para 96 poços sentado bandejas gota cortam a folha de plástico de vedação superior ao redor do poço selecionado using uma lâmina de bisturi. Para 24 poços tabuleiros hanging gota remover a lamela utilizando um par de pinças. Inverta a lamela e coloque-o sobre uma superfície limpa estável. Retirar 50 mL da solução de reservatório e transferir o líquido para o tubo de microcentrífuga contendo a semente grânulo assegurar que o tubo se mantém no gelo durante todo.
- Completamente esmagar os cristais no subwell (96 poços bandeja) ou lamela (bandeja de 24 poços) cai, utilizando a sonda de vidro preparado na seção 2.1, a visualização dos resultados sob um microscópio. Pequenos cristais pode demorar alguns minutos para esmagar completamente. Este passo permite que o experimentador para verificar que os cristais são fáceis de esmagar e por isso não são de ligação cruzada, e também que não se encontram cristais de sal. Cristais de sal produzir um clique característico que pode ser ouvido e sentido quando são esmagados. Se os cristais são duras e difíceis de esmagar tentativa de obter e utilizar o material mais fresco.
- Retirar 5 ml da solução de reservatório a partir do tubo de talão de sementes e transferência para o sub-bem equivalente (sentado experimento gota), ou lamela (pendurado experimento gota) contendo o material cristalino a ser colhida. Pipetar este líquido para cima e para baixo 5-6 vezes para voltar a suspender o máximo de sub-bem ou lamela conteúdo possível. Retorne a suspensão no tubo do grânulo Semente e repita esta etapa mais duas vezes, garantindo que o material cristalino, tanto é colhida possível.
- Vortex o grânulo semente, durante dois minutos, paragem a cada 30 segundos para arrefecer o tubo em gelo.
- Fazer uma série de diluições, a diluição da solução stock de sementes no reservatório por um factor de 4 a 10 em cada fase. Normalmente, muitos cristais serão obtidos ao usar um estoque de sementes não diluído, então use os stocks de sementes diluídas para controlar o número de cristais por bem. Na primeira rodada de MGR, é importante para não diluir a solução estoque de sementes, uma vez que quanto maior a concentração de sementes os hits mais de cristalização serão obtidos.
- Se não estiver a ser utilizado imediatamentetamente, transferir a suspensão de estoque de sementes e do stock de sementes diluída para uma -20 ° C, ou -80 ° C congelador para armazenamento. Para evitar que os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos, o que pode reduzir a eficácia do stock de sementes, armazenar este material em pequenas alíquotas de volume, ou seja, 10-20 ul. Uma vez congelado, os estoques de sementes podem ser mantidos indefinidamente até que seja necessário.
3. Estabelecimento de cristalização Bandejas
- Dependendo da disponibilidade de locais de cristalização e as preferências do experimentador, MGR rastreio de cristalização pode ser realizada utilizando ou bandejas de 24 poços empregando o método de difusão de vapor de gota em suspensão, ou em tabuleiros de 96 poços utilizando o método de difusão de vapor gota sentado. Tabuleiros de cristalização para Rmms pode ser estabelecida tanto por lado, utilizando um dispensador de líquido de manuseamento robotizado, ou uma combinação dos dois.
- Uma experiência típica MGR criado pela mão compreenderá, 1,0 mL solução de proteína, condição cristalização 1,0 mL, e0,5 mL estoque de sementes. Uma experiência típica configurada usando um robô cristalização compreenderá, solução de proteína de 0,3 mL, 0,2 mL condição de cristalização, e 0,1 mL estoque de sementes.
- Para realizar a triagem Rmms em 24 poços pendurado bandejas gota, em primeiro lugar, usando uma pipeta manual, transferir 300 ul de cada condição de uma tela de condições de cristalização de 96 poços em 10 mL de formato de tubo único para cada poço de 4 x 24 poços cristalização pregreased bandejas.
- Transferência de 1 ul de cada uma das condições de cristalização a partir de cada reservatório de 300 ul para a superfície de uma lamela de plástico correspondente a partir do qual ambas as tiras de suporte de protecção dianteiros e traseiros foram removidos.
- Para os 1 ml de cada uma das condições de cristalização adicionar 1 ml de solução de proteína, seguido por 0,5 l de estoque de sementes de cristal. Inverter cada lamela de tal forma que a gota de líquido é virada para baixo e por cima da posição apropriada bem.
- Pressione para baixo sobre a lamela, comprimindo o sealing graxa e formando uma vedação segura. Uma vez que todas as gotas 96 são estabelecidas, a bandeja deve ser transferido para uma incubadora ou numa sala de temperatura constante, normalmente na gama de 4-18 ° C durante o armazenamento.
- Para realizar a triagem Rmms em 96 poços sentado bandejas gota em primeiro lugar transferir 20-50 ul de cada condição de uma tela condição de cristalização de 96 poços no formato de bloco de poços profundos em cada cavidade correspondente da bandeja de cristalização. Esta etapa de transferência pode ser realizada utilizando um robot de cristalização, ou por transferência manual, utilizando uma pipeta de 8 canais.
- Transferência de reservatório, proteínas e sementes soluções estoque para as gotas à mão ou com um robô usando os volumes detalhados em 3.1. Alguns robôs de cristalização comercialmente disponíveis não entre em contato dispense, e desempenho de sementes de transferência de estoque usando um tal sistema pode resultar em bloqueio de dispensar dicas ou tubulação associada. A ordem de distribuição é variável: alguns robôs dispensar todas as soluções simultaneamente. Seisso não é possível, dispensar proteína primeiro, depois o reservatório, então sementes de ações.
- Se um contato dispensação robô não é transferência disponíveis as sementes usando uma seringa de vidro de baixa de volume com uma agulha sem corte. Lavar a agulha passando-a através da solução do reservatório, em seguida dispensar o estoque de sementes em cada gota.
- Selar o tabuleiro com uma folha de selagem transparente e transferir para uma incubadora ou sala de temperatura constante, durante o armazenamento.
4. Inspeção de cristalização Bandejas
- Visualize todos os experimentos de cristalização usando tanto um microscópio binocular ou um sistema de imagem de cristal. O ex geralmente proporciona ao utilizador um maior controlo sobre a profundidade de visão e o grau de ampliação do que o segundo, mas é mais demorado.
- Inspecione cada sub-well/coverslip em seqüência e registrar qualquer evidência de formação de cristais. Experimentos deve ser inspecionado a cada 24 horas durante 5 dias após o estabelecimento ean, posteriormente, uma vez a cada 7 dias para até 4 semanas.
- Múltiplos ciclos de MGR muitas vezes são necessárias antes de cristais de qualidade óptima de difracção são produzidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(A) Exemplo de um experimento MGR
Para demonstrar a eficácia do rastreio MGR aplicamos este método para a cristalização de galinha lisozima de ovo branco (HEWL) e fígado bovino catalase (BLC). Ambos estes enzimas são eminentemente cristalizável e são estruturalmente alvos 15, 16, bem caracterizados. Como tal, tanto fornecer assuntos de teste excelentes com as quais ilustram a taxa de sucesso reforçada cristalização alcançável com MGR. Experimentos de cristalização foram estabelecidos em 96 poços sentado formato bandeja queda utilizando robótica de manipulação de líquidos. Soluções de HEWL BLC e foram produzidos por dissolução de pós liofilizados de cada em 20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7,5, para uma concentração final de 100 mg / ml e 20 mg / ml, respectivamente. Para cada proteína foram utilizados três telas de cristalização de 96 de condição; JCSG, PACT e Morpheus. Rastreio cristalização sem microdispersão foi realizada utilizando volumes de reservatório de 50 uL, e 2 ulsentado gotas compreendendo 1 ml de solução de proteína e 1 ml de solução de reservatório. Os seis bandejas foram armazenadas numa sala de temperatura constante a 18 ° C e inspeccionados diariamente usando um microscópio binocular. Qualquer evidência de crescimento de cristais foi registada. Após cinco dias, uma condição única de cada tabuleiro que foi encontrada para apoiar o crescimento de material cristalino foi seleccionado e usado para a geração de imagens de semente. rastreio Rmms foi realizada como para o rastreio não MGR, com a excepção de que foram usadas 2,5 ul sentados gotas compreendendo 1 ml de solução de proteína, 1 ul de solução de reserva e 0,5 ul de estoque de sementes. Todos os seis bandejas Rmms foram transferidos para uma sala de temperatura constante a 18 ° C e inspeccionados diariamente usando um microscópio binocular. Após cinco dias, as bandejas Rmms de ambas as proteínas foram inspeccionadas e o número de gotas com cristais foi registada. Figura 1 resume os resultados desta experiência e fornece uma análise quantitativa. Para HEWL um 4 a 10 vezes maioraumento da taxa de sucesso de cristalização, em comparação com as bandejas não semeadas, foi observada quando Rmms foi aplicado a esta proteína. Notadamente para BLC foi encontrada apenas uma única condição na tela de Morpheus para produzir cristais, em comparação com 55 condições identificadas após o uso de MGR. Além disso, houve um aumento de 3 e 7 vezes na taxa de sucesso em BLC cristalização usando JCSG e telas PACT respectivamente. Em todos os casos e independentemente da tela de cristalização MGR utilizados triagem resultou em um número significativamente maior do que o total de cristais de triagem não-MGR. A repetição dos experimentos de triagem MGR descrito usando uma semente diluído 1:100 rendeu menos marcas do que quando o estoque de sementes não diluído foi utilizado, reforçando a exigência de utilização de estoques não diluídas ao realizar a rodada inicial de experimentos MGR. Para ambas as proteínas houve pouca variação aparente na qualidade de cristal, conforme avaliado pelo tamanho, morfologia, e birrefringência. Avaliação comparativa do difqualidade fração dos cristais gerados usando MGR ao contrário de métodos de rastreio convencionais vai além do escopo deste estudo, no entanto, a análise de difração preliminar inicial usando radiação síncrotron de um subconjunto de cristais de ambas as proteínas isoladas do MGR e telas não-MGR indicado lá para haver pouca variação na qualidade de difração, como julgado com base no limite de resolução e perfil local.
(B) Exemplo de optimização do número de cristais por gota
Técnicas microdispersão regularmente dar uma chuva de pequenos cristais. Por conseguinte, é muitas vezes necessária para diluir o material de semente para reduzir o nível de nucleação. Além disso, pode às vezes ser impossível crescer cristais em condições de vida que foram encontrados pelo MGR quando a semeadura não é utilizado 5. É nesses casos que muitas vezes é útil usar microdispersão "clássica", onde algumas gotas são criados utilizando a mesma solução reservatório com diferentes diluições de um estoque de sementes. Este cum ser feito de forma sistemática para várias condições de chumbo numa única placa, utilizando uma abordagem de "combinatória" (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, comunicação pessoal), como mostrado na Figura 2. Aqui uma ou mais soluções de golpes (H1 - H6) são dispensadas para as colunas de uma placa de cristalização, enquanto que uma diluição diferente de um stock de sementes (S1 - S9) é adicionado às gotas de cada linha. Portanto, cada combinação de solução de sucesso e estoque de sementes diluído são testados em uma única placa, eo nível adequado de diluição e de todas as tendências atuais podem ser facilmente identificados.
Nós aplicamos esta abordagem microdispersão combinatória para três proteínas modelo, xilanase, taumatina e termolisina. Cada proteína foi testada com uma condição de cristalização, que tinha sido mostrado anteriormente para dar cristais não na ausência de sementeira, de forma consistente, mas deu origem a cristais, quando foi usada a semeadura. As condições de cristalização utilizados para a xilanase, taumatina e thermolysin estão listados na Tabela 2. Foram estabelecidas quatro a seis condições para cada proteína com duas ou três repetições de cada combinação estoque de proteína / condição / seed, como mostrado. Drops composta 0,3 proteína mL, 0,29 mL solução reservatório, e 10 estoque de sementes nl. Todos os tabuleiros foram estabelecidos utilizando um robot de manuseamento de cristalização líquido. Estoque de semente pura e seis respectivas diluições foram criadas para cada proteína. Outros detalhes experimentais foram relatados anteriormente 12. O número médio de cristais obtidos por gota é traçada contra a diluição do stock de sementes na Figura 3. Estes dados mostram que o número de cristais segue uma relação aproximadamente linear com o número de sementes adicionados. Para as três proteínas testadas, 1:10 até 1:10 -3 -6 diluições foram necessárias para se obter cristais de 1-10 por gota.
Tabela 1. Lista de materiais.
| Cristalização cocktail | Número de gotas estabelecidos por bandeja | |
| Xilanase (36 mg / ml) | 2 M de sulfato de amónio, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Xilanase (36 mg / ml) | 30% (w / v) de PEG 4000, 0,2 M de acetato de sódio, 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Xilanase (36 mg / ml) | Formato de sódio 4 M | 3 |
| Xilanase (36 mg / ml) | 3,5 M de sulfato de amónio, cloreto de sódio 250 mM, de sódio 50 mM / fosfato de potássio pH 7,5 | 3 |
| Xilanase (36 mg / ml) | 1.5 M de fosfato de potássio pH 7,0 | 3 |
| Taumatina (30 mg / ml) | 30% (w / v) de PEG 4000, 0,2 M de acetato de amónio, 0,1 M de citrato de sódio pH 5,6 | 2 |
| 20% (w / v) de PEG 4000, 20% (v / v), 2-propanol, 0,1 M citrato de sódio pH 5,6 | 2 | |
| Taumatina (30 mg / ml) | 30 (% w / v) de PEG 8000, 0,2 M de sulfato de amónio, 0,1 M de cacodilato de sódio pH 6,5 | 2 |
| Taumatina (30 mg / ml) | 20 (% w / v) de PEG 8000, 0,2 M de acetato de magnésio, 0,1 M de cacodilato de sódio pH 6,5 | 2 |
| Taumatina (30 mg / ml) | 2 M de sulfato de amónio, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5 | 2 |
| Taumatina (30 mg / ml) | Sulfato de lítio 1,5 M, 100 mM de HEPES pH 7,5 | 2 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 20.0% (w / v) de PEG 6000, 100 mM de ácido cítrico a pH 5,0 | 3 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 1,26 M de sulfato de amónio, 200 mM de sulfato de lítio, 100 mM Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 10% (v / v)MPD, 100 mM pH 9,0 bicina | 3 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 800 mM pH ácido succínico 7,0 | 3 |
Tabela 2. As soluções de proteína e as condições de cristalização utilizadas na experiência microdispersão combinatória.
Figura 1. (A) Comparação de MGR e não-MGR experimentos de triagem cristalização. Condições de apoio crescimento de cristais estão em verde, as condições não suportam o crescimento de cristais estão em cinza. Condições selecionados para uso na geração de estoque de sementes são na cor rosa. Telas de cristalização são rotuladas como se segue (i) de ovos de galinha lisozima, JCSG, não MGR, (ii) de lisozima de ovo de galinha branca, JCSG, MGR, (iii) de lisozima de ovo de galinha branca, pacto, não MGR, (iv) de galinha eg g lisozima branco, PACT, MGR, (v) galinha lisozima de ovo branco, Morpheus, não-MGR, (vi) galinha lisozima de ovo branco, Morpheus, MGR, (vii) fígado bovino catalase, JCSG, não-MGR, (viii) fígado bovino catalase, JCSG, MGR, (ix) fígado bovino catalase, PACT, não-MGR, (x) fígado bovino catalase, PACT, MGR, (xi) fígado bovino catalase, Morpheus, não-MGR, (xii) fígado bovino catalase, Morpheus, MGR. (B) Análise comparativa de cristalização taxa de sucesso usando MGR e não-MGR triagem cristalização. Para os não-MGR triagem do número de condições de cristalização identificados como apoiar o crescimento de cristais de qualquer HEWL ou BLC são mostrados em azul, por MGR rastreio do número de condições de cristalização identificados como apoiar o crescimento de cristais de qualquer HEWL ou BLC são mostrados em vermelho. Os dados são baseados em uma inspeção de bandejas de cristalização 5 dias após estabelecimento.
2.jpg "/>
Figura 2. Distribuição das condições de cristalização e diluído suspensões estoque de sementes para uma única proteína em um exemplo combinatória experimento microdispersão. Colunas em destaque H1-H6 conter diferentes condições de cristalização de apoio ao crescimento de cristais de proteínas-alvo. Destaque linhas S1-S7 conter diferentes diluições de uma suspensão estoque de sementes proteína alvo.
Figura 3. Correlação entre diluição estoque de sementes e número médio de cristais obtidos por gota em um experimento microdispersão combinatória. As três proteínas utilizadas foram xilanase, taumatina e termolisina. As gotas foram estabelecidas em uma placa de 96 poços MRC utilizando um robot de manuseamento de líquido, e compreendem de 0,3 mL de proteína, 0,29 mL solução reservatório, e 10 nl de si frescoed estoque. Os dados apresentados são baseados na inspeção das bandejas de cristalização 5 dias após estabelecimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste artigo descrevemos um método geral para MGR proteína triagem cristalização. Nós demonstramos usando duas proteínas de teste uma melhoria significativa na taxa de sucesso de cristalização utilizando este método. Análise de difração usando radiação síncrotron de um subconjunto de cristais gerados usando MGR e métodos não-MGR revelou pouca variação de qualidade de difração entre cristais crescidos usando qualquer método, embora autores anteriores relataram que os cristais de boa qualidade são mais propensos a crescer em experimentos MGR 11, 13. HEWL e BLC pode ter dado resultados atípicos, porque eles são extraordinariamente fácil de se cristalizar. Também ilustram a importância de optimizar a concentração de stocks de sementes de cristal usados nas experiências MGR, e demonstrar como esta pode ser ajustada por diluição para assegurar que um número óptimo de cristais de qualidade de difracção são produzidos.
MGR é um simples alto rendimento, altamentemétodo escalável que pode ser utilizado para complementar métodos de rastreio tradicionais. Experimentos podem ser configurados manualmente ou por robô, em 96 poços ou bandejas de 24 poços, e na suspensão ou sentado formatos soltar. A principal limitação do MGR é que é dependente da obtenção de alguma forma de material cristalino de uma proteína alvo (ou de uma proteína homóloga), a fim de criar um stock de sementes na primeira instância. Note-se no entanto, que o material cristalino de alta qualidade não é necessário; os autores de fato têm usado com sucesso microcristais e precipitado amorfo para fazer estoques de sementes. A utilização de rastreio Rmms não está restrito ao crescimento de cristais de proteínas nativas. Por exemplo, MGR é bem adequado para crescimento de cristais de selenomethione ou selenocisteína variantes substituídas. Em tais casos, os cristais de proteína nativa pode ser utilizada para fazer o estoque de sementes. Embora os protocolos de nucleação de cristais alternativo foram documentados 1,4, nenhuns são tão aplicáveis ao ar tão grandeange de proteínas como MGR.
Após MGR uma abordagem microdispersão combinatória pode ser usado para otimizar o nível de semeadura para a produção de cristais de coleta de dados. Isto é particularmente útil para experimentos ligante de imersão, onde são frequentemente necessários um grande número de cristais. Usando esta abordagem uma tela de cristalização inteira pode ser rapidamente estabelecida usando microdispersão em combinação com um stock de sementes diluída, com cada cavidade produzindo um relativamente pequeno número de cristais.
Em conclusão nós incentivamos qualquer pessoa envolvida em cristalização de macromoléculas para fazer MGR uma parte de sua rotina de trabalho em todos os casos onde os cristais difração não são obtidos diretamente de suas telas iniciais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo BBSRC (BB/1006478/1). PRR é o destinatário de uma Bolsa de Investigação da Universidade Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T.
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
