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Biology

रैंडम Microseed मैट्रिक्स स्क्रीनिंग द्वारा प्रोटीन crystallization की सफलता की दर में सुधार

Published: August 31, 2013 doi: 10.3791/50548
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2Douglas Instruments

Summary

यहाँ हम यादृच्छिक microseed मैट्रिक्स स्क्रीनिंग के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन. यह तकनीक काफी, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग प्रयोगों की सफलता दर को बढ़ाने के अनुकूलन के लिए की जरूरत को कम, और डेटा संग्रह और ligand-भिगोने प्रयोगों के लिए क्रिस्टल की एक विश्वसनीय आपूर्ति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है.

Abstract

रैंडम microseed मैट्रिक्स स्क्रीनिंग (rMMS) बीज क्रिस्टल यादृच्छिक स्क्रीन करने के लिए जोड़ रहे हैं, जिसमें एक प्रोटीन crystallization तकनीक है. क्रिस्टल एक प्रोटीन के चरण आरेख की metastable क्षेत्र में विकसित होगा कि संभावना में वृद्धि करके, अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण सुराग अक्सर उत्पादित क्रिस्टल की गुणवत्ता वृद्धि हो सकती है, प्राप्त कर रहे हैं, और डेटा संग्रह और भिगोने प्रयोगों के लिए क्रिस्टल का एक अच्छा आपूर्ति प्रदान की जाती है. यहाँ हम हाथ से या 96 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से ट्रे प्रारूप में, तरल से निपटने रोबोटिक्स का उपयोग कर या तो स्थापित बूंद बैठे या फांसी ड्रॉप वाष्प प्रसार प्रयोगों, या तो के लिए लागू किया जा सकता है कि rMMS के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन.

Introduction

Perutz, Kendrew और स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कंसोर्टियम के आधुनिक उच्च throughput स्वचालित पाइपलाइनों को, हीमोग्लोबिन और myoglobin की संरचनाओं के निर्धारण में सह कार्यकर्ताओं द्वारा अपने प्रारंभिक आवेदन से macromolecular एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी हमें प्रोटीन की दुनिया में एक अभूतपूर्व संरचनात्मक झलक चाहता है . इस तकनीक को परमाणु में प्रोटीन संरचना के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट कि सबसे व्यापक रूप से लागू प्रयोगात्मक विधि रहता है, या (यानी 1-3 एक रेंज में) परमाणु प्रस्ताव पास. एक प्रोटीन को लागू करने के लिए एक्स - रे विवर्तन के लिए एक शर्त यह पहला सघन किया जाना चाहिए, और यह विवर्तन तरीके 1, 2 द्वारा संरचना निर्धारण में सबसे बड़ा एकल दर सीमित कदम बनी हुई है कि इस प्रक्रिया के इस चरण में है. हमारे प्रोटीन crystallization की प्रक्रिया की समझ, और क्रिस्टलीकरण स्क्रीन की गुणवत्ता और उपलब्धता में प्रमुख सुधारों में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद,ट्रे, और संबंधित तकनीकों, यह मज़बूती से क्रिस्टलीकरण सफलता 3 की संभावना की भविष्यवाणी करना असंभव बना हुआ है. बायोकेमिकल और biophysical तरीकों रुचि प्रदर्शित की एक प्रोटीन क्रिस्टल nucleation और विकास के लिए अनुकूल लक्षण है, यानी यह अच्छी तरह से मुड़ा हुआ, सजातीय, monodisperse, आदि है कि आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन कोई रास्ता नहीं में इन अंतर्दृष्टि क्रिस्टलीकरण की एक निश्चित कारक प्रदान प्रवृत्ति.

सीडिंग लंबे मौजूदा क्रिस्टल या क्रिस्टलीय पदार्थ 4-7 की संख्या, आकार, और गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए एक व्यावहारिक तरीका हो कथित किया गया है. यह दृष्टिकोण क्रिस्टल nucleation का समर्थन करता है एक शर्त है कि बाद में क्रिस्टल विकास और इसके विपरीत के लिए इष्टतम नहीं हो सकता कि इस तथ्य पर आधारित है. दूसरे के लिए एक शर्त से nucleated सामग्री के हस्तांतरण से, एक,, प्रभावी ढंग से इन प्रक्रियाओं दसगुणा करने के लिए नए, के रूप में अभी तक बेरोज़गार क्रिस्टलीकरण अंतरिक्ष करने के लिए इस प्रकार देने का उपयोग करने का प्रयास हो सकता हैऔर एक परिणाम के रूप में एक स्क्रीनिंग प्रयोग के समग्र सफलता की दर बढ़ रही है. स्थापित तरीकों आम तौर पर उदाहरण के लिए उपयोग कर दिशात्मक दबाव के आवेदन के द्वारा प्राप्त (मैं) macroseeding, एक और 8 के लिए एक शर्त से अपनी संपूर्णता में एक एकल क्रिस्टल का हस्तांतरण, (द्वितीय) लकीर बोने, nucleated सामग्री के हस्तांतरण के लिए दर्ज किया गया है एक नए क्रिस्टलीकरण बूंद 9, और (iii) "शास्त्रीय" microseeding के माध्यम से गलमुच्छा के बाद पारित होने के द्वारा पीछा एक मौजूदा क्रिस्टल, की सतह के लिए एक बिल्ली गलमुच्छा, कटाई से उत्पन्न क्रिस्टल "बीज", के स्थानांतरण कण (या क्रिस्टलीय कुचल बीज 10 झुकेंगे कि उन लोगों के लिए इसी तरह की परिस्थितियों में सामग्री),. उल्लेखनीय है कि इन तरीकों के सभी तीन निश्चित रूप से आधुनिक तरल से निपटने क्रिस्टलीकरण रोबोटिक्स के साथ प्राप्त है क्या की तुलना में, समय लेने वाली और खराब स्केलेबल हैं. इन कारकों धारणा को, कम से कम कुछ स्तर पर, योगदान दिया है कि बीजआईएनजी अन्य दृष्टिकोण फल सहन करने में विफल रहा है जब केवल दौरा किया जा करने के लिए एक विधि है.

रैंडम मैट्रिक्स microseeding (rMMS) उच्च throughput प्रदर्शन और scalability 11-13 के लोगों के साथ पारंपरिक microseeding के लाभों को जोड़ती है कि हाल ही में एक पद्धति नवीनता है. यह दृष्टिकोण एक मानक 96 हालत क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के भीतर प्रत्येक sub-well/coverslip पर / में aliquoted किया जा सकता है जो nucleated क्रिस्टलीय पदार्थ, से उत्पादित बीज स्टॉक की पीढ़ी पर निर्भर करता है. इस विधि दोनों हाथ से या 24 अच्छी तरह से या 96 अच्छी तरह से ट्रे प्रारूप में, तरल से निपटने रोबोटिक्स का उपयोग कर या तो स्थापित ड्रॉप वाष्प प्रसार प्रयोगों, बैठे या फांसी के लिए लागू है. rMMS काफी क्रिस्टलीकरण सफलता की दर में वृद्धि, और अधिक से अधिक विवर्तन गुणवत्ता और मात्रा के 11, 13, 14 के क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रदर्शन किया, और ओ में दृष्टिकोण की crystallographers 'शस्त्रागार में एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व कर दिया गया हैक्रिस्टलीकरण सफलता की दिशा में प्रयास Ngoing. यहाँ हम rMMS के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन है और इस तकनीक के प्रभाव illustrating नमूना डेटा प्रदान करते हैं.

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Protocol

1. सामरिक संबंधी बातें

  1. microseeding प्रयोगों के लिए इस्तेमाल बीज क्रिस्टल के चुनाव को प्रयोग करने के उद्देश्य के आधार पर अलग अलग होंगे. एक परियोजना की शुरुआत में यह क्रिस्टल अनुकूलन के लिए वैकल्पिक शुरू अंक प्रदान कर सकते हैं कि कई क्रिस्टलीकरण हिट खोजने के लिए उपयोगी है. अच्छी गुणवत्ता वाले क्रिस्टल अशांति निम्न या प्रणाली संतुलन के लिए रिटर्न न्यूक्लिएशन जहां क्षेत्र में यानी चरण आरेख, के metastable क्षेत्र में बढ़ने की संभावना है क्योंकि rMMS बहुत क्रिस्टल अनुकूलन के लिए की जरूरत कम कर देता है. इसलिए हम पहले क्रिस्टल (जैसे ही पहली क्रिस्टल बढ़ती बंद के रूप में, और अधिक सही, या) प्राप्त कर रहे हैं के रूप में नियमित तौर पर जैसे ही rMMS का उपयोग कर सुझाव देते हैं.
  2. RMMS के प्रारंभिक दौर के लिए, एक स्टॉक बीज जितना संभव क्रिस्टलीय पदार्थ के साथ किया जाना चाहिए. केवल एक अच्छी तरह से उपलब्ध है, तो क्रिस्टल है कि होता है, या क्रिस्टल छोटे हैं, तो इसके बारे में कई repetitions स्थापित करने के लिए सहायक हो सकता हैक्रिस्टल की आपूर्ति बढ़ाने के लिए (बोने के बिना) मूल मारा. हालांकि, कई अलग हिट प्राप्त कर रहे हैं, तो, बीज क्रिस्टल कई स्थितियों से काटा और एक साथ मिलाया जा सकता है.
  3. चरण जुदाई से बचने के लिए, उच्च नमक परिस्थितियों में उगाया क्रिस्टल उच्च खूंटी परिस्थितियों में उगाया क्रिस्टल से अलग से काटा जाना चाहिए. कई कुओं से क्रिस्टल मिश्रित कर रहे हैं, तो नमक के क्रिस्टल देने के लिए कम संभावना है कि एक जलाशय समाधान बीज निलंबन के लिए चयनित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, फॉस्फेट, सल्फेट, कैल्शियम और मैग्नीशियम की उच्च सांद्रता से बचा जाना चाहिए.
  4. बाद में एक परियोजना में, विवर्तन में सुधार Twinned क्रिस्टल से बचने, और ligands बंधन के लिए उपयुक्त हैं कि क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए अलग इकाई कोशिकाओं के साथ क्रिस्टल देखने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. इस स्तर पर (जैसे सबसे अच्छा टुकड़े कि उन) ही सबसे उपयुक्त क्रिस्टल बीज स्टॉक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Microseeding की कभी कभी दोहराया राउंड जहां केवल "सबसे अच्छा आवश्यक हैं"क्रिस्टल बाद के दौर के लिए बीज स्टॉक बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. यदि संभव हो तो, एक" इस तरह के खूंटी 3000 के रूप में तटस्थ "तेज़ उपन्यास क्रिस्टल संपर्कों को प्रोत्साहित करने और उच्च में अस्थिर हो सकता है कि परिसरों मणिभ में बीज क्रिस्टल निलंबित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए नमक समाधान 12.
  5. एक एकल क्रिस्टलीकरण हालत प्रयोग किया जाता है, जहां शास्त्रीय microseeding प्रयोगों, एक होनहार हालत की और बाद में अनुकूलन के दौरान पहचान निम्नलिखित अक्सर सहायक होते हैं. यह ड्रॉप प्रति क्रिस्टल की वांछित संख्या पाने के लिए बीज स्टॉक कमजोर करने के लिए अक्सर आवश्यक है. (बढ़ती कमजोर पड़ने के बीज कंपनियों के शेयरों की एक श्रृंखला के एक crystallization हालत में जुड़ जाते हैं, जहां) एक "मिश्रित" microseeding प्रयोग बीज के स्टॉक का इष्टतम कमजोर पड़ने खोजने के लिए एक त्वरित तरीका है. इस दृष्टिकोण से नीचे वर्णित है.

2. स्टॉक बीज की तैयारी

  1. एक लेम्प लौ का उपयोग कर एक गिलास पाश्चर पिपेट से एक गोल कांच जांच बनाओ.
    1. यह मुलायम हो जाता है जब तक बीच के पास पिपेट गर्मी, तो जल्दी से लौ से इसे हटाने और समाप्त होता है अलग खींच द्वारा इसे बाहर निकालना. नीचे 0.25 मिमी नीचे एक व्यास को कांच खींचने के लिए निशाना लगाओ.
    2. इसके चारों ओर 0.25 मिमी है और संक्षेप में लौ में टूट अंत डुबकी जहां बिंदु पर कांच तोड़ने. ~ 0.75 मिमी की एक व्यास के अंत पर बनाई है साथ कांच की एक गोलार्द्ध जब तक इस दोहराएँ. यह उचित 0.01-1.0 मिमी पैमाने पर ठोस वस्तुओं के हड़ताली के लिए आकार है और यह एक क्रिस्टलीकरण ट्रे उप अच्छी तरह से या coverslip के प्लास्टिक सतह को नुकसान नहीं करता है के रूप में यह जांच क्रिस्टलीय सामग्री पेराई के लिए उपयोगी है. क्रिस्टल ग्लास और प्लास्टिक के बीच फंस रहे हैं क्योंकि बड़ी जांच (~ 1.0 मिमी) और अधिक प्रभावी ढंग से छोटे क्रिस्टल कुचलने सकता है.
  2. बर्फ पर एक बीज मनका युक्त एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब रखें.
  3. एक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप या क्रिस्टल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर एक पूर्व स्थापित क्रिस्टलीकरण ट्रे का निरीक्षण किया और एक या एक से अधिक एपी का चयनस्टॉक बीज उत्पादन के लिए क्रिस्टलीय पदार्थ फसल जहाँ से ट्रे से कुओं propriate. कोई भी सामग्री ठीक सुइयों, spherulites, microcrystals और अनियमित, खराब गठित क्रिस्टल सहित इस्तेमाल किया जा सकता है. पुराने सामग्री आंशिक रूप से पार से जुड़े होने की संभावना है के रूप में बीज शेयर इस प्रकार बोने प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए इसकी उपयुक्तता को कम करने, जितनी जल्दी हो सके क्रिस्टल बढ़ती रोक के बाद किया जाना चाहिए. किसी भी शक काटा जा क्रिस्टलीय पदार्थ अच्छी तरह से एक यूवी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या इमेजिंग प्रणाली खोलने से पहले उपयोग करते हुए कल्पना की जा सकती है, या क्रिस्टलीय पदार्थ में सीटू एक्स - रे विवर्तन विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है नमक या प्रोटीन है के रूप में मौजूद है ट्रे में. यूवी विकिरण के तहत प्रतिदीप्ति पूर्व दृष्टिकोण प्रोटीन क्रिस्टल का उपयोग करते समय, नमक क्रिस्टल बेरंग दिखाई देगा.
  4. अच्छी तरह से चयनित क्रिस्टलीकरण ट्रे खोलें. 96 अच्छी तरह से चारों ओर ऊपरी प्लास्टिक सील चादर के माध्यम से कट बूंद ट्रे बैठने के लिए USI अच्छी तरह से चयनितएक स्केलपेल ब्लेड एनजी. 24 अच्छी तरह से फांसी बूंद ट्रे के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग coverslip हटा दें. Coverslip उलटें और एक स्थिर स्वच्छ सतह पर जगह है. जलाशय समाधान के 50 μl निकालें और ट्यूब भर बर्फ पर रहता है यह सुनिश्चित करना कि बीज मनका युक्त microcentrifuge ट्यूब इस तरल हस्तांतरण.
  5. अच्छी तरह से एक खुर्दबीन के नीचे जो परिणाम देते हैं, खंड 2.1 में तैयार गिलास जांच का उपयोग, subwell (96 अच्छी तरह से ट्रे) या coverslip (24 अच्छी तरह से ट्रे) बूंदों में क्रिस्टल को कुचलने. छोटे क्रिस्टल अच्छी तरह से कुचलने के लिए कई मिनट लग सकते हैं. यह कदम प्रयोगकर्ता क्रिस्टल वे नमक के क्रिस्टल नहीं कर रहे हैं कि यह भी कुचलने के लिए आसान कर रहे हैं और इसलिए पार से जुड़े नहीं हैं, और जाँच लें कि अनुमति देता है. नमक के क्रिस्टल सुना और वे कुचल कर रहे हैं जब महसूस किया जा सकता है कि एक विशिष्ट क्लिक उत्पादन. क्रिस्टल नवसिखुआ सामग्री प्राप्त करने और इस्तेमाल करने की कोशिश को कुचलने के लिए कठिन और मुश्किल कर रहे हैं.
  6. बीज मनका ट्यूब और टी से जलाशय समाधान के 5 μl निकालेंransfer समकक्ष उप अच्छी तरह से (ड्रॉप प्रयोग बैठे), या coverslip (ड्रॉप प्रयोग फांसी) काटा जा क्रिस्टलीय पदार्थ युक्त करने के लिए. संभव के रूप में उप अच्छी तरह से या coverslip सामग्री के रूप में ज्यादा resuspend को इस तरल ऊपर और नीचे 5-6 बार पिपेट. बीज मनका ट्यूब को निलंबन वापस लौटें और जितना क्रिस्टलीय पदार्थ के रूप में संभव काटा जाता है यह सुनिश्चित करना कि, दो बार अधिक इस चरण को दोहराएँ.
  7. बर्फ पर ट्यूब शांत करने के लिए हर 30 सेकंड रोक, दो मिनट के लिए बीज मनका भंवर.
  8. 4 प्रत्येक चरण में 10 का एक पहलू से जलाशय समाधान में स्टॉक बीज गिराए, एक कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाओ. आमतौर पर, भी कई क्रिस्टल एक undiluted स्टॉक बीज का उपयोग करते समय प्राप्त है, इसलिए अच्छी तरह से प्रति क्रिस्टल की संख्या को नियंत्रित करने के लिए पतला बीज कंपनियों के शेयरों का उपयोग किया जाएगा. बीज की एकाग्रता अधिक से अधिक अधिक क्रिस्टलीकरण हिट प्राप्त हो जाएगा के बाद से rMMS के पहले दौर में, यह बीज शेयर समाधान पतला करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है.
  9. यह तुरंत इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं है, तोately, एक -20 डिग्री सेल्सियस तक बीज स्टॉक निलंबन और पतला बीज शेयर हस्तांतरण, या -80 भंडारण के लिए सेल्सियस फ्रीजर. छोटी मात्रा aliquots, यानी 10-20 μl में इस सामग्री की दुकान, बीज स्टॉक की प्रभावकारिता को कम कर सकते हैं, जो दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र को रोकने के लिए. जमे हुए एक बार की जरूरत है, जब तक बीज शेयरों अनिश्चित काल के लिए रखा जा सकता है.

3. Crystallization ट्रे की स्थापना

  1. क्रिस्टलीकरण सुविधाओं और प्रयोगकर्ता की वरीयताओं की उपलब्धता पर निर्भर करता है, rMMS क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग बैठे ड्रॉप वाष्प प्रसार विधि का उपयोग कर फांसी ड्रॉप वाष्प प्रसार विधि को रोजगार 24 अच्छी तरह से ट्रे, या 96 अच्छी तरह से ट्रे या तो उपयोग किया जा सकता है. RMMS के लिए क्रिस्टलीकरण ट्रे रोबोट की मशीन से निपटने के लिए एक तरल, या दोनों के संयोजन का उपयोग कर, हाथ से या तो स्थापित किया जा सकता है.
  2. हाथ द्वारा स्थापित एक ठेठ rMMS प्रयोग, 1.0 μl प्रोटीन समाधान, 1.0 μl क्रिस्टलीकरण शर्त शामिल है, और होगा0.5 μl स्टॉक बीज. एक crystallization रोबोट का उपयोग कर स्थापित की एक ठेठ प्रयोग, 0.3 μl प्रोटीन समाधान, 0.2 μl क्रिस्टलीकरण हालत, और 0.1 μl बीज शेयर शामिल होंगे.
  3. 24 अच्छी तरह से ड्रॉप ट्रे फांसी में rMMS स्क्रीनिंग प्रदर्शन करने के लिए, सबसे पहले, एक पुस्तिका पिपेट का उपयोग, 4 एक्स 24 अच्छी तरह pregreased क्रिस्टलीकरण की प्रत्येक कुएं में 10 मिलीलीटर एकल ट्यूब प्रारूप में एक 96 अच्छी तरह से हालत क्रिस्टलीकरण स्क्रीन से प्रत्येक हालत के 300 μl हस्तांतरण ट्रे.
    1. दोनों आगे और पीछे सुरक्षात्मक समर्थन स्ट्रिप्स हटा दिया गया है, जिसमें से एक इसी प्लास्टिक coverslip की सतह पर प्रत्येक 300 μl जलाशय से प्रत्येक क्रिस्टलीकरण हालत के स्थानांतरण 1 μl.
    2. प्रत्येक क्रिस्टलीकरण हालत के 1 μl को क्रिस्टल बीज स्टॉक के 0.5 μl द्वारा पीछा प्रोटीन समाधान के 1 μl जोड़ें. तरल की बूंद नीचे का सामना करना पड़ और अच्छी तरह से उपयुक्त ऊपर स्थिति ऐसी है कि प्रत्येक coverslip उलटें.
    3. नीचे की तरफ coverslip पर प्रेस, seali compressingतेल एनजी और एक सुरक्षित मुहर बनाने. एक बार सभी 96 बूँदें स्थापित कर रहे हैं, ट्रे आमतौर पर भंडारण के लिए रेंज 4-18 डिग्री सेल्सियस में, एक मशीन या लगातार तापमान के कमरे में स्थानांतरित किया जाना चाहिए.
  4. 96 अच्छी तरह से ड्रॉप ट्रे सबसे पहले प्रत्येक क्रिस्टलीकरण ट्रे की अच्छी तरह से इसी में गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक प्रारूप में एक 96 अच्छी तरह से हालत क्रिस्टलीकरण स्क्रीन से प्रत्येक शर्त के 20-50 μl हस्तांतरण बैठे में rMMS स्क्रीनिंग प्रदर्शन करने के लिए. इस स्थानांतरण कदम एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग कर एक crystallization रोबोट, या मैनुअल स्थानांतरण द्वारा या तो उपयोग किया जा सकता है.
    1. हाथ से या 3.1 में विस्तृत संस्करणों का उपयोग कर एक रोबोट के साथ बूंदों पर स्थानांतरण जलाशय, प्रोटीन और बीज स्टॉक समाधान. कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रिस्टलीकरण रोबोट बग़ैर संपर्क नहीं है, और एक ऐसी प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर बीज शेयर हस्तांतरण सुझावों या जुड़े ट्यूबिंग वितरण की रुकावट में परिणाम हो सकता है. वितरण के क्रम चर है: कुछ रोबोट एक साथ सभी समाधान बांटना. अगरतो शेयर बीज, जलाशय पहले, फिर प्रोटीन बांटना यह संभव नहीं है.
    2. रोबोट वितरण एक संपर्क एक कुंद सुई के साथ लगे एक कम मात्रा गिलास सिरिंज का उपयोग कर बीज उपलब्ध हस्तांतरण नहीं है. तो हर बूंद में बीज स्टॉक बांटना जलाशय समाधान के माध्यम से इसे पारित करके सुई कुल्ला.
    3. एक पारदर्शी सील शीट का उपयोग ट्रे सील और एक मशीन या भंडारण के लिए लगातार तापमान कमरे के लिए स्थानांतरण.

4. Crystallization ट्रे का निरीक्षण

  1. एक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप या एक क्रिस्टल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग सभी क्रिस्टलीकरण प्रयोगों कल्पना. पूर्व आम तौर पर देखने गहराई अधिक उपयोगकर्ता अधिक से अधिक नियंत्रण और उत्तरार्द्ध से बढ़ाई की डिग्री देता है, लेकिन अधिक समय लगता है.
  2. अनुक्रम में प्रत्येक sub-well/coverslip निरीक्षण करें और क्रिस्टल के गठन का कोई सबूत रिकॉर्ड. प्रयोगों एक बार हर 24 स्थापना के बाद 5 दिनों के लिए मानव संसाधन और निरीक्षण किया जाना चाहिएn बाद में एक बार करने के लिए 4 सप्ताह के लिए हर 7 दिन.
  3. इष्टतम विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल का उत्पादन कर रहे हैं पहले rMMS की कई चक्र अक्सर आवश्यक हैं.

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Representative Results

एक rMMS प्रयोग की (ए) उदाहरण

RMMS स्क्रीनिंग के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए हम मुर्गी अंडे का सफेद लाइसोजाइम (HEWL) और गोजातीय जिगर Catalase (BLC) के क्रिस्टलीकरण के लिए इस पद्धति लागू होता है. इन एंजाइमों खासे crystallizable हैं और संरचना की दृष्टि से अच्छी तरह से लक्ष्य 15, 16 की विशेषता है दोनों. इस तरह दोनों rMMS साथ प्राप्त बढ़ाया क्रिस्टलीकरण सफलता दर को वर्णन करने के लिए जो के साथ उत्कृष्ट परीक्षण विषयों प्रदान करते हैं. Crystallization प्रयोगों 96 अच्छी तरह से तरल से निपटने रोबोटिक्स का उपयोग बूंद ट्रे प्रारूप बैठे में स्थापित किए गए थे. HEWL और बीएलसी के समाधान क्रमशः 100 मिलीग्राम मिलीग्राम / और 20 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम सांद्रता के लिए 20 मिमी Tris-एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 7.5 पीएच, में से प्रत्येक के lyophilized पाउडर भंग करके तैयार किए गए. प्रत्येक प्रोटीन के लिए तीन 96 हालत क्रिस्टलीकरण स्क्रीन इस्तेमाल किया गया, JCSG, संधि और मॉर्फियस. Microseeding बिना क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग जलाशय 50 μl की मात्रा, और 2 μl उपयोग किया गया थाप्रोटीन समाधान के 1 μl और जलाशय समाधान के 1 μl शामिल बूँदें बैठे. छह ट्रे 18 डिग्री सेल्सियस पर एक लगातार तापमान के कमरे में रखे और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग दैनिक निरीक्षण किया गया. क्रिस्टल विकास का कोई सबूत दर्ज की गई थी. पांच दिनों के बाद क्रिस्टलीय पदार्थ के विकास का समर्थन करने के लिए पाया गया था कि प्रत्येक ट्रे से एक भी शर्त का चयन किया गया और स्टॉक बीज उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया. rMMS स्क्रीनिंग प्रोटीन समाधान के 1 μl, जलाशय समाधान के 1 μl और बीज स्टॉक के 0.5 μl शामिल बूँदें बैठे 2.5 μl इस्तेमाल किया गया है कि अपवाद के साथ, गैर rMMS स्क्रीनिंग के लिए के रूप में प्रदर्शन किया गया था. सभी छह rMMS ट्रे 18 डिग्री सेल्सियस पर एक लगातार तापमान कमरे को हस्तांतरित और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग दैनिक निरीक्षण किया गया. पांच दिनों के बाद दोनों प्रोटीन की rMMS ट्रे का निरीक्षण किया गया और क्रिस्टल के साथ बूंदों की संख्या दर्ज की गई थी. चित्रा 1 इस प्रयोग से परिणाम का सार है और मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है. HEWL 4 से 10 गुना के लिएगैर वरीयता प्राप्त ट्रे की तुलना में rMMS इस प्रोटीन को लागू किया गया था, जब मनाया गया, क्रिस्टलीकरण सफलता की दर में वृद्धि हुई है. उल्लेखनीय है बीएलसी के लिए मॉर्फियस स्क्रीन में केवल एक ही शर्त rMMS के इस्तेमाल के बाद पहचान की 55 शर्तों की तुलना में उपज क्रिस्टल पाया गया. इसके अलावा, क्रमशः JCSG और संधि स्क्रीन का उपयोग कर बीएलसी क्रिस्टलीकरण में सफलता दर में 3 और 7 गुना वृद्धि हुई थी. सभी मामलों में और चाहे क्रिस्टलीकरण स्क्रीन का इस्तेमाल किया rMMS स्क्रीनिंग गैर rMMS स्क्रीनिंग से क्रिस्टल का एक काफी बड़ा कुल संख्या झुकेंगे. RMMS स्क्रीनिंग प्रयोगों की पुनरावृत्ति rMMS प्रयोगों के प्रारंभिक दौर जब प्रदर्शन undiluted शेयरों का उपयोग करने की आवश्यकता को मजबूत करने, undiluted स्टॉक बीज इस्तेमाल किया गया था जब की तुलना में काफी कम हिट झुकेंगे एक 1:100 पतला बीज का उपयोग का वर्णन किया. आकार, आकृति विज्ञान, और birefringence द्वारा न्याय के रूप में दोनों प्रोटीन के लिए क्रिस्टल गुणवत्ता में थोड़ा स्पष्ट भिन्नता, वहाँ था. अलग का तुलनात्मक मूल्यांकनपारंपरिक तरीकों स्क्रीनिंग के लिए विरोध के रूप में rMMS का उपयोग कर उत्पन्न क्रिस्टल के अंश गुणवत्ता इस अध्ययन के दायरे से बाहर चला जाता है, तथापि, rMMS और गैर rMMS स्क्रीन से अलग दोनों प्रोटीन की क्रिस्टल की एक सबसेट की सिंक्रोट्रॉन विकिरण का उपयोग प्रारंभिक प्रारंभिक विवर्तन विश्लेषण करने के लिए वहाँ संकेत संकल्प सीमा और मौके प्रोफाइल के आधार पर न्याय के रूप में, विवर्तन गुणवत्ता में थोड़ा बदलाव हो.

बूंद प्रति क्रिस्टल की संख्या के अनुकूलन के (बी) उदाहरण

Microseeding तकनीक नियमित रूप से छोटे क्रिस्टल की झड़ी दे. यह न्यूक्लिएशन के स्तर को कम करने के लिए बीज स्टॉक कमजोर करने के लिए अक्सर इसलिए आवश्यक है. इसके अलावा, यह कभी कभी बोने 5 आदत नहीं है जब rMMS द्वारा पाया गया कि हिट की स्थिति में क्रिस्टल विकसित करने के लिए असंभव हो सकता है. यह इस तरह के मामलों में यह कई बूँदें एक बीज स्टॉक के विभिन्न dilutions के साथ एक ही जलाशय समाधान का उपयोग कर स्थापित कर रहे हैं, जहां "शास्त्रीय" microseeding, उपयोग करने के लिए अक्सर उपयोगी है. इस गचित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में एक, एक "मिश्रित" दृष्टिकोण (पॉल रीचर्ट, मर्क अनुसंधान प्रयोगशालाओं, व्यक्तिगत संचार) का उपयोग कर एक ही थाली पर कई नेतृत्व की स्थिति के लिए योजनाबद्ध तरीके से किया जाए. प्रत्येक पंक्ति की बूंदों में जोड़ा जाता है यहाँ एक या एक से अधिक हिट समाधान (एच 1 - - एच 6) एक बीज स्टॉक का एक अलग कमजोर पड़ने (S9 S1), जबकि एक क्रिस्टलीकरण थाली के कॉलम में तिरस्कृत कर रहे हैं. इसलिए हिट समाधान और पतला स्टॉक बीज के हर संयोजन एक ही थाली पर जांच की जाती है, और कमजोर पड़ने और वर्तमान किसी भी रुझान के उचित स्तर को आसानी से पहचाना जा सकता है.

हम तीन मॉडल प्रोटीन, xylanase, thaumatin और thermolysin के लिए इस मिश्रित microseeding दृष्टिकोण लागू होता है. प्रत्येक प्रोटीन पहले बोने के अभाव में कोई क्रिस्टल देने के लिए दिखाया गया था कि एक क्रिस्टलीकरण शर्त के साथ परीक्षण किया है, लेकिन बोने इस्तेमाल किया गया था जब लगातार क्रिस्टल दिया गया था. xylanase, thaumatin और टी के लिए इस्तेमाल किया क्रिस्टलीकरण की स्थितिhermolysin 2 तालिका में सूचीबद्ध हैं. पता चला के रूप में चार से छह शर्तों प्रत्येक प्रोटीन / स्थिति / बीज स्टॉक संयोजन के दो या तीन या तो repetitions के साथ प्रत्येक प्रोटीन के लिए स्थापित किए गए थे. गिरता 0.3 μl प्रोटीन, 0.29 μl जलाशय समाधान, और 10 NL बीज शेयर शामिल थे. सभी ट्रे एक तरल से निपटने क्रिस्टलीकरण रोबोट का उपयोग कर स्थापित किए गए थे. साफ बीज स्टॉक और उसके छह dilutions के प्रत्येक प्रोटीन के लिए स्थापित किया गया था. अन्य प्रयोगात्मक विवरण पहले से 12 सूचित किया गया है. बूंद प्रति प्राप्त क्रिस्टल की औसत संख्या 3 चित्र में बीज स्टॉक के कमजोर पड़ने के खिलाफ साजिश रची है. इन आंकड़ों क्रिस्टल की संख्या में जोड़ा बीज की संख्या के साथ एक लगभग रैखिक संबंध है कि इस प्रकार दिखा. परीक्षण किया तीन प्रोटीन के लिए, 1:10 -3 01:10 तक -6 dilutions बूंद प्रति 1-10 क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए आवश्यक थे.

तालिका 1. सामग्री की सूची.

प्रोटीन
क्रिस्टलीकरण कॉकटेल ट्रे प्रति स्थापित बूंदों की संख्या
Xylanase (36 मिलीग्राम / एमएल) 2 एम अमोनियम सल्फेट, 0.1 एम Tris-एचसीएल 8.5 पीएच 3
Xylanase (36 मिलीग्राम / एमएल) 30% (w / v) खूंटी 4000, 0.2 एम सोडियम एसीटेट, 0.1 एम Tris-एचसीएल 8.5 पीएच 3
Xylanase (36 मिलीग्राम / एमएल) 4 एम सोडियम formate 3
Xylanase (36 मिलीग्राम / एमएल) 3.5 मीटर अमोनियम सल्फेट, 250 मिमी सोडियम क्लोराइड, 50 मिमी सोडियम / पोटेशियम फॉस्फेट 7.5 पीएच 3
Xylanase (36 मिलीग्राम / एमएल) 1.5 एम पोटेशियम फॉस्फेट 7.0 पीएच 3
Thaumatin (30 मिलीग्राम / एमएल) 30% (w / v) खूंटी 4000, 0.2 एम अमोनियम एसीटेट, 0.1 एम सोडियम साइट्रेट पीएच 5.6 2
20% (w / v) खूंटी 4000, 20% (v / v) 2-propanol, 0.1 एम सोडियम साइट्रेट पीएच 5.6 2
Thaumatin (30 मिलीग्राम / एमएल) 30 (% w / v) खूंटी 8000, 0.2 एम अमोनियम सल्फेट, 0.1 एम सोडियम cacodylate पीएच 6.5 2
Thaumatin (30 मिलीग्राम / एमएल) 20 (% w / v) खूंटी 8000, 0.2 एम मैग्नीशियम एसीटेट, 0.1 एम सोडियम cacodylate पीएच 6.5 2
Thaumatin (30 मिलीग्राम / एमएल) 2 एम अमोनियम सल्फेट, 0.1 एम Tris-एचसीएल 8.5 पीएच 2
Thaumatin (30 मिलीग्राम / एमएल) 1.5 एम लिथियम सल्फेट, 100 मिमी HEPES 7.5 पीएच 2
Thermolysin (15 मिलीग्राम / एमएल) 20.0% (w / v) खूंटी 6000, 100 मिमी साइट्रिक एसिड पीएच 5.0 3
Thermolysin (15 मिलीग्राम / एमएल) 1.26 एम अमोनियम सल्फेट, 200 मिमी लिथियम सल्फेट, 100 मिमी Tris-एचसीएल 8.5 पीएच 3
Thermolysin (15 मिलीग्राम / एमएल) 10% (v / v)एमपीडी, 100 मिमी bicine पीएच 9.0 3
Thermolysin (15 मिलीग्राम / एमएल) 800 मिमी succinic एसिड पीएच 7.0 3

तालिका 2. मिश्रित microseeding प्रयोग में इस्तेमाल प्रोटीन समाधान और crystallization शर्तों.

चित्रा 1
चित्रा 1. (ए) rMMS और गैर rMMS क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग प्रयोगों की तुलना करें. क्रिस्टल विकास का समर्थन स्थितियां हरे रंग में हैं, क्रिस्टल विकास का समर्थन नहीं स्थितियां ग्रे में हैं. बीज स्टॉक पीढ़ी में उपयोग के लिए चयनित स्थितियों गुलाबी में हैं. (मैं) मुर्गी अंडे का सफेद लाइसोजाइम, JCSG, गैर rMMS, (द्वितीय) मुर्गी अंडे का सफेद लाइसोजाइम, JCSG, rMMS, (iii) मुर्गी अंडे का सफेद लाइसोजाइम, संधि, गैर rMMS, (चतुर्थ) मुर्गी के रूप में निम्नानुसार क्रिस्टलीकरण स्क्रीन चिह्नित कर रहे हैं जैसे ग्राम सफेद लाइसोजाइम, संधि, rMMS, (वि) मुर्गी अंडे का सफेद लाइसोजाइम, मॉर्फियस, गैर rMMS, (vi) मुर्गी अंडे का सफेद लाइसोजाइम, मॉर्फियस, rMMS, (सात) गोजातीय जिगर Catalase, JCSG, गैर rMMS, (आठ) गोजातीय जिगर Catalase, JCSG, rMMS, (नौ) गोजातीय जिगर Catalase, संधि, गैर rMMS, (एक्स) गोजातीय जिगर Catalase, संधि, rMMS, (ग्यारहवीं) गोजातीय जिगर Catalase, मॉर्फियस, गैर rMMS, (बारहवीं) गोजातीय जिगर Catalase, मॉर्फियस, rMMS और गैर rMMS क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग का उपयोग क्रिस्टलीकरण सफलता दर के rMMS. (बी) के तुलनात्मक विश्लेषण. HEWL या बीएलसी या तो क्रिस्टल विकास का समर्थन करने के रूप में पहचान क्रिस्टलीकरण स्थितियों की संख्या स्क्रीनिंग rMMS लाल रंग में दिखाए जाते हैं के लिए गैर rMMS HEWL या बीएलसी या तो क्रिस्टल विकास का समर्थन करने के रूप में पहचान क्रिस्टलीकरण स्थितियों की संख्या स्क्रीनिंग के लिए, नीले रंग में दिखाया गया है. डाटा क्रिस्टलीकरण ट्रे 5 दिनों के बाद स्थापना के निरीक्षण पर आधारित हैं.

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चित्रा 2. एक उदाहरण मिश्रित microseeding प्रयोग में एक प्रोटीन के लिए क्रिस्टलीकरण शर्तों और पतला बीज स्टॉक निलंबन का वितरण. पर प्रकाश डाला कॉलम H1-H6 लक्ष्य प्रोटीन क्रिस्टल विकास का समर्थन अलग क्रिस्टलीकरण की स्थिति में होते हैं. पर प्रकाश डाला पंक्तियों S1-S7 एक लक्ष्य प्रोटीन बीज स्टॉक निलंबन के विभिन्न dilutions के होते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. बीज शेयर कमजोर पड़ने और एक मिश्रित microseeding प्रयोग में ड्रॉप प्रति प्राप्त क्रिस्टल की औसत संख्या के बीच संबंध. इस्तेमाल किया तीन प्रोटीन xylanase, thaumatin और thermolysin थे. बूँदें एक तरल से निपटने रोबोट का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से मलेरिया अनुसंधान केंद्र की थाली में स्थापित है, और 0.3 μl प्रोटीन, 0.29 μl जलाशय समाधान, और ताजा एसई के 10 NL शामिल थेशेयर एड. प्रस्तुत आंकड़ों क्रिस्टलीकरण ट्रे 5 दिनों के बाद स्थापना के निरीक्षण पर आधारित हैं.

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Discussion

इस पत्र में हम rMMS प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन किया है. हम इस पद्धति का उपयोग करके दो परीक्षण प्रोटीन क्रिस्टलीकरण सफलता दर में उल्लेखनीय वृद्धि का उपयोग कर दिखा दिया है. RMMS और गैर rMMS तरीकों का उपयोग कर उत्पन्न क्रिस्टल की एक सबसेट की सिंक्रोट्रॉन विकिरण का उपयोग कर विवर्तन विश्लेषण, पिछले लेखकों अच्छी गुणवत्ता क्रिस्टल rMMS प्रयोगों 11 में बढ़ने की संभावना है सूचित किया है कि हालांकि, किसी भी विधि का उपयोग हो क्रिस्टल के बीच विवर्तन गुणवत्ता में थोड़ा बदलाव का पता चला 13. वे मणिभ को असामान्य रूप से आसान कर रहे हैं क्योंकि HEWL और बीएलसी असामान्य परिणाम दिया हो सकता है. हम भी rMMS प्रयोगों में इस्तेमाल क्रिस्टल बीज शेयरों की एकाग्रता के अनुकूलन के महत्व को वर्णन है, और इस विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल की एक इष्टतम संख्या का उत्पादन किया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए कमजोर पड़ने से समायोजित किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है.

rMMS अत्यधिक, एक सरल, उच्च throughput हैपारंपरिक तरीकों स्क्रीनिंग पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि स्केलेबल विधि. प्रयोगों 96 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से ट्रे, में और ड्रॉप प्रारूपों फांसी या बैठे, हाथ से या रोबोट द्वारा स्थापित किया जा सकता है. rMMS की प्रमुख सीमा यह पहली घटना में एक बीज स्टॉक उत्पन्न करने के क्रम में एक लक्ष्य प्रोटीन (या एक मुताबिक़ प्रोटीन की) की क्रिस्टलीय पदार्थ के कुछ फार्म प्राप्त करने पर निर्भर है. यह उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टलीय पदार्थ की जरूरत नहीं है कि, हालांकि ध्यान दिया जाना चाहिए, वास्तव में लेखकों सफलतापूर्वक बीज शेयरों बनाने के लिए microcrystals और अनाकार वेग का इस्तेमाल किया है. rMMS स्क्रीनिंग का उपयोग देशी प्रोटीन के क्रिस्टल के विकास तक ही सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, rMMS अच्छी तरह selenomethione या selenocysteine ​​एवजी वेरिएंट की बढ़ती क्रिस्टल के लिए अनुकूल है. ऐसे मामलों में, देशी प्रोटीन की क्रिस्टल बीज स्टॉक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक क्रिस्टल न्यूक्लिएशन प्रोटोकॉल 1,4 प्रलेखित किया गया है, कोई नहीं के रूप में व्यापक गिरफ्तारी के रूप में लागू कर रहे हैंrMMS के रूप में प्रोटीन की Ange.

RMMS के बाद एक मिश्रित microseeding दृष्टिकोण डेटा संग्रह के लिए क्रिस्टल का उत्पादन करने के क्रम में बोने के स्तर का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस क्रिस्टल की एक बड़ी संख्या अक्सर आवश्यक हैं जहां ligand-भिगोने प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इस दृष्टिकोण एक पूरे क्रिस्टलीकरण स्क्रीन का प्रयोग जल्दी से प्रत्येक अच्छी तरह से क्रिस्टल की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या उपज के साथ, एक पतला बीज स्टॉक के साथ संयोजन में microseeding का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है.

अंत में हम rMMS diffracting क्रिस्टल उनकी प्रारंभिक स्क्रीन से सीधे प्राप्त नहीं कर रहे हैं, जहां सभी मामलों में उनकी दिनचर्या कार्यप्रवाह का एक हिस्सा बनाने के लिए macromolecular क्रिस्टलीकरण में लगे हुए किसी को भी प्रोत्साहित करते हैं.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम बीबीएसआरसी (BB/1006478/1) के हिस्से में वित्त पोषित किया गया. PRR एक रॉयल सोसाइटी यूनिवर्सिटी रिसर्च फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MRC 96 well crystallization trays Molecular Dimensions Ltd MD11-00-100 Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets Molecular Dimensions Ltd MD6-01S
Hen egg white lyzozyme Sigma-Aldrich L6876 ~95% purity
Bovine liver catylase Sigma-Aldrich C9322 >95% purity
Xylanase Hampton Research HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii Sigma-Aldrich T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko Sigma-Aldrich P1512
JCSG-plus HT-96 screen Molecular Dimensions Ltd MD1-40 For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen Molecular Dimensions Ltd MD1-36 For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen Molecular Dimensions Ltd MD1-47 For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system Art Robbins Instruments 602-0001-10
Seed bead kit Hampton Research HR2-320
Binocular stereo microscope Leica M165C
Scalpel blades Sigma-Aldrich S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette Starlab S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette Starlab S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette Starlab S7100-1000
JCSG-plus screen Molecular Dimensions Ltd MD1-37 For screens established by hand
PACT premier screen Molecular Dimensions Ltd MD1-29 For screens established by hand
Morpheus screen Molecular Dimensions Ltd MD1-46 For screens established by hand
Tweezers Sigma-Aldrich T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm Molecular Dimensions Ltd MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes Sigma-Aldrich Z722669
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-360
24 well XRL crystallization tray Molecular Dimensions Limited MD3-11 For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0

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References

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Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548, doi:10.3791/50548 (2013).

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