Summary
虽然周围神经系统（PNS）能显着损伤后的修复，治理这种现象的细胞和分子机制知之甚少。使用现场，转基因斑马鱼和一个可重复的神经切断术实验，我们可以研究动态神经胶质细胞在神经变性和再生行为。
Abstract
神经系统经常被描述为硬连线的身体组成部分，即使它是相当一致的，刻板的方式对外界刺激的反应的流体器官系统，同时保持令人难以置信的灵活性和可塑性。不同的是中枢神经系统（CNS），周围神经系统（PNS）是能够显著维修，但我们才刚刚开始了解细胞和分子机制，治理这种现象。利用斑马鱼作为模型系统，我们有前所未有的机会，夫妇再生研究在体内成像和基因操纵。是由周围神经轴突周围神经胶质细胞和结缔组织层。髓鞘或无髓鞘的雪旺氏细胞，这是由蜂窝鞘称为神经束膜包裹成一个分册依次的轴突ensheathed通过。受伤之后，成人末梢神经有非凡的能力，雷莫已经受损的轴突碎片和重新受神经支配的目标。要调查PNS中所有的外围神经胶质细胞再生的作用，我们在这里描述使用市售的氮泵浦染料激光axotomize在现场转基因斑马鱼的运动神经轴突横断检测。我们进一步描述的方法对夫妇这些实验时间推移成像的受伤和控制神经。此实验范式可以用来不仅评估的作用，神经胶质细胞发挥神经再生，但也可以是支配神经系统修复的分子机制的阐明平台。
Introduction
斑马鱼已被广泛用于研究发展的神经系统，因为它们的光学透明的，易于转基因，耦合时，允许在活胚胎的动态细胞行为的壮观成像。此外，由于斑马鱼和哺乳动物共享几乎所有的神经系统的形成，在这个模型有机体的细胞和分子信息收集所需的基因直接听上去很像其他脊椎动物物种。虽然令人难以置信的强大的神经发育研究，斑马鱼和其独特的属性有潜力也阐明机制，维护和重建神经系统损伤后。斑马鱼幼虫保持到后期幼体阶段和色素沉着，可以有效地阻止黑色素生成抑制剂或缺乏色素细胞的遗传突变体，无论是使用半透明。因此，使用这种模式生物来研究伤害和regenerat离子在老年动物是可能的，并提供独特的机会，直接调查，重建神经系统的细胞和分子机制。在这篇稿件中，我们将介绍如何以高效率和重复性伤害PNS的斑马鱼幼虫的神经。这伤范式本身的研究不仅变性，而且外周神经胶质细胞和免疫细胞的反应，以及这些种群之间的相互作用，在再生过程中。
PNS的是一个复杂的网络是必要的中枢神经系统（CNS）和皮肤，器官和身体肌肉之间传递信息的运动和感觉神经，使生物体与它的环境交互，和生存。沿着这些神经，末梢神经胶质细胞，包括髓鞘化和非髓鞘的雪旺氏细胞和神经胶质细胞神经束膜，以及结缔组织，包住的轴突，并最终形成成熟的神经。这些神经损伤启动一个过程known Wallerian变性10。这种机制的轴突碎片，免疫招聘，杂物清理和再生是非常刻板和基因调控1。在哺乳动物系统中的先前的研究已经描述的作用的雪旺氏细胞在神经退化和再生的1，2，6，8。固定组织或细胞培养在这些研究中，雪旺氏细胞不仅招募巨噬细胞的损伤部位，以帮助在废墟的间隙，但也有助于髓鞘细胞吞噬自己。虽然这些研究已经非常翔实，我们有前所未有的可视化实时外围轴突损伤体内的胶质反应，并在这些事件中，没有其他的研究调查了不同类之间的关系外周神经胶质细胞。
最近，几个实验室研究Wallerian变性，利用斑马鱼和类似激光介导的轴突损伤，我们在这里描述的是什么
要做到这一点，我们横切6和7天受精后（DPF）幼虫的运动神经和可视化个别胶质人群的反应以及调查这些人群之间的相互作用，一起受伤的轴突。使用双重和三重TRA标签周围的神经胶质细胞，包括雪旺氏细胞和神经胶质细胞神经束膜，以及一个标记为轴突的nsgenic线，可使用市售的激光烧蚀系统组成的氮抽运染料激光器（波长435纳米）连接到一个旋转的圆盘共聚焦系统创建轴突横断。这实验装置，使我们能够想象现场，斑马鱼幼体轴突损伤和他们的关系，伤害特定的外设轴突束和时间推移图像的响应不同的胶质人口彼此。这个协议可以进一步用于建立神经损伤在斑马鱼的不同年龄段，不同的转基因株系或基因突变，以满足不同的科学问题。
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Protocol
1。斑马鱼胚胎的制备和安装消融和实时成像
- 准备股票0.8％的低熔融琼脂糖鸡蛋水。分装成13X 100毫米的一次性文化管和存储在4°C，直到需要。
- 交叉成年斑马鱼含有稳定整合的转基因荧光标记的运动神经元和神经胶质细胞类型的景点。收集斑马鱼胚胎的的蛋水和地方在28.5℃培养箱中培养正确的分期以后3。
- 在受精后约24小时（HPF），去除蛋水，加0.002％，1 - 苯基-2 - 硫脲嘧啶（PTU）蛋水。回到胚胎的孵化器。
- 在24和96 HPF，胚胎筛选存在的荧光解剖范围所需的转基因。将所选择的胚胎在新鲜的的PTU蛋水和返回的孵化器。
- 当幼虫已经达到了6天受精后（DPF）（或所需岁），他们从孵化器中删除选择几个幼虫安装，和他们转移到一个较小的菜。
- 去除水中的从盘，并立即更换PTU约0.02％Tricane在蛋水。允许幼虫坐在麻醉约5分钟。
- 的等分试样放置在烧杯中，用自来水和微波炉的0.8％低熔融琼脂糖，持续30秒，或直到琼脂糖熔化。允许冷却烧杯，直到琼脂糖文化管的触摸感觉不冷不热（不烫手）。
- 选择麻醉幼虫，并将其转移到单层或多层以及35毫米的玻璃底菜。取出所有的水被转移的幼虫，然后立即盖上的幼虫有足够的温暖琼脂糖填补了玻璃底部分的菜，但不能创建一个大圆顶。
- 正如琼脂糖变硬，用解剖针的位置在其一侧的幼虫在底部的菜，然后在它的后面稍稍倾斜的幼虫。当务之急是受伤和随后的成像，安装的幼虫接触玻璃底部的菜。用解剖针直到琼脂糖固化，固定幼虫，幼虫保持在这个位置。
- 一旦琼脂糖完全硬化，慢慢吸取足够的Tricane水（可以是同一Tricane用于麻醉）入菜，完全覆盖琼脂糖和幼虫。
2。激光校准和测试
- 打开所有共聚焦显微镜仪器仪表，相应的二极管激光器，用于激发斑马鱼的转基因，和氮泵浦的染料激光。务必到位“空白”分光镜，激光衰减器是完全开放的，和435 nm的香豆素染料细胞很到位。在计算机上，打开图像处理软件。
- 移动位置和一个63X 1.2NA水的浸泡的目的，适用于一小滴浸泡介质对水目标到目标。一个63X的目标将允许良好的激光消融精度和水，我mmersion允许获得较大的工作距离，这是必要的，当使用6-7单丝旦斑马鱼幼虫。
- 获取一个载玻片与镜像侧用于校准的激光。将滑动，镜面朝下，到显微镜阶段。
- 使用目镜在光照下，找到并专注于镜中的刮痕或腐蚀。明视场光将照耀下的载玻片上，但只能通过镜子的地方已被划伤或腐蚀掉的客观，会导致反光镜通过目镜看黑，版画看起来像斑点或光行。
- 查看和版画集中在电脑屏幕上，使用成像软件。打开控制激光校准和功率设置窗口。设置的脉冲数为“1”，“3”％传输的衰减板。的脉冲数表示激光器将在每个感兴趣区域（RO触发的次数I）和％透光率表示的激光功率。请务必正确的校准设置的63X 1.2NA水浸泡的客观选择。
- 从主工具栏中选择椭圆工具，然后单击计算机屏幕上的图像创建一个单一的圆形ROI。做3次以上，直到有4个圆形的ROI图像随机间隔。
- 有些系统可能包括一个安全功能，不会使激光火，如果目镜的光路是开放的。如果是这样的话，在这个时候，手动关闭光路目镜。
- 消防激光。这将创建4个小现货铜版画，1各通函内的投资回报率。如果激光不火，检查，以确保激光开启并正确连接，关闭光路目镜。如果激光火灾，但没有蚀刻看到，检查，以确保“空白”分光镜到位。如果一切都在发生，提高激光功率和“FRAP”的，直到蚀刻ARê可见。如果大于10的激光功率设置是必要的蚀刻玻璃，这可能表明激光等离子体盒需要更换。
- 如果蚀刻的斑点出现在选定的ROI为中心是必要的，没有校准（请至2.12）。如果这些点不在中心位置，校准设置需要被更新。
- 要校准，点击更新校准设置。激光会启动，会出现影像，包含一个单一的蚀刻点。如果点不出现，取消校准，提高激光功率，并开始重新校准。
- 点击在现场的中心。激光将再次触发，会出现另一个点。点击这一点，并重复这个过程，直到校准完成9点出现在一格的时装。重复步骤2.6-2.9检查校准成功。
- 取出载玻片从显微镜阶段，清洁的目的。打开光路OCULARS，并更换“空白”与“100％馆际互借”分光镜分光镜。
3。使用激光消融时间推移共聚焦成像胶质细胞行为的神经切断术
- 拆除阶段用来装载玻片和更换适合举办35毫米的玻璃底菜的舞台。继续要使用63X 1.2NA水的浸泡的目的。
- 水浸泡中取一小颗的目标，并在舞台上安装的幼虫，将菜。稳定的剪辑菜。
- 使用目镜和广角照明，重点的幼虫和定位运动神经。扫描的神经在10-20 hemisegments和选择运动神经横断。
- 使用成像软件在电脑屏幕上实时取景的神经。选择Z型飞机和未受伤的神经轴突和神经胶质细胞的采集图像。
- 准备时间推移成像设置在成像软件捕捉Z-突起在5-30分钟的间隔中的所有类型的细胞中，根据实验。这是最好的创建时间推移进行消融之前的所有必要设置，所以在启动时间推移，一旦受伤后有没有延迟。
- 删除“100％病”的分光镜和更换的“空白”。关闭光路目镜。
- 返回实时取景的神经。使用适当的荧光通道将横断查看的轴突。
- 使用椭圆工具，创建一个薄的椭圆形消融在该地区的投资回报率，然后再创建所选区域内的投资回报率较小。
- 在控制激光设置的窗口中，设定的脉冲数为“2”，“18”％传输的衰减板。消防所选的感兴趣区域内的激光。如果荧光遗体内的投资回报率，增加激光功率，等待约10秒，并再次发射激光。这样做，直到你达到一个设定，导致fluorescenCE消失内的投资回报率。
- 等待10秒或更长时间，并再次检查烧蚀面积的荧光。当心，投资回报率最初可能出现烧蚀，它实际上是光漂白。如果荧光回报，增加激光功率，并再次发射激光。重复该步骤直至花期内消失的投资回报率，并在10秒内不返回。这是最好的开始与一个较小的激光功率，并增加必要的权力。所需的激光功率可能根据个人显微镜系统，香豆素染料的年龄，样品安装，幼虫的年龄，以及组织的厚度。一旦已建立一种理想的激光功率，此功率设置可能被再次使用，在同一实验中在随后的神经。
- 一旦完成后，开始消融时间推移成像。
- 当时间推移完成后，使用成像软件编译的数据，并创建Z-推算，每个时间点的彩色复合。创建一个QuickTime影片的行为进行分析轴突和神经胶质细胞的同时。
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Representative Results
这里所描述的测定法可用于评估在体内性轴索损伤的神经胶质细胞和其他神经相关的细胞群的响应。 电影1显示了一个例子使用该方法和响应周围的神经胶质细胞的神经损伤。进行该实验的Tg（nkx2.2a：megfp）中，Tg的（OLIG2：红色荧光蛋白），斑马鱼，束膜神经胶质细胞表达EGFP和运动神经元表达胞浆中红色荧光蛋白，对象的膜。沿着延髓投影在一个6 DPF直播的斑马鱼的躯干运动神经损伤，神经随后在这两个EGFP和DsRed渠道，成像时间推移。这使得同步可视化的轴突和神经胶质细胞的行为紧随受伤。
图1显示静止图像的静态时间点取自电影1。虚线椭圆所示，使用激光烧蚀的ROI。一分钟后切断（MPT），消融区缺乏荧光，损伤区测量从近端向远端残端约3.5微米。远端神经残端可经影像学证实成功的横断寻找Wallerian变性的迹象，包括远端的的轴突碎片和快速验放。没有轴突荧光断端沿图1中的120 MPT表示这些轴突的确发生Wallerian变性和横断成功。
进行激光烧蚀实验时，激光功率调整到一个理想的环境是至关重要的。理想的激光功率设置将干净消融神经仅在所选的投资回报率，激光功率设置过低或过高，会产生不理想的结果。 图2a显示了伤害，进行激光功率太低。荧光发射激光后，仍然在ROI内，从而在一个不完整的横断图2b示出了进行，过高的激光功率，从而在一个非常大的消融损伤。
动画1。电机神经切断术和激光共聚焦时间推移成像束膜的胶质细胞的行为。电影示出了躯干运动神经受伤前的，其次是拍摄的图像1的mpt和图像的总数为每10分钟190分钟。伤害进行现场6 DPF TG（nkx2.2a：megfp）; TG（OLIG2：安装前的红色荧光蛋白）斑马鱼幼虫的左侧和顶端背。 点击这里观看电影 。
图1。运动神经切断术和静止图像神经胶质细胞的行为。面板静止图像取自电影1。虚线的椭圆形区域表示被烧蚀的投资回报率，创建一个由虚线表示的横断损伤。箭头指向轴突的荧光，是目前在10 MPT，但不是120 MPT，远端轴突退化。比例尺，10微米。
图2。次优的激光功率设置导致意外的结果。 （a）一个过低的激光功率进行消融意图。虚线椭圆表示所选的投资回报率。 1 MPT，该区已略有光漂白，不横断（箭头），（二）进行激光功率太高消融。虚线椭圆表示所选择的投资回报率。 1 MPT消融的面积远远大于所选定的投资回报率（虚线）。所有图片取自活6 DPF TG（nkx2.2a：megfp）; TG（OLIG2：红色荧光蛋白）斑马鱼幼虫前左和背顶端。比例尺，10微米。
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Discussion
这个实验的设计最关键的步骤是：1）正确安装幼虫损伤和随后的体内成像和2）激光校准和选择正确的电源设置，以创造一个干净的神经切断，结果最小的额外组织损伤。为了帮助确保成功切断后， 在体内成像和随后的分析，无论是单独的玻璃底菜，或在玻璃底菜分隔多个幼虫安装。激光校准后，我们建议测试幼虫上测试不同的电源设置，以确定最佳的参数神经切断。这些设置通常是相当一致的实验之间，但可以改变：1）幼虫不正确安装，2）用于不同年龄的幼虫，3）的激光是不正确的校准，4）的激光需要维护或5的）如果神经都位于前后在非常不同的立场，这将导致组织厚度的差异。最佳的神经切断，将创建一个沿着神经是2和5微米之间，不打扰邻近组织损伤。
任何细胞类型的神经系统损伤的响应分析时，我们建议进行至少2种类型的控制。的第一选择是紧接着还神经损伤的区域，但不触及任何神经组织。这将允许你确定你看到的是细胞反应在一般情况下，由于损坏或损伤轴突。第二控制图像未受伤的神经在相同的鱼，你已经创造了一个伤害。这种类型的控制，消除幼虫，幼虫变异由于分期和成像参数，包括共焦成像，曝光时间等。
在这个协议中，我们描述的场景，创造受伤，过小或过大，我们特别研究。相依丁实验问题，这些类型的伤害，可以用于分析。这种类型的程序的主要限制。将创建的伤害和随后的时间推移成像的目标。幼虫老你使用更长的工作距离目标要求。
我们在这里描述的协议，允许用户创建局灶性神经横断，老熟幼虫沿深神经。我们夫妻俩这一技术在体内 ，时间推移成像，并使用市售的激光消融系统，可重复创建焦点轴突损伤。改变这种技术可以使用不同的转基因株系或突变幼虫重建损伤后的神经系统的机制，以测试不同的假设。
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Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
笔者想感谢Kucenas实验室有价值的讨论和仲裁技术，精湛的技术支持。这项工作得到了基金科学与技术卓越的UVA（巨星）（SK）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
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