Summary
Qui si descrive un metodo generale per lo screening matrice microseed casuale. Questa tecnica è indicata per aumentare in modo significativo il tasso di successo di cristallizzazione della proteina esperimenti di screening, ridurre la necessità di ottimizzazione, e di fornire un approvvigionamento affidabile di cristalli per la raccolta di dati ed esperimenti ligando-ammollo.
Abstract
Lo screening matrice microseed casuale (RMM) è una tecnica di cristallizzazione della proteina in cui cristalli di semi vengono aggiunti agli schermi casuali. Aumentando la probabilità che i cristalli crescono nella zona metastabile del diagramma di fase di una proteina, contatti supplementari cristallizzazione si ottengono spesso, la qualità dei cristalli prodotti può essere aumentata, e una buona scorta di cristalli per esperimenti di raccolta dati e da bagno sono forniti. Qui si descrive un metodo generale per RMM che possono essere applicati a entrambi seduti goccia o appesi esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 24-ben 96 pozzetti o.
Introduction
Dalla sua domanda iniziale da Perutz, Kendrew e collaboratori nel determinare le strutture di emoglobina e mioglobina, ai moderni ad alto rendimento condotte automatizzati di genomica strutturale consorzi, macromolecolare cristallografia a raggi X ci ha offerto uno scorcio strutturale senza precedenti nel mondo della proteina . Questa tecnica rimane il metodo sperimentale più ampiamente applicabile che permette la visualizzazione diretta della struttura delle proteine a atomico, o vicino risoluzione atomica (cioè nell'intervallo 1-3 Å). Un prerequisito per diffrazione di raggi X da applicare a una proteina è che deve prima essere cristallizzato, ed è questa fase del processo che resta il solo grande fattore limitante nella determinazione della struttura con metodi di diffrazione 1, 2. Nonostante i significativi progressi nella nostra comprensione del processo di cristallizzazione delle proteine, e notevoli miglioramenti nella qualità e disponibilità di schermi di cristallizzazione,vassoi e tecnologie correlate, resta impossibile prevedere in modo affidabile la probabilità di successo di cristallizzazione 3. Metodi biochimici e biofisici possono essere applicati per valutare se una proteina di interesse display caratteristiche favorevoli per la nucleazione e la crescita di cristallo, cioè è ben piegato, omogenea, monodisperse, ecc, tuttavia, queste intuizioni in alcun modo fornire un predittore definitiva di cristallizzazione propensione.
Seeding è stato a lungo preteso di essere un metodo praticabile per migliorare il numero, le dimensioni e la qualità dei cristalli esistenti o di materiale cristallino 4-7. Questo approccio si basa sul presupposto che una condizione che supporta cristallo nucleazione può non essere ottimale per la successiva crescita di cristalli e viceversa. Trasferendo materiale nucleate da una condizione all'altra, si può tentare di disaccoppiare efficacemente questi processi, dando così l'accesso al nuovo, ancora inesplorate spazio cristallizzazione,e di conseguenza aumentare il tasso di successo di un esperimento di screening. Metodi stabiliti sono stati documentati per (i) macroseeding, il trasferimento di un singolo cristallo in toto da una condizione all'altra 8, (ii) realizzato semina, il trasferimento di materiale nucleati, generalmente ottenuta mediante l'applicazione di pressione direzionale utilizzando ad esempio baffo di un gatto alla superficie di un cristallo esistente, seguita da successivo passaggio del baffo attraverso una nuova cristallizzazione goccia 9, e (iii) microseeding "classico", il trasferimento di cristallo "semi", generati dalla raccolta schiacciato cristalli (o cristallina materiale), in condizioni analoghe a quelle che hanno dato i semi 10. In particolare tutti e tre questi metodi sono molto tempo e poco scalabile, certamente in confronto a ciò che è realizzabile con le moderne di gestione dei liquidi robotica cristallizzazione. Questi fattori hanno contribuito, in qualche modo, almeno, alla percezione che le sementiing è un metodo di essere visitato solo quando altri metodi non sono riusciti a dare i suoi frutti.
Microseeding matrice casuale (RMM) è una innovazione metodologica recente che combina i vantaggi di microseeding tradizionale con quelle di screening ad alto rendimento e scalabilità 11-13. Questo approccio si basa sulla generazione di un archivio di sementi, prodotti a partire da materiale cristallino nucleate, che può essere frazionato in / su ciascun sub-well/coverslip all'interno di uno schermo di cristallizzazione 96-condizione standard. Questo metodo è applicabile sia seduto o appendere esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 96-ben 24 pozzetti o. RMM è stato dimostrato sperimentalmente per aumentare significativamente il tasso di successo di cristallizzazione, e produrre cristalli di una maggiore qualità e quantità 11, 13, 14 di diffrazione, e rappresenta uno strumento innovativo nell'arsenale dei cristallografi 'di approcci in ongoing sforzo verso il successo cristallizzazione. Qui si descrive un metodo generale per RMM e fornire dati di esempio che illustrano l'efficacia di questa tecnica.
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Protocol
1. Considerazioni strategiche
- La scelta di semi-cristalli utilizzato per esperimenti microseeding varierà a seconda dell'obiettivo dell'esperimento. All'inizio di un progetto è utile per trovare diversi colpi di cristallizzazione che possono fornire punti di partenza alternativi per l'ottimizzazione di cristallo. RMM riduce notevolmente la necessità di ottimizzazione cristallo perché i cristalli di buona qualità hanno maggiori probabilità di crescere nella zona metastabile del diagramma di fase, cioè nella regione in cui segue perturbazione o nucleazione il sistema ritorna all'equilibrio. È pertanto consigliabile utilizzare RMM ordinariamente non appena si ottengono i primi cristalli (o, più precisamente, non appena i primi cristalli smettere di crescere).
- Per il primo giro di RMM, uno stock di semi dovrebbe essere fatto con tanto materiale cristallino possibile. Se solo un bene è disponibile che contiene cristalli, o se i cristalli sono piccoli, può essere utile per impostare più ripetizioni delhit originale (senza seeding) per aumentare l'offerta di cristalli. Se, tuttavia, diversi risultati si ottengono diversi, cristalli di semi possono essere raccolte da diverse condizioni e mescolati insieme.
- Per evitare la separazione di fase, cristalli cresciuti in condizioni ad alto sale devono essere raccolte separatamente da cristalli cresciuti in condizioni di alta PEG. Se i cristalli di diversi pozzi sono mescolati, una soluzione serbatoio che è meno probabile che invia cristalli di sale dovrebbe essere selezionato per sospensione sementi. Ad esempio, elevate concentrazioni di fosfato, solfato, calcio e magnesio dovrebbero essere evitati.
- Successivamente in un progetto, può essere importante cercare cristalli con pile unitarie differenti al fine di migliorare la diffrazione, evitare cristalli gemellate, ed ottenere cristalli che sono adatti per ligandi di legame. In questa fase solo i cristalli più adatti (ad esempio quelli che diffrangono meglio) dovrebbe essere usato per fare il brodo seme. A volte ripetuti cicli di microseeding sono tenuti, dove solo la "migliore"I cristalli sono usati per fare il brodo seme per il successivo round. Se possibile, un" precipitante neutrale ", come PEG 3000 deve essere utilizzato per sospendere i cristalli di semi di favorire i contatti cristallo nuovi e cristallizzare complessi che possono essere instabili in alto soluzioni saline-12.
- Esperimenti microseeding classica, in cui viene utilizzato una sola condizione di cristallizzazione, sono spesso utili a seguito della individuazione di una condizione promettente e durante la successiva ottimizzazione. È spesso necessario diluire il porta-seme per ottenere il numero desiderato di cristalli a goccia. Un esperimento "combinatoria" microseeding (dove una serie di ceppi di crescente diluizione sono aggiunti ad una condizione di cristallizzazione) è un metodo rapido per trovare la diluizione ottimale dello stock di sementi. Questo approccio è descritto di seguito.
2. Preparazione del Seme della Fotografico
- Fai una sonda di vetro arrotondato da una pipetta Pasteur di vetro utilizzando una fiamma Bunsen.
- Riscaldare la pipetta vicino al centro finché non diventa morbido, poi rimuovere rapidamente dal fuoco ed estrarlo staccando le estremità. Scopo di tirare il bicchiere di diametro inferiore a 0,25 mm.
- Rompere il vetro nel punto in cui è circa 0,25 mm ed brevemente immergersi fine rotto nella fiamma. Ripeti finchè una semisfera di vetro con un diametro di ~ 0,75 millimetri è formata sull'estremità. Questa sonda è utile per la frantumazione di materiale cristallino come è opportunamente dimensionato per urti con oggetti solidi su scala 0,01-1,0 mm e non danneggia la superficie di plastica di una cristallizzazione vassoio sub-bene o coprioggetto. Sonde più grandi (~ 1,0 millimetri) possono schiacciare i piccoli cristalli in modo più efficace perché i cristalli sono intrappolati tra il vetro e la plastica.
- Mettere una provetta da 1,5 ml contenente un Seed Bead sul ghiaccio.
- Ispezionare un vassoio di cristallizzazione prestabilita utilizzando un microscopio binoculare o sistema di imaging cristallo e selezionare uno o più appropriato pozzi dal vassoio da cui raccolgono materiale cristallino per ceppo generazione. Qualsiasi materiale può essere utilizzato compresi aghi sottili, sferuliti, microcristalli e irregolari, cristalli mal formati. Lo stock di sementi deve essere fatta al più presto possibile dopo i cristalli smettere di crescere, come materiale più vecchio è più probabile che sia parzialmente reticolata, riducendo così la sua idoneità per l'impiego in esperimenti di semina. In caso di dubbi sul fatto che il materiale cristallino per essere raccolto è sale o proteine del pozzo può essere osservata con un microscopio a fluorescenza UV o sistema di imaging prima dell'apertura, o il materiale cristallino può essere sottoposto a in-situ analisi di diffrazione a raggi X nel vassoio. Quando si utilizzano gli ex cristalli proteici approccio sarà fluorescenza sotto irraggiamento UV, cristalli di sale appariranno incolore.
- Aprire bene il vassoio di cristallizzazione selezionato. Per 96 pozzetti seduta vassoi goccia tagliare il foglio superiore di tenuta di plastica intorno al pozzetto selezionato USIng una lama da bisturi. Per i vassoi goccia appesa a 24 pozzetti rimuovere il vetrino con un paio di pinzette. Capovolgere il vetrino e posizionarlo su una superficie pulita stabile. Rimuovere 50 microlitri della soluzione di riserva e trasferire il liquido alla provetta contenente il Seme branello assicurare che il tubo rimane sul ghiaccio durante.
- Schiacciare a fondo i cristalli in subwell (vassoio 96 pozzetti) o coprioggetto (vassoio 24 pozzetti) gocce, utilizzando la sonda vetro preparato in sezione 2.1, visualizzazione dei risultati sotto un microscopio. Piccoli cristalli possono richiedere diversi minuti per schiacciare a fondo. Questo passo permette lo sperimentatore di verificare che i cristalli sono facili da schiacciare e sono quindi non reticolate, e anche che non sono cristalli di sale. I cristalli di sale producono un caratteristico click che può essere ascoltato e sentito quando sono schiacciati. Se i cristalli sono duri e difficili da schiacciare cercare di ottenere e utilizzare materiale fresco.
- Togliere 5 ml di soluzione di serbatoio dal tubo rocaille e transfer al sub-ben equivalente (seduta esperimento goccia), o coprioggetto (appeso esperimento goccia) contenente il materiale cristallino per essere raccolto. Pipettare questo liquido su e giù 5-6 volte per risospendere tanto del contenuto sub pozzetti o coprioggetto possibile. Riportare la sospensione al tubo rocaille e ripetere questo passaggio altre due volte, in modo che materiale cristallino quanto è raccolto il più possibile.
- Agitare la rocaille per due minuti, fermandosi ogni 30 secondi per raffreddare la provetta in ghiaccio.
- Effettuare una serie di diluizioni, diluendo lo stock di semi in soluzione serbatoio di un fattore di 4-10 in ogni fase. In genere, troppi i cristalli si ottengono quando si utilizza un ceppo non diluito, in modo da utilizzare le scorte di sementi diluito per controllare il numero di cristalli per bene. Nel primo turno di RMM, è importante non diluire la soluzione stock di sementi, in quanto maggiore è la concentrazione dei semi si ottengono le più colpi di cristallizzazione.
- Se non deve essere utilizzato immediatamentetamente, trasferire la sospensione madre seme e il seme azione diluito ad una -20 ° C o -80 ° C per una conservazione. Per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento, che possono ridurre l'efficacia dello stock di sementi, conservare il materiale in piccole aliquote di volume, cioè 10-20 ml. Una volta congelate, le scorte di semi possono essere conservati a tempo indeterminato fino a quando necessario.
3. Istituzione di cristallizzazione vassoi
- A seconda della disponibilità di strutture di cristallizzazione e le preferenze dello sperimentatore, lo screening cristallizzazione RMM può essere effettuata sia utilizzando i vassoi da 24 pozzetti che impiegano il metodo di diffusione del vapore goccia appesa o piatti a 96 pozzetti utilizzando il metodo di diffusione del vapore goccia seduta. Vassoi di cristallizzazione per RMM possono essere stabiliti sia a mano, utilizzando un liquido movimentazione dispenser robotizzato, o una combinazione dei due.
- Un esperimento tipico RMM istituito dalla mano comprenderà, 1,0 ml soluzione proteica, 1,0 microlitri condizioni di cristallizzazione, e0,5 microlitri ceppo. Un tipico esperimento impostato utilizzando un robot di cristallizzazione comprenderà, soluzione proteica 0,3 ml, 0,2 ml condizioni di cristallizzazione, e 0,1 microlitri stock di semi.
- Per eseguire lo screening RMM in 24 pozzetti appeso vassoi goccia, in primo luogo, con una pipetta manuale, trasferire 300 ml di ciascuna condizione da 96 pozzetti schermo condizione di cristallizzazione in 10 ml formato singolo tubo in ciascun pozzetto di 4 x 24 pozzetti cristallizzazione pregreased vassoi.
- Trasferire 1 ml di ciascuna condizione cristallizzazione da ciascun serbatoio 300 microlitri sulla superficie di un corrispondente coprioggetto di plastica da cui sono stati rimossi entrambi strisce di protezione protezione anteriori e posteriori.
- Per il 1 ml di ciascuna condizione di cristallizzazione aggiungere 1 ml di soluzione proteica seguiti da 0,5 ml di cristallo ceppo. Invertire ogni coprioggetto tale che la goccia di liquido è rivolta verso il basso e la posizione sopra la appropriata bene.
- Premere verso il basso sul vetrino, comprimendo la sealing grasso e formare una tenuta sicura. Una volta che tutti i 96 gocce sono stabiliti, il vassoio deve essere trasferito in un incubatore o camera a temperatura costante, di solito nell'intervallo 4-18 ° C per una conservazione.
- Per eseguire lo screening RMM in 96 pozzetti seduta vassoi goccia in primo luogo trasferire 20-50 ml di ciascuna condizione da un 96-ben schermo condizione di cristallizzazione in formato profondità del blocco e in ciascun corrispondente pozzetto della piastra di cristallizzazione. Questa fase di trasferimento può essere eseguito utilizzando un robot cristallizzazione o un trasferimento manuale utilizzando una pipetta a 8 canali.
- Soluzioni stock serbatoio Transfer, proteine e sementi verso le gocce a mano o con un robot utilizzando i volumi descritti in 3.1. Alcuni robot cristallizzazione disponibili in commercio non contattare dispense e performante semi di trasferimento di magazzino utilizzando un sistema del genere può causare il blocco di dispensare consigli o tubi associato. L'ordine di erogazione è variabile: alcuni robot dispensare tutte le soluzioni contemporaneamente. Sequesto non è possibile, a meno di proteine, poi serbatoio, poi ceppo.
- Se un contatto erogazione robot non è disponibile di trasmissione i semi utilizzando una siringa di vetro basso volume con ago smussato. Risciacquare l'ago passando attraverso la soluzione serbatoio poi dispensare il brodo seme in ogni goccia.
- Sigillare il vassoio con un foglio di sigillatura trasparente e trasferimento in un'incubatrice o una stanza a temperatura costante per la conservazione.
4. Ispezione di cristallizzazione vassoi
- Visualizza tutti gli esperimenti di cristallizzazione utilizzando sia un microscopio binoculare o un sistema di imaging di cristallo. Che nel primo generalmente all'utente maggiore controllo sulla profondità di vista e il grado di ingrandimento di quest'ultimo, ma richiede più tempo.
- Ispezionare ogni sub-well/coverslip in sequenza e registrare qualsiasi evidenza di formazione di cristalli. Gli esperimenti devono essere controllati una volta ogni 24 ore per 5 giorni successivi stabilimento e lan seguito, una volta ogni 7 giorni per un massimo di 4 settimane.
- Cicli multipli di RMM sono spesso necessari prima di cristalli di qualità ottimale di diffrazione sono prodotti.
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Representative Results
(A) Esempio di un esperimento RMM
Per dimostrare l'efficacia dello screening RMM abbiamo applicato questo metodo per la cristallizzazione di gallina albume lisozima (HEWL) e del fegato bovino catalasi (BLC). Entrambi questi enzimi sono eminentemente cristallizzabile e sono strutturalmente obiettivi 15, 16 ben caratterizzati. Come tale entrambi forniscono ottimi soggetti di prova con cui illustrare il tasso di successo di cristallizzazione maggiore ottenibile con RMM. Esperimenti di cristallizzazione sono stati stabiliti in 96 pozzetti seduta in formato vassoio goccia utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi. Soluzioni di HEWL e BLC sono state prodotte sciogliendo polveri liofilizzate di ciascuno in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5, a concentrazioni finali di 100 mg / ml e 20 mg / ml. Per ciascuna proteina sono stati usati tre schermi di cristallizzazione 96-condizione; JCSG, PACT e Morpheus. Lo screening Cristallizzazione senza microseeding è stata effettuata utilizzando volumi serbatoio di 50 microlitri, e 2 mlseduta gocce comprendenti 1 ml di soluzione proteica e 1 ml di soluzione di riserva. I sei vassoi sono stati immagazzinati in un ambiente a temperatura costante a 18 ° C e controllate ogni giorno utilizzando un microscopio binoculare. Qualsiasi prova di crescita dei cristalli è stato registrato. Dopo cinque giorni una sola condizione da ciascun vassoio che è stato trovato per sostenere la crescita di materiale cristallino è stato selezionato ed utilizzato per le sementi magazzino generazione. lo screening RMM è stata eseguita come per lo screening non RMMS, con l'eccezione che sono stati utilizzati 2,5 microlitri seduta gocce comprendenti 1 ml di soluzione di proteine, 1 ml di soluzione di riserva e 0,5 ml di ceppo. Tutti i sei vassoi RMM sono stati trasferiti in una camera a temperatura costante di 18 ° C e controllate ogni giorno utilizzando un microscopio binoculare. Dopo cinque giorni i vassoi RMM di entrambe le proteine sono state ispezionate ed è stato registrato il numero di gocce di cristalli. Figura 1 riassume i risultati di questo esperimento e fornisce un'analisi quantitativa. Per HEWL un 4 a 10 volteaumento della percentuale di successo di cristallizzazione, rispetto ai vassoi non seminati, è stato osservato quando RMM è stato applicato a questa proteina. In particolare per BLC è stato trovato solo una singola condizione nella schermata Morpheus cedere cristalli rispetto a 55 condizioni individuate a seguito dell'uso di RMM. Inoltre, c'è stato un aumento di 3 e 7 volte nel tasso di successo in BLC cristallizzazione utilizzando rispettivamente JCSG e schermi PACT. In tutti i casi e indipendentemente dalla schermata di cristallizzazione di screening RMM utilizzati ha prodotto una significativamente maggiore numero totale di cristalli che lo screening non-RMM. La ripetizione degli esperimenti di screening RMM descritto utilizzando un seme diluito 1:100 dato risultati significativamente meno rispetto a quando è stato utilizzato il seme azione diluito, rafforzando l'obbligo di utilizzare le scorte non diluiti durante l'esecuzione del primo giro di esperimenti RMM. Per entrambe le proteine c'era poca variazione apparente nella qualità di cristallo, come giudicato per dimensione, morfologia e birifrangenza. Valutazione comparativa della difqualità frazione dei cristalli generati utilizzando RMM in contrasto con i metodi di screening convenzionali va oltre lo scopo di questo studio, tuttavia, l'analisi di diffrazione preliminare iniziale utilizzando radiazione di sincrotrone di un sottoinsieme di cristalli di entrambe le proteine isolate da RMM e schermi non RMM indicato lì a essere piccola variazione nella qualità di diffrazione, come giudicato in base al limite di risoluzione e profilo spot.
(B) Esempio di ottimizzare il numero di cristalli a goccia
Tecniche Microseeding danno regolarmente pioggia di piccoli cristalli. È quindi spesso necessario diluire il porta-seme per ridurre il livello di nucleazione. Inoltre, a volte può essere impossibile far crescere cristalli in condizioni di successo che sono stati trovati da RMM quando semina non viene utilizzato 5. E questi casi è spesso utile usare microseeding "classica", dove alcune gocce vengono impostate utilizzando la stessa soluzione serbatoio con diverse diluizioni di uno stock di semi. Questo cun essere fatto sistematicamente per diverse condizioni di circuito su una singola piastra utilizzando un approccio "combinatorio" (Paul Reichert, Merck Research Laboratories, comunicazione personale), come mostrato nella Figura 2. Qui una o più soluzioni hit (H1 - H6) sono dispensate nelle colonne di una piastra di cristallizzazione, mentre una diversa diluizione di uno stock seme (S1 - S9) viene aggiunta alle gocce di ogni riga. Pertanto, ogni combinazione di soluzioni di successo e di sementi diluiti magazzino sono testati su un singolo piatto, e un adeguato livello di diluizione e tendenze attuali può essere facilmente identificato.
Abbiamo applicato questo approccio microseeding combinatorio di tre proteine modello, xilanasi, taumatina e termolisina. Ogni proteina è stato testato con una condizione di cristallizzazione che era stato precedentemente dimostrato che invia nessun cristalli in assenza di semina, ma ha costantemente cristalli quando è stato utilizzato semina. Le condizioni di cristallizzazione utilizzati per xilanasi, taumatina e thermolysin sono elencati nella Tabella 2. Sono stati istituiti quattro a sei condizioni per ogni proteina con due o tre ripetizioni per ogni combinazione di magazzino proteine / condizione / seme come mostrato. Gocce compresi 0,3 microlitri di proteine, 0,29 ml soluzione serbatoio, e il 10 nl stock di semi. Tutti i vassoi sono stati stabiliti utilizzando una gestione di cristallizzazione robot liquido. Sementi Neat magazzino e sei diluizioni loro sono stati istituiti per ogni proteina. Altri dettagli sperimentali sono stati riportati in precedenza 12. Il numero medio di cristalli ottenuti per goccia è tracciata contro la diluizione dello stock di sementi in Figura 3. Questi dati mostrano che il numero di cristalli segue un rapporto approssimativamente lineare con il numero di semi aggiunti. Per le tre proteine testate, 01:10 -3 a -6 01:10 diluizioni sono stati necessari per ottenere 1-10 cristalli per goccia.
Tabella 1. Elenco dei materiali.
| Cristallizzazione cocktail | Numero di gocce stabiliti per vassoio | |
| Xilanasi (36 mg / ml) | 2 M di solfato di ammonio, 0,1 M Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xilanasi (36 mg / ml) | 30% (w / v) di PEG 4000, 0,2 M di acetato di sodio, 0,1 M Tris-HCl pH 8.5 | 3 |
| Xilanasi (36 mg / ml) | 4 M formiato sodico | 3 |
| Xilanasi (36 mg / ml) | 3,5 M di solfato di ammonio, 250 mM cloruro di sodio, sodio 50 mM / potassio fosfato pH 7,5 | 3 |
| Xilanasi (36 mg / ml) | 1,5 M fosfato di potassio pH 7,0 | 3 |
| Taumatina (30 mg / ml) | 30% (w / v) di PEG 4000, 0,2 M di acetato di ammonio, sodio citrato 0,1 M pH 5,6 | 2 |
| 20% (w / v) di PEG 4000, il 20% (v / v) 2-propanolo, 0,1 M di sodio citrato pH 5.6 | 2 | |
| Taumatina (30 mg / ml) | 30 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M di solfato di ammonio, sodio 0,1 M pH 6,5 cacodilato | 2 |
| Taumatina (30 mg / ml) | 20 (% w / v) PEG 8000, 0,2 M di acetato di magnesio, sodio 0,1 M pH 6,5 cacodilato | 2 |
| Taumatina (30 mg / ml) | 2 M di solfato di ammonio, 0,1 M Tris-HCl pH 8.5 | 2 |
| Taumatina (30 mg / ml) | 1,5 M di litio solfato, 100 mM HEPES pH 7.5 | 2 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 20,0% (w / v) PEG 6000, 100 mM di acido citrico a pH 5.0 | 3 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 1.26 M solfato di ammonio, solfato di litio da 200 mm, 100 mM Tris-HCl pH 8,5 | 3 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 10% (v / v)MPD, 100 mM bicine pH 9,0 | 3 |
| Termolisina (15 mg / ml) | 800 mm acido succinico pH 7.0 | 3 |
Tabella 2. Le soluzioni di proteine e condizioni di cristallizzazione utilizzati nell'esperimento microseeding combinatoria.
Figura 1. (A) Confronto tra RMM e non RMM esperimenti di screening cristallizzazione. Condizioni sostegno della crescita cristalli sono in verde, condizioni che non supportano la crescita dei cristalli sono in grigio. Condizioni selezionato per l'uso in ceppo generazione sono in rosa. Schermi di cristallizzazione sono etichettati come segue (i) uovo di gallina lisozima bianco, JCSG, non RMMS, (ii) uovo di gallina bianca lisozima, JCSG, RMM, (iii) uovo di gallina bianca lisozima, PACT, non RMMS, (iv) la gallina es g lisozima bianco, PACT, RMM, (v) uovo di gallina bianca lisozima, Morpheus, non RMMS, (vi) uovo di gallina bianca lisozima, Morpheus, RMM, (vii) il fegato bovino catalasi, JCSG, non RMMS, (viii) fegato di bovini catalasi, JCSG, RMM, (ix) del fegato bovino catalasi, PACT, non RMMS, (x), fegato bovino catalasi, PACT, RMM, (xi) fegato bovino catalasi, Morpheus, non RMMS, (xii) fegato bovino catalasi, Morpheus, RMM. (B) Analisi comparativa di tasso di successo di cristallizzazione usando RMM e lo screening di cristallizzazione non RMM. Per i non-RMM di screening il numero di condizioni di cristallizzazione individuate come sostenere la crescita cristallina di una HEWL o BLC sono mostrate in blu, per RMM di screening il numero di condizioni di cristallizzazione individuate come sostenere la crescita cristallina di una HEWL o BLC sono mostrati in rosso. I dati si basano sul controllo dei vassoi di cristallizzazione struttura a 5 giorni dopo.
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Figura 2. Distribuzione delle condizioni di cristallizzazione e diluito seme archivi sospensioni per una singola proteina in un esperimento microseeding combinatoria esempio. Colonne evidenziate H1-H6 contengono diverse condizioni di cristallizzazione a sostegno della crescita dei cristalli proteici bersaglio. Righe evidenziate S1-S7 contengono diverse diluizioni di un ceppo di sospensione proteina bersaglio.
Figura 3. Correlazione tra ceppo di diluizione e il numero medio di cristalli ottenuti per goccia in un esperimento microseeding combinatoria. Le tre proteine utilizzate sono state xilanasi, taumatina e termolisina. Gocce stati stabiliti in una piastra a 96 pozzetti MRC utilizzando un robot di manipolazione liquido, e comprendono 0,3 microlitri di proteine, 0,29 microlitri soluzione serbatoio, e 10 nl di sé frescoEd magazzino. I dati presentati sono basati sull'ispezione dei vassoi di cristallizzazione struttura a 5 giorni dopo.
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Discussion
In questo articolo abbiamo descritto un metodo generale per lo screening RMM la cristallizzazione della proteina. Abbiamo dimostrato con due proteine di prova di un aumento significativo nel tasso di successo di cristallizzazione con questo metodo. Analisi di diffrazione con radiazione di sincrotrone di un sottoinsieme di cristalli generati utilizzando RMM e metodi non RMM rivelato piccola variazione nella qualità di diffrazione tra i cristalli coltivati utilizzando entrambi i metodi, anche se gli autori precedenti hanno riportato che i cristalli di buona qualità hanno maggiori probabilità di crescere in RMM esperimenti 11, 13. HEWL e BLC possono aver dato risultati atipici, perché sono particolarmente facili a cristallizzare. Abbiamo anche illustrare l'importanza di ottimizzare la concentrazione delle scorte di sementi di cristallo utilizzati negli esperimenti RMMS, e dimostrare come questo può essere regolata mediante diluizione per garantire che un numero ottimale di cristalli di qualità di diffrazione sono prodotti.
RMM è un semplice, ad alto rendimento, altamentemetodo scalabile che può essere utilizzato per integrare i metodi di screening tradizionali. Gli esperimenti possono essere impostati manualmente o con robot, in 96 pozzetti o vassoi da 24 pozzetti, in impiccagione o seduti formati goccia. Il limite maggiore di RMM è che è affidamento su ottenere qualche forma di materiale cristallino di una proteina bersaglio (o di una proteina omologa) per generare uno stock seme in prima istanza. Occorre notare tuttavia che materiale cristallino di alta qualità non è richiesta, anzi gli autori hanno utilizzato con successo microcristalli e precipitato amorfo per fare scorte di sementi. L'uso di uno screening RMM non si limita alla crescita di cristalli di proteine native. Ad esempio, RMM è adatto per la coltivazione di cristalli di selenomethione o selenocisteina varianti sostituiti. In questi casi, i cristalli della proteina nativa possono essere utilizzati per rendere lo stock seme. Anche se i protocolli di cristallo alternativa di nucleazione sono stati documentati 1,4, nessuno è applicabile a largo arange di proteine come RMM.
Dopo RMMS un approccio microseeding combinatoria può essere utilizzata per ottimizzare il livello di semina per produrre cristalli di raccolta dati. Ciò è particolarmente utile per gli esperimenti ligando-ammollo in cui siano richieste di frequente un gran numero di cristalli. Usando questo approccio un'intera schermata cristallizzazione può essere rapidamente stabilita utilizzando microseeding in combinazione con un ceppo diluito, con ogni pozzetto ottenendo un numero relativamente piccolo di cristalli.
In conclusione, suggeriamo a tutti coloro impegnati nella cristallizzazione macromolecolare per fare RMM una parte del loro flusso di lavoro di routine in tutti i casi in cui i cristalli di diffrazione non sono ottenuti direttamente dai loro schermi iniziali.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla BBSRC (BB/1006478/1). PRR è il destinatario di un Royal Society University Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Ph–nix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
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