Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

Published: August 31, 2013 doi: 10.3791/50548
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2Douglas Instruments

Summary

نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ.

Abstract

فحص عشوائي microseed مصفوفة (rMMS) هو أسلوب بلورة البروتين في البلورات التي تضاف إلى البذور شاشات عشوائي. عن طريق زيادة احتمال أن بلورات سوف تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من مرحلة رسم تخطيطي بروتين، وغالبا ما يتم الحصول عليها يؤدي تبلور اضافية، ويمكن زيادة جودة البلورات المنتجة، ويتم توفير امدادات جيدة من بلورات لتجارب جمع البيانات وتمرغ. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS التي يمكن تطبيقها إما الجلوس أو قطرة قطرة شنقا التجارب نشر بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 96 جيدا أو شكل علبة 24 أيضا.

Introduction

من التطبيق الأولي من خلال Perutz، Kendrew وزملاء العمل في تحديد هياكل الهيموجلوبين والميوجلوبين، إلى إنتاجية عالية خطوط الأنابيب الحديثة الآلي للاتحادات الجينوميات الهيكلي، والجزيئات البلورات بالأشعة السينية قد أتاحت لنا لمحة هيكلية غير مسبوقة في عالم البروتين . لا تزال هذه التقنية المنهج التجريبي الأكثر انطباقا على نطاق واسع أن يسمح للرؤية مباشرة من بنية البروتين في الذرية، أو بالقرب القرار الذري (أي في حدود 1-3). ومن الشروط الأساسية لحيود الأشعة السينية ليتم تطبيقها على البروتين هو أنه يجب أولا أن تبلور، وهذا هو مرحلة من مراحل العملية التي لا تزال أعظم خطوة الحد من معدل واحد في تحديد هيكل بالطرق الحيود 1 و 2. على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا لعملية بلورة البروتين، وتحسينات كبيرة في نوعية وتوافر شاشات التبلور،الصواني، والتكنولوجيات ذات الصلة، فإنه لا يزال من المستحيل التنبؤ بشكل موثوق من احتمال نجاح تبلور 3. ويمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية لتقييم ما إذا كان البروتين من الفائدة يعرض خصائص مواتية لالتنوي الكريستال والنمو، أي هو مطوية جيدا، متجانسة، monodisperse، وما إلى ذلك، ولكن هذه الأفكار في أي وسيلة توفر مؤشرا نهائيا التبلور الميل.

منذ فترة طويلة البذر يزعم أن يكون وسيلة ناجعة لتحسين عدد وحجم ونوعية بلورات القائمة أو المواد البلورية 4-7. ويستند هذا النهج على أساس أن شرط أن يدعم الكريستال التنوي قد لا تكون الأمثل لنمو البلورات اللاحقة والعكس بالعكس. عن طريق نقل المواد الأنوية من حالة إلى أخرى، يمكن للمرء أن محاولة فصل هذه العمليات بشكل فعال، وبالتالي إعطاء الوصول إلى الجديد، كما تبلور الفضاء غير مستكشفة بعد،ونتيجة لزيادة معدل النجاح العام من تجربة الفرز. وقد تم توثيق طرق أنشئت ل(ط) macroseeding، ونقل من بلورة واحدة في مجملها من شرط واحد إلى 8 آخر، (ب) بذر متتالية، ونقل المواد الأنوية، التي تم الحصول عليها بشكل عام من تطبيق الضغط باستخدام الاتجاه على سبيل المثال الخط الطولي القط على سطح بلورة القائمة، تليها مرور لاحقة من الخط الطولي من خلال انخفاض تبلور الجديدة 9، و (ج) "الكلاسيكية" microseeding، ونقل الكريستال "بذور"، التي تم إنشاؤها بواسطة الحصاد سحق بلورات (أو البلورية المواد)، في ظروف مماثلة لتلك التي أسفرت عن بذور 10. وخاصة كل ثلاثة من هذه الأساليب هي مضيعة للوقت وسوء تحجيم، وبالتأكيد بالمقارنة مع ما يمكن تحقيقه مع الحديث مناولة السائل الروبوتات التبلور. وقد ساهمت هذه العوامل، على مستوى بعض على الأقل، إلى الاعتقاد بأن البذورجي هو طريقة في أن يزوره فقط عندما فشلت المقاربات الأخرى لتؤتي ثمارها.

مصفوفة عشوائية microseeding (rMMS) هو الابتكار المنهجي الأخيرة الذي يجمع بين فوائد microseeding التقليدية مع تلك الفحص إنتاجية عالية وقابلية 11-13. يعتمد هذا النهج على توليد مخزون البذور، والمنتجة من المواد البلورية الأنوية، والتي يمكن aliquoted في / على كل sub-well/coverslip ضمن معيار 96-screen حالة التبلور. هذا الأسلوب ينطبق على كل من يجلس أو شنقا التجارب نشر انخفاض بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 24 جيدا أو شكل علبة 96 جيدا. وقد ثبت بالتجربة rMMS إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح التبلور، وإنتاج بلورات من قدر أكبر من الجودة والكمية حيود 11، 13، 14، ويمثل أداة مبتكرة في ترسانة البلورات 'النهج في سngoing الجهد نحو النجاح التبلور. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS وتوفير بيانات عينة توضح فعالية هذه التقنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاعتبارات الاستراتيجية

  1. واختيار بلورات البذور المستخدمة في التجارب microseeding تختلف اعتمادا على الهدف من التجربة. في بداية المشروع فإنه من المفيد أن تجد العديد من الفعالية تبلور التي يمكن أن توفر نقطة انطلاق بديلة لالكريستال الأمثل. rMMS يقلل كثيرا من الحاجة إلى وضوح الشمس الأمثل لبلورات ذات نوعية جيدة من المرجح أن تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من المخطط المرحلة، أي في المنطقة حيث التالية اضطراب أو التنوي يعود النظام إلى التوازن. لذا نقترح استخدام rMMS بشكل روتيني في أقرب وقت يتم الحصول على بلورات الأولى (أو، بدقة أكبر، في أقرب وقت البلورات الأولى تتوقف عن النمو).
  2. للجولة الأولي من rMMS، ينبغي بذل مخزون البذور مع قدر المواد البلورية ممكن. إذا بئر واحدة فقط هي المتاحة التي تحتوي على بلورات، أو إذا كانت بلورات صغيرة، قد يكون من المفيد لاقامة التكرار متعددة منضرب الأصلي (بدون بذر) لزيادة المعروض من بلورات. إذا، ومع ذلك، يتم الحصول على العديد من مشاهدات مختلفة، بلورات البذور يمكن أن تحصد من عدة شروط ومختلطة معا.
  3. لتجنب مرحلة الانفصال، بلورات نمت في ظروف عالية من الملح وينبغي أن تحصد بشكل منفصل من بلورات نمت في ظروف عالية PEG. إذا يتم خلط بلورات من عدة آبار، وينبغي اختيار الحل الخزان الذي هو أقل احتمالا لإعطاء بلورات الملح للتعليق البذور. على سبيل المثال، ينبغي تجنب التركيزات العالية من الفوسفات والكبريتات والكالسيوم والمغنيسيوم.
  4. في وقت لاحق في مشروع قد يكون من المهم أن نبحث عن بلورات مع الخلايا وحدة مختلفة من أجل تحسين الحيود، وتجنب بلورات توأمة، والحصول على البلورات التي هي مناسبة للبروابط ملزمة. في هذه المرحلة فقط بلورات أكثر ملائمة (مثل تلك التي حيد الضوء أفضل) ينبغي أن تستخدم لجعل مخزون البذور. ويلزم الجولات المتكررة في بعض الأحيان من microseeding، حيث لا يوجد سوى "أفضل"وتستخدم بلورات لجعل مخزون البذور لجولة لاحقة. إذا كان ذلك ممكنا، و" "مرسب محايدة مثل PEG 3000 ينبغي أن تستخدم لتعليق بلورات البذور في تشجيع الاتصالات الكريستال الرواية وبلورة المجمعات التي قد تكون غير مستقرة في ارتفاع الملح حلول 12.
  5. تجارب microseeding الكلاسيكية، حيث يتم استخدام حالة تبلور واحد، وغالبا ما تكون مفيدة عقب تحديد حالة واعدة وخلال التحسين اللاحقة. فمن الضروري في كثير من الأحيان لتخفيف مخزون البذور من أجل الحصول على العدد المطلوب من بلورات من كل قطرة ماء. A "اندماجي" التجربة microseeding (حيث يتم إضافة سلسلة من مخزونات البذور لزيادة التخفيف إلى حالة تبلور) هو وسيلة سريعة للعثور على التخفيف الأمثل للمخزون البذور. يوصف هذا النهج أدناه.

2. إعداد مخزون البذور

  1. جعل التحقيق الزجاج مقربة من ماصة باستير الزجاج باستخدام لهب بنسن.
    1. تسخين ماصة بالقرب من منتصف حتى تصبح لينة، ثم إزالته بسرعة من اللهب واستدراجه للخروج عن طريق سحب وبصرف النظر عن الغايات. تهدف إلى سحب الزجاج لتصل إلى 0.25 ملم قطر أدناه.
    2. كسر الزجاج عند نقطة حيث حوالي 0.25 ملم لفترة وجيزة يغرق نهاية اقتحام اللهب. كرر هذا حتى نصف الكرة من الزجاج يبلغ قطرها ~ 0.75 مم يتكون في النهاية. هذا التحقيق هو مفيد لسحق المواد البلورية كما هو بحجم مناسب لضرب الأجسام الصلبة على نطاق و،01-1،0 مم وأنها لا تضر سطح البلاستيك من بلورة علبة الفرعية جيدا أو ساترة. تحقيقات الأكبر (~ 1.0 ملم) قد سحق بلورات صغيرة أكثر فعالية لأن محاصرون بلورات بين الزجاج والبلاستيك.
  2. وضع 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة على الجليد.
  3. فحص علبة بلورة مقررة سلفا باستخدام مجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال وتحديد أب واحد أو أكثرتكبده الآبار من علبة من خلالها حصاد المواد البلورية لتوليد مخزون البذور. أي مواد يمكن استخدامها بما في ذلك إبر رفيعة، spherulites، microcrystals وغير النظامية، وبلورات سيئة. ينبغي بذل مخزون البذور في أقرب وقت ممكن بعد وقف البلورات المتنامية، كما من المرجح أن تكون مرتبطة جزئيا عبر المواد القديمة، وبالتالي تقليل مدى ملاءمتها للاستخدام في التجارب البذر. إذا أي شك موجود حول ما إذا كانت المواد البلورية إلى أن تحصد هو الملح أو البروتين البئر يمكن تصور باستخدام المجهر مضان الأشعة فوق البنفسجية أو نظام التصوير قبل الافتتاح، أو ما قد يتعرضون للمواد البلورية لفي الموقع تحليل حيود الأشعة السينية في الدرج. عند استخدام بلورات السابق البروتين النهج سوف يتألق تحت أشعة فوق البنفسجية، وسوف تظهر بلورات الملح عديم اللون.
  4. فتح علبة بلورة اختيارها بشكل جيد. لمدة 96 جيدا يجلس الصواني انخفاض قطع طريق ورقة ختم البلاستيك العلوي حول اختيارها بشكل جيد باليودنانوغرام شفرة المشرط. لمدة 24 جيدا صواني معلقة قطرة إزالة ساترة باستخدام زوج من ملاقط. عكس ساترة ووضعه على سطح نظيف مستقرة. إزالة 50 ميكرولتر من الحل الخزان ونقل هذا السائل إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة ضمان أن يبقى أنبوب على الجليد طوال الوقت.
  5. بدقة سحق البلورات في subwell (96 علبة جيدا) أو ساترة (24 علبة جيدا) يسقط، وذلك باستخدام مسبار الزجاج أعدت في القسم 2.1، وعرض النتائج تحت المجهر. بلورات صغيرة قد يستغرق عدة دقائق لسحق تماما. هذه الخطوة يسمح للمجرب للتأكد من أن البلورات هي سهلة لسحق وبالتالي فهي ليست مرتبطة عبر، وأيضا أنها ليست بلورات الملح. بلورات الملح إنتاج بنقرة والمميزة التي يمكن يسمع ويرى عندما يتم سحقها. إذا كانت البلورات هي صعبة وصعبة لسحق محاولة للحصول على مواد أعذب واستخدامها.
  6. إزالة 5 ميكرولتر من الحل الخزان من بذور حبة أنبوب وراملحول ليعادل البئر الفرعية (يجلس التجربة قطرة)، أو ساترة (معلقة تجربة قطرة) التي تحتوي على المواد البلورية للحصاد. ماصة هذا الأمر السائل وهبوطا 5-6 مرات ل resuspend أكبر قدر من البئر الفرعية أو ساترة محتويات ممكن. العودة للتعليق على البذور أنبوب حبة وكرر هذه الخطوة مرتين أكثر من ذلك، ضمان قدر المواد البلورية يتم حصاد وقت ممكن.
  7. دوامة حبة البذور لمدة دقيقتين، ووقف كل 30 ثانية لتبريد أنبوب على الجليد.
  8. جعل سلسلة التخفيف، وتمييع مخزون البذور في محلول الخزان من قبل عامل من 4-10 في كل مرحلة. عادة، وسيتم الحصول على عدد كبير جدا من بلورات عند استخدام مخزون البذور غير مخفف، وذلك باستخدام مخزونات البذور مخففة للسيطرة على عدد من بلورات لكل بئر. في الجولة الأولى من rMMS، فمن المهم عدم تمييع الحل مخزون البذور، لأن كلما زاد تركيز البذور سيتم الحصول على المزيد من الزيارات التبلور.
  9. إذا لم يكن ليتم استخدامها immediately، ونقل البذور التعليق الأسهم والأوراق المالية البذور المخفف إلى -20 ° C، أو الفريزر -80 درجة مئوية للتخزين. لمنع تكرار تجميد أذاب دورات، والذي قد يقلل من فعالية مخزون البذور، وتخزين هذه المواد في مأخوذة الحجم الصغير، أي 10-20 ميكرولتر. مرة واحدة المجمدة، ويجوز إبقاء مخزون البذور إلى أجل غير مسمى لحين الحاجة إليها.

3. إنشاء البلورة الصواني

  1. اعتمادا على مدى توافر المرافق وتبلور أفضليات المجرب، rMMS بلورة الفرز يمكن القيام بها باستخدام إما الصواني 24 أيضا توظيف شنقا طريقة الانتشار قطرة بخار، أو الصواني 96 جيدا باستخدام طريقة الجلوس قطرة بخار نشرها. يمكن تأسيس الصواني تبلور لrMMS إما باليد، وذلك باستخدام التعامل مع موزع الروبوتية السائل، أو مزيج من الاثنين.
  2. وهناك تجربة نموذجية rMMS إعداد باليد تشمل، 1.0 ميكرولتر حل البروتين، 1.0 ميكرولتر حالة التبلور، و0.5 ميكرولتر مخزون البذور. وهناك تجربة نموذجية إعداد باستخدام الروبوت التبلور تشمل حل البروتين 0.3 ميكرولتر و 0.2 ميكرولتر حالة التبلور، و 0.1 ميكرولتر مخزون البذور.
  3. لإجراء الفحص في 24 rMMS جيدا شنقا الصواني قطرة، أولا، وذلك باستخدام ماصة دليل، ونقل 300 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في 10 مل شكل أنبوب واحد في كل بئر من 4 × 24 جيدا تبلور pregreased الصواني.
    1. نقل 1 ميكرولتر من كل شرط تبلور من كل 300 ميكرولتر الخزان على سطح ساترة البلاستيك المقابلة التي تم إزالتها على حد سواء الأمامية والخلفية شرائط دعم وقائي.
    2. إلى ميكرولتر 1 من كل شرط تبلور إضافة 1 ميكرولتر من محلول البروتين تليها 0.5 ميكرولتر من مخزون البذور وضوح الشمس. عكس كل ساترة بحيث قطرة من السائل لأسفل والموقف أعلاه المناسبة أيضا.
    3. الصحافة أسفل على ساترة، ضغط sealiنانوغرام الشحوم وتشكيل ختم آمنة. مرة واحدة يتم وضع كل قطرات 96، ينبغي نقل علبة الى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة، عادة في حدود 4-18 درجة مئوية لمدة التخزين.
  4. لإجراء فحص rMMS في الجلوس 96 جيدا صواني قطرة أولا نقل 20-50 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في شكل عميق كتلة جيدا في كل المقابلة بشكل جيد من الدرج التبلور. هذه الخطوة نقل يمكن أداؤها باستخدام الروبوت التبلور، أو عن طريق التحويل اليدوي باستخدام ماصة 8 قنوات.
    1. نقل الخزان والبروتين والبذور الحلول الأسهم إلى قطرات من جهة أو مع الروبوت باستخدام وحدات التخزين بالتفصيل في 3.1. بعض الروبوتات التبلور المتاحة تجاريا عدم الاتصال الاستغناء، وأداء البذور نقل المخزون باستخدام مثل هذا النظام قد يؤدي إلى انسداد الأنابيب الاستغناء نصائح او المرتبطة بها. ترتيب صرفها هو متغير: بعض الروبوتات الاستغناء عن الحلول في وقت واحد. إذاهذا غير ممكن، الاستغناء البروتين أولا، ثم الخزان، ثم البذور الأسهم.
    2. إذا كان الاتصال الاستغناء الروبوت ليس نقل متوفرة بذور باستخدام حقنة الزجاج انخفاض حجم مزودة إبرة حادة. شطف إبرة بتمريرها من خلال حل الخزان ثم الاستغناء عن مخزون البذور في كل قطرة.
    3. ختم صينية باستخدام ورقة ختم شفافة ونقل إلى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة للتخزين.

4. التفتيش على بلورة الصواني

  1. تصور كل التجارب تبلور باستخدام المجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال. السابق يتيح عموما تحكم المستخدم أكبر على عمق الرؤية ودرجة التكبير من هذا الأخير، ولكن هو أكثر استهلاكا للوقت.
  2. تفتيش كل sub-well/coverslip في تسلسل وتسجيل أية أدلة على تشكيل الكريستال. يجب فحص التجارب مرة واحدة كل 24 ساعة لمدة 5 أيام عقب إنشائها ون بعد ذلك مرة واحدة كل 7 أيام لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  3. غالبا ما يطلب من دورات متعددة من قبل rMMS يتم إنتاج بلورات الأمثل جودة الحيود.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

(A) مثال لتجربة rMMS

للتدليل على فعالية rMMS فحص طبقنا هذا الأسلوب لبلورة الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض (HEWL) والكبد البقري الكاتلاز (BLC). كل من هذه الأنزيمات هي crystallizable بارز وهيكليا تتميز كذلك الأهداف 15 و 16. على هذا النحو على حد سواء تقديم اختبار المواضيع التي ممتازة لتوضيح تعزيز بلورة نسبة النجاح يمكن تحقيقه مع rMMS. أنشئت التجارب تبلور في 96 جيدا يجلس شكل علبة قطرة باستخدام الروبوتات التعامل مع السائل. تم إنتاج حلول من HEWL والبنك اللبناني للتجارة عن طريق إذابة مساحيق مجفف بالتجميد من كل في 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5، لتركيزات النهائي من 100 ملغ / مل و 20 ملغ / مل على التوالي. لكل من البروتين واستخدمت ثلاث شاشات تبلور 96 حالة؛ JCSG، باكت ومورفيوس. تم إجراء فحص دون تبلور microseeding باستخدام وحدات التخزين خزان من 50 ميكرولتر، و 2 ميكرولتريجلس قطرات تضم 1 ميكرولتر من محلول البروتين و 1 ميكرولتر من الحل الخزان. تم تخزين الصواني ستة في غرفة درجة حرارة ثابتة عند 18 درجة مئوية وتفقد يوميا باستخدام مجهر مجهر. تم تسجيل أي دليل على النمو وضوح الشمس. بعد خمسة أيام تم اختيار حالة واحدة من كل علبة التي تم العثور عليها لدعم النمو من المواد البلورية واستخدامها لتوليد مخزون البذور. تم إجراء الفحص كما rMMS لغير rMMS الفرز، باستثناء أن 2.5 ميكرولتر يجلس قطرات تضم 1 ميكرولتر من محلول البروتين، 1 ميكرولتر من الحل الخزان و 0.5 ميكرولتر من مخزون البذور كانت تستخدم. تم نقل جميع ستة صواني rMMS إلى غرفة درجة حرارة ثابتة عند 18 درجة مئوية وتفقد يوميا باستخدام مجهر مجهر. بعد خمسة أيام تم تفتيش الأدراج rMMS كل من البروتينات وتم تسجيل عدد من قطرات مع بلورات. يلخص الشكل 1 النتائج من هذه التجربة، ويقدم التحليل الكمي. لHEWL من 4 إلى 10 أضعافزيادة في نسبة نجاح تبلور، بالمقارنة مع الصواني غير المصنفة، لوحظ عند تطبيق rMMS لهذا البروتين. ولا سيما لBLC تم العثور فقط شرط واحد في الشاشة مورفيوس لانتاج بلورات بالمقارنة مع 55 حالات تم التعرف عليها بعد استخدام rMMS. علاوة على ذلك، كان هناك 3 و 7 أضعاف زيادة في معدل النجاح في بلورة BLC باستخدام JCSG وشاشات باكت التوالي. في جميع الحالات وبغض النظر عن الشاشة بلورة أسفرت rMMS تستخدم الفحص لعدد أكبر بكثير من بلورات من غير rMMS الفرز. وصف تكرار التجارب الفرز rMMS باستخدام البذور المخفف 1:100 أسفرت عن إصابات أقل بكثير مما كانت عليه عندما تم استخدام مخزون البذور غير مخفف، وتعزيز متطلبات لاستخدام مخزونات يضعف عند إجراء الجولة الأولى من التجارب rMMS. لكل من البروتينات كان هناك بعض التباين الواضح في جودة وضوح الشمس، كما تقرره الحجم والتشكل، والانكسار. تقييم مقارن للالمتنوعةالجودة جزء من بلورات إنشاؤها باستخدام rMMS بدلا من طرق الفحص التقليدية يتجاوز نطاق هذه الدراسة، ومع ذلك، الأولي تحليل حيود الأولية باستخدام الإشعاع السنكروتروني من مجموعة فرعية من بلورات كل من البروتينات المعزولة من rMMS وشاشات غير rMMS-أشارت إلى هناك يكون اختلاف بسيط في نوعية الحيود، كما يحكم على أساس قرار الحد و ملفه الشخصي الفور.

(ب) مثال لتحقيق الاستفادة المثلى من عدد من بلورات لكل قطرة

تقنيات Microseeding تعطي بانتظام الاستحمام من بلورات صغيرة. وبالتالي فإنه غالبا ما يكون ضروريا لتخفيف مخزون البذور لخفض مستوى التنوي. وعلاوة على ذلك، قد يكون في بعض الأحيان من المستحيل أن تنمو البلورات في ظروف إصابة التي تم العثور عليها من قبل rMMS عندما لا يتم استخدام بذر 5. انها مثل هذه الحالات غالبا ما يكون من المفيد استخدام microseeding "الكلاسيكية"، حيث يتم تعيين عدة قطرات حتى باستخدام نفس الحل الخزان مع التخفيفات مختلفة من مخزون البذور. هذا جعلى أن يتم ذلك بصورة منتظمة لعدة ظروف الرصاص على لوحة واحدة باستخدام نهج "اندماجي" (بول رايشرت، مختبرات ميرك للابحاث والاتصالات الشخصية)، كما هو مبين في الشكل 2. هنا واحد أو أكثر حلول ضرب (H1 - H6) يتم الاستغناء عن الأعمدة في لوحة تبلور، في حين أن التخفيف مختلفة من مخزون البذور (S1 - S9) يضاف إلى قطرات من كل صف. وبالتالي يتم اختبار كل مزيج من محلول ضرب ومخزون البذور المخفف على لوحة واحدة، ويمكن بسهولة تحديد المستوى المناسب للتخفيف وأي الاتجاهات الحالية.

طبقنا هذا النهج microseeding اندماجي إلى ثلاثة بروتينات النموذج، xylanase، thaumatin وthermolysin. تم اختبار كل من البروتين مع حالة تبلور التي سبق أن تبين أن لا تعطي بلورات في غياب البذر، ولكنه باستمرار بلورات عندما كان يستخدم بذر. شروط التبلور تستخدم لxylanase، thaumatin وريتم سرد hermolysin في الجدول 2. تم إنشاء أربعة إلى ستة شروط لكل البروتين مع اثنين أو ثلاثة من كل التكرار البروتين / حالة / البذور مزيج الأسهم كما هو مبين. تتألف قطرات ميكرولتر 0.3 بروتين، 0.29 ميكرولتر حل الخزان، و 10 مخزون البذور NL. وقد أنشئت جميع الصواني باستخدام مناولة السائل بلورة الروبوت. تم وضع مخزون البذور أنيق وستة التخفيفات منها ما يصل لكل البروتين. وقد تم الإبلاغ عن التفاصيل تجريبية أخرى في السابق 12. يتم رسم متوسط ​​عدد البلورات التي تم الحصول عليها من كل قطرة ماء ضد التخفيف من مخزون البذور في الشكل 3. تظهر هذه البيانات أن عدد من بلورات يلي وجود علاقة خطية تقريبا مع عدد من البذور المضافة. للبروتينات ثلاثة اختبارها، كان مطلوبا 01:10 -3 -6 ل01:10 التخفيفات للحصول على بلورات 1-10 من كل قطرة ماء.

الجدول 1. قائمة المواد.

البروتين
تبلور كوكتيل عدد من قطرات أنشئت في علبة
Xylanase (36 ملغ / مل) 2 كبريتات الأمونيوم M، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5 3
Xylanase (36 ملغ / مل) 30٪ (ث / ت) PEG 4000، 0.2 M خلات الصوديوم، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5 3
Xylanase (36 ملغ / مل) 4 M فورمات الصوديوم 3
Xylanase (36 ملغ / مل) 3.5 M سلفات الأمونيوم، 250 ملي كلوريد الصوديوم، والصوديوم 50 ملي / البوتاسيوم الفوسفات ودرجة الحموضة 7.5 3
Xylanase (36 ملغ / مل) 1.5 M البوتاسيوم الفوسفات ودرجة الحموضة 7.0 3
Thaumatin (30 ملغ / مل) 30٪ (ث / ت) PEG 4000، 0.2 M خلات الأمونيوم، 0.1 M الصوديوم سترات درجة الحموضة 5.6 2
20٪ (ث / ت) PEG 4000، 20٪ (V / V) 2 بروبانول، الصوديوم 0.1 M سترات درجة الحموضة 5.6 2
Thaumatin (30 ملغ / مل) 30 (٪ ث / ت) PEG 8000، 0.2 M سلفات الأمونيوم، 0.1 M الصوديوم كاكوديلات درجة الحموضة 6.5 2
Thaumatin (30 ملغ / مل) 20 (٪ ث / ت) PEG 8000، 0.2 M خلات المغنيسيوم، الصوديوم 0.1 M كاكوديلات درجة الحموضة 6.5 2
Thaumatin (30 ملغ / مل) 2 كبريتات الأمونيوم M، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5 2
Thaumatin (30 ملغ / مل) 1.5 M ليثيوم كبريتات، 100 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.5 2
Thermolysin (15 ملغ / مل) 20.0٪ (ث / ت) PEG 6000، 100 ملي حامض الستريك درجة الحموضة 5.0 3
Thermolysin (15 ملغ / مل) 1.26 M سلفات الأمونيوم، كبريتات الليثيوم 200 ملم، و 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5 3
Thermolysin (15 ملغ / مل) 10٪ (V / V)MPD، 100 ملي bicine درجة الحموضة 9.0 3
Thermolysin (15 ملغ / مل) 800 ملي حمض السكسينيك درجة الحموضة 7.0 3

الجدول 2. حلول البروتين وظروف تبلور المستخدمة في التجربة microseeding اندماجي.

الشكل 1
الشكل 1. (A) مقارنة rMMS وغير rMMS-التجارب فحص التبلور. شروط دعم نمو البلورات هي باللون الأخضر، وظروف عدم دعم نمو البلورات في الرمادي. ظروف المحددة للاستخدام في بذور الجيل الأسهم هي باللون الوردي. وصفت شاشات تبلور على النحو التالي (ط) الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض، JCSG، غير rMMS، (ب) بيضة الدجاجة الليزوزيم الأبيض، JCSG، rMMS، (ج) الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض، باكت، غير rMMS، (د) الدجاجة على سبيل المثال ز الليزوزيم الأبيض، باكت، rMMS، (ت) الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض، مورفيوس، غير rMMS، (السادس) الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض، مورفيوس، rMMS، (السابع) الكبد البقري الكاتلاز، JCSG، غير rMMS، (الثامن) الكبد البقري الكاتلاز، JCSG، rMMS، (التاسع) الكبد البقري الكاتلاز، باكت، غير rMMS، (خ) الكبد البقري الكاتلاز، باكت، rMMS، (الحادي عشر) الكبد البقري الكاتلاز، مورفيوس، غير rMMS، (الثاني عشر) الكبد البقري الكاتلاز، مورفيوس، rMMS. (B) تحليل مقارن لبلورة نسبة النجاح باستخدام rMMS وغير rMMS-تبلور الفرز. وترد لعدم rMMS الفرز على عدد من الشروط التي تم تحديدها كما تبلور دعم النمو الكريستال إما HEWL أو BLC باللون الأزرق، لتظهر rMMS فحص عدد من الشروط التي تم تحديدها كما تبلور دعم النمو الكريستال إما HEWL أو BLC باللون الأحمر. وتستند البيانات على التفتيش الصواني بلورة إنشاء 5 أيام آخر.

2.JPG "/>
الشكل 2. توزيع ظروف التبلور والمخفف تعليق مخزون البذور لبروتين واحد في المثال التجربة microseeding اندماجي. أعمدة الضوء H1-H6 تحتوي على ظروف مختلفة تبلور دعم نمو البلورات البروتين الهدف. الصفوف أبرز S1-S7 تحتوي على التخفيفات مختلفة من البروتين المستهدف لسهم البذور التعليق.

الرقم 3
الرقم 3. العلاقة بين تخفيف مخزون البذور ومتوسط ​​عدد البلورات التي تم الحصول عليها من كل قطرة ماء في تجربة microseeding اندماجي. كانت البروتينات الثلاثة المستخدمة xylanase، thaumatin وthermolysin. أنشئت قطرات في لوحة 96 جيدا MRC باستخدام الروبوت التعامل مع السائل، وتتكون من البروتين 0.3 ميكرولتر، 0.29 ميكرولتر حل الخزان، و 10 NL من حد ذاتها جديدةإد الأسهم. تستند البيانات الواردة في التفتيش على الصواني بلورة إنشاء 5 أيام آخر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة التي وصفناها طريقة عامة لrMMS بلورة البروتين الفرز. لقد أثبتنا باستخدام اثنين من البروتينات اختبار بزيادة كبيرة في معدل نجاح تبلور باستخدام هذا الأسلوب. تحليل حيود باستخدام الإشعاع السنكروتروني من مجموعة فرعية من بلورات إنشاؤها باستخدام rMMS وأساليب غير rMMS-كشفت اختلاف بسيط في نوعية حيود بين بلورات نمت باستخدام إما الأسلوب، على الرغم من أن الكتاب السابق قد ذكرت أن بلورات ذات نوعية جيدة من المرجح أن تنمو في التجارب rMMS 11، 13. HEWL وBLC قد أعطت نتائج شاذة لأنها سهلة غير عادي لبلورة. نحن أيضا توضيح أهمية الاستفادة المثلى من تركيز مخزونات البذور الكريستال المستخدمة في التجارب rMMS، وشرح كيفية هذا يمكن تعديلها عن طريق تخفيف لضمان أن العدد الأمثل من بلورات ذات جودة حيود يتم إنتاجها.

rMMS هو بسيط، وإنتاجية عالية، عاليةطريقة تحجيم التي يمكن استخدامها لاستكمال طرق الفحص التقليدية. يمكن تعيين ما يصل التجارب باليد أو بواسطة الروبوت، في 96 جيدا أو الصواني 24 أيضا، وفي شنقا أو الجلوس تنسيقات قطرة. فإن القيود الرئيسية من rMMS هو أنه يعتمد على الحصول على بعض المواد البلورية شكل من بروتين الهدف (أو من البروتين مثلي) من أجل توليد مخزون البذور في المقام الأول. وتجدر الإشارة إلى أنه مع ذلك، أنه ليست هناك حاجة المواد البلورية عالية الجودة، بل المؤلفين قد استخدمت بنجاح microcrystals وراسب غير متبلور لجعل مخزون البذور. لا يقتصر استخدام rMMS فحص لنمو بلورات من البروتينات الأصلية. على سبيل المثال، rMMS هي مناسبة تماما لبلورات متزايد من selenomethione أو سيلينسيستين المتغيرات استبداله. في مثل هذه الحالات، بلورات من البروتين الأصلي يمكن استخدامها لجعل مخزون البذور. على الرغم من وضوح الشمس البروتوكولات البديلة التنوي وقد تم توثيق 1،4، أي قابلة للتطبيق لع اسعة كماأنج من البروتينات كما rMMS.

بعد rMMS نهج اندماجي microseeding يمكن استخدامها لتحسين مستوى البذر من أجل إنتاج بلورات لجمع البيانات. وهذا مفيد بشكل خاص للتجارب يجند تمرغ حيث غالبا ما يطلب عدد كبير من البلورات. باستخدام هذا النهج على شاشة بلورة بأكمله يمكن أن تنشأ بسرعة باستخدام microseeding في تركيبة مع مخزون البذور الواحد، مع كل بئر مما أسفر عن عدد صغير نسبيا من بلورات.

في الختام نحن نشجع أي شخص يشارك في بلورة الجزيئات لجعل rMMS جزءا من روتين حياتهم سير العمل في جميع الحالات التي لا يتم الحصول على بلورات الانعراج مباشرة من شاشاتهم الأولي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من BBSRC (BB/1006478/1). PRR هو المستفيد من زمالة أبحاث جامعة الجمعية الملكية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MRC 96 well crystallization trays Molecular Dimensions Ltd MD11-00-100 Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets Molecular Dimensions Ltd MD6-01S
Hen egg white lyzozyme Sigma-Aldrich L6876 ~95% purity
Bovine liver catylase Sigma-Aldrich C9322 >95% purity
Xylanase Hampton Research HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii Sigma-Aldrich T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko Sigma-Aldrich P1512
JCSG-plus HT-96 screen Molecular Dimensions Ltd MD1-40 For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen Molecular Dimensions Ltd MD1-36 For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen Molecular Dimensions Ltd MD1-47 For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system Art Robbins Instruments 602-0001-10
Seed bead kit Hampton Research HR2-320
Binocular stereo microscope Leica M165C
Scalpel blades Sigma-Aldrich S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette Starlab S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette Starlab S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette Starlab S7100-1000
JCSG-plus screen Molecular Dimensions Ltd MD1-37 For screens established by hand
PACT premier screen Molecular Dimensions Ltd MD1-29 For screens established by hand
Morpheus screen Molecular Dimensions Ltd MD1-46 For screens established by hand
Tweezers Sigma-Aldrich T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm Molecular Dimensions Ltd MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes Sigma-Aldrich Z722669
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-360
24 well XRL crystallization tray Molecular Dimensions Limited MD3-11 For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
  2. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  3. Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
  4. Bergfors, T. Seeds to crystals. J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
  5. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
  6. Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
  7. Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
  8. Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
  9. Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
  10. Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
  11. D'Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
  12. Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
  13. Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
  14. Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
  15. Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
  16. Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).

Tags

علم الأحياء الهيكلي، العدد 78، البلورات، الأشعة السينية، الكيمياء الحيوية الظواهر، بنية جزيئية، الجزيئية التشكل، بلورة البروتين، البذر، بنية البروتين
تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Till, M., Robson, A., Byrne, M. J.,… More

Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548, doi:10.3791/50548 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter